徐冬云，黃潭靈，李如凱

（深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518108）

β-地中海貧血是一種單基因遺傳病，主要流行于我國南方地區(qū)，該病在臨床上從無癥狀到輸血依賴均可發(fā)生，表現(xiàn)出較大的差異，并且目前暫無理想的根治方法，可嚴重影響地區(qū)的出生人口質(zhì)量[1]。胎兒血紅蛋白（HbF）的升高有利于緩解患者的病情，目前部分研究以B細胞淋巴瘤因子11A（BCL11A）為切入點，利用基因編輯技術(shù)提高HbF含量以緩解患者癥狀[2]。研究顯示，HbF含量與BCL11A基因的單核苷酸多態(tài)性密切相關，并在不同地區(qū)、種族中表現(xiàn)出一定差異[3]。本研究旨在分析深圳市寶安區(qū)β-地中海貧血患者BCL11A基因rs4671393、rs766432位點單核苷酸多態(tài)性與HbF的相關性，以期為寶安區(qū)β-地中海貧血患者的個性化編輯治療提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月至2021年6月深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院收治的120例β-地中海貧血患者設為觀察組，另選取同期院內(nèi)100名健康體檢者設對照組，進行回顧性分析。觀察組患者中男性67例，女性53例；年齡22～46歲，平均年齡（37.58±6.46）歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）18～28 kg/m2， 平 均 BMI（23.41±3.26）kg/m2。對照組研究對象中男性54名，女性46名；年齡24～49歲，平均年齡（39.06±5.48）歲；BMI 18～28 kg/m2， 平 均 BMI（22.86±3.54）kg/m2。兩組研究對象一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），組間具有可比性。本研究經(jīng)深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。納入標準：①符合《重型β地中海貧血的診斷和治療指南（2017年版）》[4]中β-地中海貧血的診斷標準；②血紅蛋白＜60 g/L；③2周以上無羥基脲治療史或輸血史。排除標準：①合并多發(fā)性骨髓瘤、遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)增高綜合征等影響HbF的疾病；②合并明確診斷的惡性腫瘤；③合并嚴重精神或心理疾病無法配合研究。

1.2 研究方法 采集兩組研究對象空腹靜脈外周血2 mL，使用EDTA抗凝的采血管收集，存放于2～4 ℃環(huán)境下。采用法國SEBIA全自動毛細管電泳儀（深圳市科時達電子科技有限公司，型號：sebia capillarys 2 flex piercing）及配套試劑對標本進行血紅蛋白電泳檢測。全血基因組DNA提取，使用基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，嚴格按照試劑盒步驟進行操作，將提取的基因組DNA置于-20 ℃冰箱中保存，并檢測DNA濃度和純度，純度在1.6～1.9 μg范圍內(nèi)為合格。采用Primer和OligO 6.0軟件設計引物，由上海生物工程有限公司合成，其中rs4671393位點引物序 列 為：5’-GTGTTCGGAGTCCTAAGAGC-3’、5’-TGTCTAAGATGGCTGTCCTGT-3’，退火溫度為60 ℃，產(chǎn)物大小為419 bp；rs766432位點引物序列為：5’-CCTGAAAGACGGCTAGAGTCT-3’、5’-GGCAAATTGAATCCAACTG-3’，退火溫度為54 ℃，產(chǎn)物大小為172 bp。限制性內(nèi)切酶的設計與合成：采用DNAssist2.0軟件確定內(nèi)切酶（加拿大Fermentas公司），rs4671393位點限制性內(nèi)切酶：Eco57I.水浴溫度37 ℃。酶切片段：GG型為419 bp，GA型為419 bp、169 bp、250 bp，AA型 169 bp、250 bp。使用 ABI-9700PCR擴增儀進行PCR擴增，步驟如下：PCR總反應體系為 25 μL，包括 10 μL 的 2×PCR mix，上下游引物各0.5 μL，1 μL DNA模板，并以雙蒸水補足為25 μL。在PCR儀中擴增，反應條件如下：94 ℃下預變性5 min，94 ℃下變形45 s，退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)，72 ℃終末延伸7 min。各反應體系只控制退火溫度不同。將PCR產(chǎn)物置于4 ℃冰箱中保存，取5 μL PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳。BCL11A目的基因rs4671393、rs766432位點多態(tài)性PCR限制性片段長度多態(tài)性分析：取5 μL PCR產(chǎn)物分別加入Fast 10×Buffer緩沖液（ThermoFisher）1 μL，0.5 μL限制性內(nèi)切酶，3.5 μL去離子水，反應總體系為10 μL，混合均勻后以1 000 r/min速度離心數(shù)秒，放置于恒溫水浴箱中約16 h，取10 μL酶切好的PCR產(chǎn)物加樣到2.5%瓊脂糖凝膠中進行凝膠電泳。PCR擴增產(chǎn)物測序，驗證酶切結(jié)果，使用測序儀ABI-PRISM3730儀器（美國應用生物系統(tǒng)公司，型號：PRISM3730）進行測序，測序試劑使用Big Dyeterminator v3.1。使用chromas軟件讀出測序結(jié)果后，與Gene Bank參照序列進行比較。

1.3 觀察指標 ①比較兩組研究對象rs4671393、rs766432位點基因型與等位基因頻率。②比較兩組研究對象rs766432位點基因型與等位基因頻率。③分析BCL11A基因rs4671393、rs766432位點不同基因型與HbF的相關性。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以[例(%)]表示，組間比較行χ2檢驗；采用Spearman檢驗分析rs4671393、rs766432位點不同基因型與HbF的相關性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象rs4671393位點基因型與等位基因頻率比較 觀察組研究對象rs4671393位點AA基因型、A等位基因頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組研究對象rs4671393位點基因型與等位基因頻率比較 [例(%)]

2.2 兩組研究對象rs766432位點基因型與等位基因頻率比較 觀察組研究對象rs766432位點CC基因型、C等位基因頻率較高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組研究對象rs766432位點基因型與等位基因頻率比較 [例(%)]

2.3 BCL11A基 因rs4671393、rs766432位 點 不同基因型與HbF的相關性 經(jīng)Spearman檢驗，BCL11A基因rs4671393、rs766432位點與HbF水平呈正相關（P＜0.05），見表3。

表3 BCL11A基因rs4671393、rs766432位點不同基因型與HbF的相關性

3 討論

β-地中海貧血根據(jù)疾病嚴重程度可分為重、中、輕型，該病的癥狀具有較大的變異性，癥狀輕的患者可能與正常人無異，而重型β-地中海貧血由于β基因缺失或突變導致β鏈無法合成或合成不足，需要依賴輸血維持生命[5]。近年有研究顯示，肽鏈間的不平衡狀態(tài)在HbF增加后得到有效改善，重型β-地中海貧血患者的臨床表型也有所減輕，有利于降低患者死亡率[6]。因此，促進HbF增加、研究單核苷酸多態(tài)性的功能成為β-地中海貧血相關研究中的重要問題。由于基因多態(tài)性具有明顯的種族和地域差異，因此在β-地中海貧血多發(fā)的地區(qū)進行基因多態(tài)性研究具有重要意義。

BCL11A基因是一種鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄阻遏物，活躍于B淋巴細胞，在紅細胞中表達。BCL11A參與造血腫瘤的產(chǎn)生和正常淋巴細胞的發(fā)育，此外還是HbF主要的數(shù)量性狀位點。研究顯示，BCL11A基因表達減少，HbF水平隨之提高，證明BCL11A基因?qū)bF具有負調(diào)控作用[7]。BCL11A影響HbF水平的主要功能序列位于BCL11A基因第2個內(nèi)含子上rs1427407和rs4671393之間的功能區(qū)。這一區(qū)域中rs4671393位點、rs766432位點的多態(tài)性和HbF的相關性已在部分研究中證實，它不影響其編碼，但可能通過組建新的剪切信號對正常轉(zhuǎn)錄造成影響，從而調(diào)節(jié)基因表達，減少BCL11A的基因表達，提高γ珠蛋白基因表達，促進HbF生成[8]。

本研究顯示，rs4671393位點純合子突變AA基因型有15例，rs766432位點純合子突變CC基因型有37例。其中同時具有這兩個位點的純合突變的有9例；rs4671393位點、rs766432位點雜合突變分別有45例、12例，其中具有兩個位點雜合突變的有8例。本研究對單純rs4671393位點突變、單純rs766432位點突變樣本的基因型和HbF的相關性進行研究，結(jié)果顯示，BCL11A基因rs4671393、rs766432位點與HbF水平具有相關性，相關系數(shù)分別為0.716、0.639，提示BCL11A基因rs4671393位點、rs766432位點的多態(tài)性可在一定程度上對HbF水平造成影響。此外，基因序列中rs4671393位點定位是60，493，816，而基因序列中rs766432位點定位為60，492，835，兩者的位置比較接近，并且兩個位點間高度連鎖不平衡，兩者的基因突變在功能上或許存在某些關聯(lián)性或協(xié)同作用[9-10]。

綜上，寶安地區(qū)人群存在BCL11A基因的rs4671393位點、rs766432位點多態(tài)性，該地區(qū)β-地中海貧血患者與健康人群的rs4671393位點、rs766432位點基因型、基因頻率都有一定差異，并且rs4671393位點的G-A突變、rs766432位點的A-C突變可能促進HbF的合成。