徐冬云，黃潭靈，李如凱

（深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518108）

β-地中海貧血是一種單基因遺傳病，主要流行于我國南方地區(qū)，該病在臨床上從無癥狀到輸血依賴均可發(fā)生，表現(xiàn)出較大的差異，并且目前暫無理想的根治方法，可嚴(yán)重影響地區(qū)的出生人口質(zhì)量[1]。胎兒血紅蛋白（HbF）的升高有利于緩解患者的病情，目前部分研究以B細(xì)胞淋巴瘤因子11A（BCL11A）為切入點(diǎn)，利用基因編輯技術(shù)提高HbF含量以緩解患者癥狀[2]。研究顯示，HbF含量與BCL11A基因的單核苷酸多態(tài)性密切相關(guān)，并在不同地區(qū)、種族中表現(xiàn)出一定差異[3]。本研究旨在分析深圳市寶安區(qū)β-地中海貧血患者BCL11A基因rs4671393、rs766432位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與HbF的相關(guān)性，以期為寶安區(qū)β-地中海貧血患者的個性化編輯治療提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月至2021年6月深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院收治的120例β-地中海貧血患者設(shè)為觀察組，另選取同期院內(nèi)100名健康體檢者設(shè)對照組，進(jìn)行回顧性分析。觀察組患者中男性67例，女性53例；年齡22～46歲，平均年齡（37.58±6.46）歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）18～28 kg/m2， 平 均 BMI（23.41±3.26）kg/m2。對照組研究對象中男性54名，女性46名；年齡24～49歲，平均年齡（39.06±5.48）歲；BMI 18～28 kg/m2， 平 均 BMI（22.86±3.54）kg/m2。兩組研究對象一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），組間具有可比性。本研究經(jīng)深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《重型β地中海貧血的診斷和治療指南（2017年版）》[4]中β-地中海貧血的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②血紅蛋白＜60 g/L；③2周以上無羥基脲治療史或輸血史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并多發(fā)性骨髓瘤、遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)增高綜合征等影響HbF的疾病；②合并明確診斷的惡性腫瘤；③合并嚴(yán)重精神或心理疾病無法配合研究。

1.2 研究方法 采集兩組研究對象空腹靜脈外周血2 mL，使用EDTA抗凝的采血管收集，存放于2～4 ℃環(huán)境下。采用法國SEBIA全自動毛細(xì)管電泳儀（深圳市科時達(dá)電子科技有限公司，型號：sebia capillarys 2 flex piercing）及配套試劑對標(biāo)本進(jìn)行血紅蛋白電泳檢測。全血基因組DNA提取，使用基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行操作，將提取的基因組DNA置于-20 ℃冰箱中保存，并檢測DNA濃度和純度，純度在1.6～1.9 μg范圍內(nèi)為合格。采用Primer和OligO 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生物工程有限公司合成，其中rs4671393位點(diǎn)引物序 列 為：5’-GTGTTCGGAGTCCTAAGAGC-3’、5’-TGTCTAAGATGGCTGTCCTGT-3’，退火溫度為60 ℃，產(chǎn)物大小為419 bp；rs766432位點(diǎn)引物序列為：5’-CCTGAAAGACGGCTAGAGTCT-3’、5’-GGCAAATTGAATCCAACTG-3’，退火溫度為54 ℃，產(chǎn)物大小為172 bp。限制性內(nèi)切酶的設(shè)計(jì)與合成：采用DNAssist2.0軟件確定內(nèi)切酶（加拿大Fermentas公司），rs4671393位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶：Eco57I.水浴溫度37 ℃。酶切片段：GG型為419 bp，GA型為419 bp、169 bp、250 bp，AA型 169 bp、250 bp。使用 ABI-9700PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，步驟如下：PCR總反應(yīng)體系為 25 μL，包括 10 μL 的 2×PCR mix，上下游引物各0.5 μL，1 μL DNA模板，并以雙蒸水補(bǔ)足為25 μL。在PCR儀中擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：94 ℃下預(yù)變性5 min，94 ℃下變形45 s，退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)，72 ℃終末延伸7 min。各反應(yīng)體系只控制退火溫度不同。將PCR產(chǎn)物置于4 ℃冰箱中保存，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。BCL11A目的基因rs4671393、rs766432位點(diǎn)多態(tài)性PCR限制性片段長度多態(tài)性分析：取5 μL PCR產(chǎn)物分別加入Fast 10×Buffer緩沖液（ThermoFisher）1 μL，0.5 μL限制性內(nèi)切酶，3.5 μL去離子水，反應(yīng)總體系為10 μL，混合均勻后以1 000 r/min速度離心數(shù)秒，放置于恒溫水浴箱中約16 h，取10 μL酶切好的PCR產(chǎn)物加樣到2.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行凝膠電泳。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序，驗(yàn)證酶切結(jié)果，使用測序儀ABI-PRISM3730儀器（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，型號：PRISM3730）進(jìn)行測序，測序試劑使用Big Dyeterminator v3.1。使用chromas軟件讀出測序結(jié)果后，與Gene Bank參照序列進(jìn)行比較。

1.3 觀察指標(biāo) ①比較兩組研究對象rs4671393、rs766432位點(diǎn)基因型與等位基因頻率。②比較兩組研究對象rs766432位點(diǎn)基因型與等位基因頻率。③分析BCL11A基因rs4671393、rs766432位點(diǎn)不同基因型與HbF的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[例(%)]表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)；采用Spearman檢驗(yàn)分析rs4671393、rs766432位點(diǎn)不同基因型與HbF的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象rs4671393位點(diǎn)基因型與等位基因頻率比較 觀察組研究對象rs4671393位點(diǎn)AA基因型、A等位基因頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組研究對象rs4671393位點(diǎn)基因型與等位基因頻率比較 [例(%)]

2.2 兩組研究對象rs766432位點(diǎn)基因型與等位基因頻率比較 觀察組研究對象rs766432位點(diǎn)CC基因型、C等位基因頻率較高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組研究對象rs766432位點(diǎn)基因型與等位基因頻率比較 [例(%)]

2.3 BCL11A基 因rs4671393、rs766432位 點(diǎn) 不同基因型與HbF的相關(guān)性 經(jīng)Spearman檢驗(yàn)，BCL11A基因rs4671393、rs766432位點(diǎn)與HbF水平呈正相關(guān)（P＜0.05），見表3。

表3 BCL11A基因rs4671393、rs766432位點(diǎn)不同基因型與HbF的相關(guān)性

3 討論

β-地中海貧血根據(jù)疾病嚴(yán)重程度可分為重、中、輕型，該病的癥狀具有較大的變異性，癥狀輕的患者可能與正常人無異，而重型β-地中海貧血由于β基因缺失或突變導(dǎo)致β鏈無法合成或合成不足，需要依賴輸血維持生命[5]。近年有研究顯示，肽鏈間的不平衡狀態(tài)在HbF增加后得到有效改善，重型β-地中海貧血患者的臨床表型也有所減輕，有利于降低患者死亡率[6]。因此，促進(jìn)HbF增加、研究單核苷酸多態(tài)性的功能成為β-地中海貧血相關(guān)研究中的重要問題。由于基因多態(tài)性具有明顯的種族和地域差異，因此在β-地中海貧血多發(fā)的地區(qū)進(jìn)行基因多態(tài)性研究具有重要意義。

BCL11A基因是一種鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄阻遏物，活躍于B淋巴細(xì)胞，在紅細(xì)胞中表達(dá)。BCL11A參與造血腫瘤的產(chǎn)生和正常淋巴細(xì)胞的發(fā)育，此外還是HbF主要的數(shù)量性狀位點(diǎn)。研究顯示，BCL11A基因表達(dá)減少，HbF水平隨之提高，證明BCL11A基因?qū)bF具有負(fù)調(diào)控作用[7]。BCL11A影響HbF水平的主要功能序列位于BCL11A基因第2個內(nèi)含子上rs1427407和rs4671393之間的功能區(qū)。這一區(qū)域中rs4671393位點(diǎn)、rs766432位點(diǎn)的多態(tài)性和HbF的相關(guān)性已在部分研究中證實(shí)，它不影響其編碼，但可能通過組建新的剪切信號對正常轉(zhuǎn)錄造成影響，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，減少BCL11A的基因表達(dá)，提高γ珠蛋白基因表達(dá)，促進(jìn)HbF生成[8]。

本研究顯示，rs4671393位點(diǎn)純合子突變AA基因型有15例，rs766432位點(diǎn)純合子突變CC基因型有37例。其中同時具有這兩個位點(diǎn)的純合突變的有9例；rs4671393位點(diǎn)、rs766432位點(diǎn)雜合突變分別有45例、12例，其中具有兩個位點(diǎn)雜合突變的有8例。本研究對單純rs4671393位點(diǎn)突變、單純rs766432位點(diǎn)突變樣本的基因型和HbF的相關(guān)性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，BCL11A基因rs4671393、rs766432位點(diǎn)與HbF水平具有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.716、0.639，提示BCL11A基因rs4671393位點(diǎn)、rs766432位點(diǎn)的多態(tài)性可在一定程度上對HbF水平造成影響。此外，基因序列中rs4671393位點(diǎn)定位是60，493，816，而基因序列中rs766432位點(diǎn)定位為60，492，835，兩者的位置比較接近，并且兩個位點(diǎn)間高度連鎖不平衡，兩者的基因突變在功能上或許存在某些關(guān)聯(lián)性或協(xié)同作用[9-10]。

綜上，寶安地區(qū)人群存在BCL11A基因的rs4671393位點(diǎn)、rs766432位點(diǎn)多態(tài)性，該地區(qū)β-地中海貧血患者與健康人群的rs4671393位點(diǎn)、rs766432位點(diǎn)基因型、基因頻率都有一定差異，并且rs4671393位點(diǎn)的G-A突變、rs766432位點(diǎn)的A-C突變可能促進(jìn)HbF的合成。