林桐，趙吉春，雷小娟，雷琳，明建,2*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(西南大學(xué) 食品貯藏與物流研究中心，重慶，400715)

食用菌又被稱作蕈，屬于大型真菌，遍布于世界各地，目前全球總產(chǎn)量已超過700萬t[1]。食用菌深受廣大消費者青睞，其獨特風(fēng)味主要由揮發(fā)性和非揮發(fā)性成分組成，揮發(fā)性成分主導(dǎo)嗅覺帶來香氣，非揮發(fā)性成分更偏向于味覺帶來的滋味和口感，而非揮發(fā)性的成分在食用菌本身的風(fēng)味研究以及后續(xù)食品開發(fā)上受到更多關(guān)注[2]。呈味肽在非揮發(fā)性成分中占有一定比例，在食品風(fēng)味中起著重要作用。

呈味肽是一種小分子肽，相對分子質(zhì)量通常在500～1 500 Da。直接為食品提供滋味的特征滋味肽在食用菌中被廣泛研究，包括甜味肽、苦味肽、鮮味肽、濃厚感肽等。研究表明，特定的氨基酸表現(xiàn)出特定的風(fēng)味趨勢，但呈味肽與其等比混合物的風(fēng)味效果并不相同，這表明呈味肽的風(fēng)味特征還取決于其一級結(jié)構(gòu)和氨基酸序列[2-3]。呈味肽已經(jīng)在多種食物中被發(fā)現(xiàn)，食用菌味道鮮美且肽含量豐富，但目前對于食用菌呈味肽的研究還沒有得到足夠的關(guān)注。因此，本文對呈味肽的分類以及食用菌呈味肽來源進行了綜述，并歸納了食用菌呈味肽的呈味機理，以及制備、分離純化、鑒定方法，以期為后期食用菌呈味肽的開發(fā)和利用提供參考。

1 呈味肽分類及食用菌呈味肽來源

1.1 呈味肽分類及結(jié)構(gòu)特點

最常見的呈味肽包括甜味肽、苦味肽、鮮味肽、酸味肽和咸味肽。相比較下，前3種肽對于滋味的貢獻(xiàn)更為直接，所以相關(guān)研究更廣泛。而酸味肽和咸味肽的呈味原理有所爭議，其呈味效果不能確定來自于肽本身或其攜帶的離子[4]。帶給食用菌菌體鮮美滋味的鮮味肽是研究重點(表1)。近年來針對食用菌風(fēng)味的研究出現(xiàn)一種叫做濃厚感肽的呈味肽，它所帶來的滋味區(qū)別于上述的5種口味，濃厚感肽本身沒有固有的味道，卻能使食用菌的口感更加豐富[5]。

表1 食用菌呈味肽Table 1 Flaour peptides of edible mushrooms

1.1.1 甜味肽

甜味肽的甜味與其氨基酸的組成和種類密切相關(guān)。目前已知的幾種甜味氨基酸分別是脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和谷氨酰胺(Gln)[11]。甜味肽的呈味效果還與其一級結(jié)構(gòu)有關(guān)，尤其是氨基和羧基的定位對甜味肽的呈味效果有一定影響[12]。

1.1.2 苦味肽

影響苦味肽呈味效果最主要的原因是它的疏水性殘基[13]。一些特定氨基酸，如精氨酸(Arg)、組氨酸(His)和賴氨酸(Lys)等堿性氨基酸，以及肽的疏水性可以使肽苦味加強，尤其是針對一些小分子肽[14]。大多數(shù)食用菌中的苦味肽含量不高，并不具有味覺活性，但一些有滋補和藥用功能的食用菌，如靈芝等，口感略帶苦澀，而這些苦澀味的來源包含苦味肽，其被認(rèn)定有免疫增強的作用[15]。

1.1.3 咸味肽

咸味肽的呈味效果與其所含氨基酸種類和排序的關(guān)系并不緊密，滋味與氨基的解離程度、是否有相關(guān)離子及離子濃度有關(guān)，陽離子被認(rèn)為有呈味作用，而陰離子主要是輔助功能[16]。

1.1.4 酸味肽

關(guān)于酸味肽的研究報道并不多，但大多數(shù)酸味肽都含有酸性氨基酸谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)，這說明酸味的來源與肽電離后產(chǎn)生的陽離子H+有關(guān)。但是單獨具有酸味的肽并不多，因為酸味肽所含有的酸性氨基酸通常也具有鮮味，所以酸味肽有時被認(rèn)為是鮮味肽的一部分[17]。

1.1.5 鮮味肽

鮮味肽的鏈長在一定程度上影響著其呈味效果，鮮味肽的氨基酸骨架的一般結(jié)構(gòu)式為—O—(C)n—O—，n=3～9，當(dāng)n為4～9時鮮味最強[18]。通過對肽結(jié)構(gòu)和組成的分析發(fā)現(xiàn)，鮮味肽普遍為含有Asp和Glu的親水性寡肽，但這2種氨基酸殘基本身并不具有鮮味，而是它們的鈉鹽會產(chǎn)生鮮味，因此Asp和Glu也被歸為鮮味或谷氨酸鈉樣氨基酸[2,19]。

1.1.6 濃厚感肽

濃厚感區(qū)別于已知的5種基本味道，是一種復(fù)雜的感覺，基本特征包括有厚度、黏稠感和持續(xù)性[20]。濃厚感肽主要可以分為3類，分別是谷氨酰肽、亮氨酸肽和其他無特異性的肽[21]。一些氨基酸的存在也被認(rèn)為對濃厚感有貢獻(xiàn)，如Asp和Gly[5]。

1.2 食用菌呈味肽來源

食用菌因其感官特性、營養(yǎng)價值和藥用價值被視為佳肴，其中消費最多的是雙孢蘑菇，其次是側(cè)耳屬菌。食用菌是新的蛋白質(zhì)來源，其蛋白質(zhì)含量達(dá)到19%～37%(干重)，同時也可制備各種肽，呈味肽便是其中之一[22]。不同的菌株、部位和生長階段都對食用菌子實體中呈味肽的種類和含量有影響[23]。

大多數(shù)食用菌表現(xiàn)出鮮甜的口感，這與其中的鮮味肽和甜味肽有一定關(guān)系。用酶解法提取香菇、平菇、金針菇和山毛菇4種食用菌中的呈味肽，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物含量無顯著差異，但山毛菇能制備出更多的鮮味肽，其次是平菇和香菇，最少的是金針菇[24]。除此之外，食用菌不同部位的呈味肽含量也不相同，對于大多數(shù)食用菌來說，呈味肽在菌蓋中的含量大于菌桿中[9,23]。食用菌的生長周期也影響其呈味肽的含量，不論是香菇還是大褐菇，在生長初期，菌內(nèi)鮮味和甜味肽的含量都是最多的，之后會呈遞減趨勢。但是食用菌的子實體多數(shù)是在成熟期開始采摘，成熟后，食用菌中呈味肽含量趨于平穩(wěn)[23,25]。

自身帶有苦味和酸味的菌類通常被認(rèn)為是有毒的而避免食用，一些藥用菌盡管苦味口感明顯，但仍被認(rèn)為是可食用的。靈芝和云芝等藥用菌所含的疏水性氨基酸比例較大，而已發(fā)現(xiàn)的苦味肽中常含有這些氨基酸，所以苦味肽被認(rèn)為是藥用菌口感苦澀的原因之一[15,26]。還有一些食用菌在酶解等加工過程中會被切割出含有苦味的肽，通常采用掩蓋或選擇性分離的方式脫苦，以達(dá)到品味標(biāo)準(zhǔn)[27]。

目前，關(guān)于食用菌中呈味肽的研究還處在初期，更多的研究集中在食用菌中游離氨基酸的呈味效果。同時，食用菌的滋味特征并不能完全反映食用菌中呈味肽的含量，除了呈味肽和呈味氨基酸之外，還存在其他呈味物質(zhì)，如核苷酸、萜類和多糖等。所以針對食用菌呈味肽的研究應(yīng)深入到其結(jié)構(gòu)與滋味的表征關(guān)系。

2 制備食用菌呈味肽

食用菌因其良好的風(fēng)味和豐富的蛋白質(zhì)含量而受到關(guān)注，也是目前呈味肽來源研究的重點。消費者和商家主要關(guān)注食用菌的鮮味和濃厚感，所以食用菌鮮味肽和濃厚感肽的制備、分離純化和鑒定的研究具有重要意義。制備食用菌呈味肽的一般流程如圖1所示。

圖1 制備食用菌呈味肽的一般流程圖[5,9,28-29]Fig.1 General flowchart for the preparation of mushroom peptides[5,9,28-29]

2.1 制備食用菌呈味肽

制備食用菌中肽的方法主要有2種：制備食用菌水溶液提取物，然后直接獲得內(nèi)源性肽；利用外源酶的水解作用，從分離的食用菌蛋白質(zhì)中釋放肽片段[28]。

食用菌內(nèi)源性呈味肽是食用菌生長過程中分泌出的肽[28]。在對華美牛肝菌中呈味肽提取鑒定的實驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水料比為4∶1(mL∶g)，提取溫度45 ℃，4 ℃、2 000×g離心30 min，可得到溶出度最佳的呈味肽[30]。在食用菌呈味肽提取過程中，高壓蒸煮是常見的預(yù)處理方式，這與食用菌食用前的烹飪操作一致，高壓可以幫助菌類蛋白質(zhì)釋放肽, 制備出更多小于500 Da的肽組分[7]。其他預(yù)處理方式對呈味肽提取同樣有效，沈健等[31]采用加熱、均質(zhì)、超聲波和微波4種方法對香菇粉進行破壁處理，發(fā)現(xiàn)超聲波處理后可以得到更多的鮮味肽。

酶水解具有條件溫和、副產(chǎn)物少等優(yōu)點，但由于酶具有專一性，且酶解過程中可能會產(chǎn)生一些不良風(fēng)味，所以選擇合適的蛋白酶以及反應(yīng)條件十分關(guān)鍵。KONG等[8]對比了中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、食用菌蛋白酶、纖維素酶等11種酶，發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶對呈味蛋白的酶解效果最佳，可以從香菇中制備出更多呈味肽。菠蘿莖蛋白酶對谷氨酸和天冬氨酸有切割偏好，更適合釋放鮮味肽[24]。而相較于堿性蛋白酶，酸性蛋白酶水解蛋白后，可以留下更多疏水性氨基酸殘基，更適合釋放苦味肽[32]。除此之外，采用纖維素酶和風(fēng)味蛋白酶分步操作可以制備出更多的草菇呈味肽[7]。對于不同的食用菌，不同酶或酶的組合效果不同。因此，篩選合適的酶仍然是制備呈味肽的第一步。

2.2 分離純化食用菌呈味肽

通常蛋白水解物純化的第一步是采用超濾(ultra filtration， UF)技術(shù)。由于食用菌鮮味肽的分子質(zhì)量通常在3 kDa以下，李曉明等[6]選取了截留分子質(zhì)量為3 kDa的UF離心管，獲得了所需要的白玉菇鮮味肽樣本。盡管這種技術(shù)可以顯著提高分離呈味肽的效率，但是很難獲得高純度的產(chǎn)品，因此UF處理后，產(chǎn)品還要進一步純化。

食用菌呈味肽的純化會聯(lián)合凝膠過濾色譜(gel filtration chromatography， GFC)和反相高效液相色譜(reerse phase-HPLC, RP-HPLC)。GFC根據(jù)所選凝膠對混合物中各分子質(zhì)量不同組分的阻滯作用不同進行分離，其具有適用性廣、分離速度較快的優(yōu)點，但是不易分離分子質(zhì)量接近的肽；而RP-HPLC基于肽混合物和固定相之間疏水性不同的分離原理，它的穩(wěn)定性好、分離效率高，但受環(huán)境因素影響很大，且更適用于分子質(zhì)量小的肽[33]。梁佳明等[9]和FENG等[5]都通過聯(lián)合GFC和RP-HPLC技術(shù)，分別從紅蔥牛肝菌和雙孢蘑菇中提取出純化的呈味肽。

2.3 鑒定食用菌呈味肽

由于質(zhì)譜法具有高效、靈敏和重現(xiàn)性好的優(yōu)點，不僅可以檢測出肽的分子質(zhì)量，還可以確定肽的一級結(jié)構(gòu)，已經(jīng)被廣泛用于肽序列的鑒定。質(zhì)譜的原理是將多肽轟擊成離子碎片，然后根據(jù)各碎片質(zhì)荷比的不同進行分類和分析[33]。在對食用菌呈味肽的結(jié)構(gòu)序列進行鑒定分析時，常常將液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合應(yīng)用，通過結(jié)合液相質(zhì)譜的分離能力和質(zhì)譜的分組分離能力，根據(jù)最終肽的結(jié)構(gòu)特點和所含氨基酸殘基判斷其所屬的風(fēng)味[6-7,9]。

目前食用菌呈味肽的呈味功能與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系尚不明確，所以通常在進行了質(zhì)譜分析之后，還會進行感官評測，對食用菌呈味肽的具體風(fēng)味進行確定，常用的2種方法是志愿者感官測評和電子舌。志愿者感官測評已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類食品。FENG等[5]采用志愿者感官評測最終確定了從雙孢蘑菇中制備的2種肽符合濃厚感肽的味道特性[5]。此法來鑒定食用菌呈味肽十分直接，但是大量的數(shù)據(jù)以及志愿者的不恰當(dāng)描述會導(dǎo)致結(jié)果有所誤差。電子舌是一種味道傳感器，它通過化學(xué)傳感器矩陣和統(tǒng)計數(shù)據(jù)處理來模擬人類的感知，計算出的結(jié)果更精確。在對食用菌鮮味成分的感官分析中發(fā)現(xiàn)，電子舌的結(jié)果與人類感覺評價的結(jié)果顯著相關(guān)[29,34]。盡管如此，人體對于味道的感知受體和途徑并未完全了解，電子舌也不能夠完全代替人體感官評測，大多數(shù)時候還需要兩者結(jié)合來對食用菌呈味肽的風(fēng)味進行鑒定。

3 食用菌呈味肽呈味機理

味蕾是味覺的外圍器官，由位于舌頭上的柱狀感覺細(xì)胞簇組成。味覺物質(zhì)的分子識別發(fā)生在味蕾頂端的味覺感受器細(xì)胞，處于這里的受體賦予味覺刺激特異性，然后通過味覺神經(jīng)傳遞，最終由大腦的味覺中樞表達(dá)[35]。哺乳動物常見的味覺感受器細(xì)胞有4種，分別是暗細(xì)胞(Type Ⅰ)、亮細(xì)胞(Type Ⅱ)、中間細(xì)胞(Type Ⅲ)和基細(xì)胞(Type I)，不同的細(xì)胞有不同的功能。暗細(xì)胞的占比最大，它與蛋白質(zhì)和酶的轉(zhuǎn)運有一定關(guān)系；亮細(xì)胞是最主要的味覺識別傳導(dǎo)的細(xì)胞，它可以表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors, GPCRs)，包含2種味覺受體，即1型味覺受體(type 1 receptor,T1R)和2型味覺受體(type 2 receptor,T2R)；中間細(xì)胞具有超微結(jié)構(gòu)可識別的突觸；基細(xì)胞屬于增殖干細(xì)胞，可以分化出其他味覺細(xì)胞[36]。

如表2所示，食用菌呈味肽的呈味機理除了與受體特異性結(jié)合有關(guān)之外，還與氨基酸解離程度以及所含特殊陽離子、陰離子有關(guān)，且不同類型的呈味肽的呈味機理也有所不同。

表2 不同呈味肽的特征及其所對應(yīng)的受體Table 2 Receptors and characteristics of different flaour peptides

甜味肽的受體被定義為C類GPCR，以T1R2和T1R3亞基的異源二聚體形式存在。根據(jù)夏倫貝爾的AH/B生甜學(xué)說，甜味肽的分子結(jié)構(gòu)中有一個能形成氫鍵的基團—AH(如—NH2)和一個電負(fù)性的基團—B(如—COOH)，—B與—AH之間的距離大約在0.23～0.4 nm。同時甜味受體T1R2+T1R3也有一個類似的AH-B結(jié)構(gòu)單元。甜味肽的AH-B結(jié)構(gòu)單元與受體的AH-B結(jié)構(gòu)單元結(jié)合后，會刺激味覺神經(jīng)，從而產(chǎn)生甜的感覺[12]。除此之外，甜味肽的呈味效果還與所帶電荷和親疏水基團有關(guān)。當(dāng)去除帶負(fù)電荷的殘基后，甜味會提高；反之去除帶正電荷的殘基后，甜味會下降。這可能是因為甜味受體上存在著帶負(fù)電荷的基團，可以與肽的正電荷側(cè)鏈形成鹽橋[37]。同時，疏水基團會因為掩蓋了受體的結(jié)合位點而使甜味下降[38]。

目前已知的苦味肽受體T2R有25種以上[39]?？辔峨牡氖杷詫辔兜某尸F(xiàn)十分關(guān)鍵，它的疏水性主要由肽鏈中的氨基酸種類和序列決定，其中疏水氨基酸可以有效增強肽的疏水性來影響肽與受體的結(jié)合[40]。苦味肽被認(rèn)為像“鉤子”一樣附著在T2R受體上，從而將分子的疏水部分帶入受體細(xì)胞表面的網(wǎng)狀結(jié)合位點，之后形成受體-配體復(fù)合物來表達(dá)苦味[46-47]。藥用食用菌的苦味很明顯，除了一切常見的苦味物質(zhì)外(如萜類)，疏水氨基酸的占比也很高，尤其是云芝，苦味氨基酸的含量高達(dá)8.42 mg/g(干重)[26]。

T1R1+T1R3異源二聚體是最早被認(rèn)定的鮮味為受體，之后發(fā)現(xiàn)味蕾上還有2個親代謝型Glu受體mGluR4和mGluR1[36]。當(dāng)鮮味肽具有帶負(fù)電、帶正電和疏水性的基團，且被鮮味受體N末端的捕蠅草結(jié)構(gòu)域(enus flytrap domain,FTD)識別，才能呈現(xiàn)出鮮味[41-42,48]。紅蔥牛肝菌中提取的鮮味肽Phe-Lys-Asp-Leu-Gly-Glu-Glu-Asn-Phe-Lys，前2個氨基酸殘基(Phe-Lys)可以看作帶正電荷的基團；中間5個氨基酸殘基(Asp-Leu-Gly-Glu-Glu)可以看作帶負(fù)電荷的基團；而末端3個氨基酸(Asn-Phe-Lys)可以看作弱疏水性的基團，其結(jié)構(gòu)符合鮮味肽的特征[9]。

咸味肽呈味的關(guān)鍵是其電離出的陽離子，因為陽離子易吸附到細(xì)胞膜上的磷酸基上，隨后陽離子會經(jīng)過細(xì)胞膜上的鈉離子通道(epithelial Na+channel ENaC)，繼而使Ca2+富集，細(xì)胞去極化，最后釋放信號傳遞至大腦使之產(chǎn)生咸味感覺。但要解釋人體對咸味的敏感性，還存在如瞬時受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential anilloid 1,TRP1)的通道[49-50,43]。

中間細(xì)胞可以識別酸味肽，而離子通道是酸味的傳遞者，其中瞬時受體電位陽離子通道(transient receptor potential cation channel, TRP)超家族的多囊腎病樣PKD1L3和PKD2L1是酸味肽的重要傳感器[44]。H+是一個重要的酸味信號傳導(dǎo)工具，所以酸味肽主要依靠酸性氨基酸殘基電離出的H+滲透到中間細(xì)胞，然后通過信號傳導(dǎo)，最終產(chǎn)生酸味[36]。

目前被認(rèn)為是濃厚感肽受體的鈣敏感受體(calcium-sensing receptor, CaSR)存在于舌后部[45]。CaSR的激活劑主要是一些親水性的物質(zhì)，由濃厚感肽激活CaSR的研究主要集中在γ-谷氨酰肽上。γ-谷氨酰肽與CaSR的胞外FTD結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞去極化，釋放的ATP通過刺激味覺傳入神經(jīng)上的ATP受體產(chǎn)生濃厚感的信號[20,44]。但CaSR似乎還與T2R共表達(dá)，且對鮮味也有一定潛在識別作用，所以CaSR是否對濃厚感的識別具有專一性還需進一步研究[21]。味覺受體示意圖如圖2所示。

圖2 味覺受體示意圖[20,36,43-44]Fig.2 Schematic diagram of taste receptors[20,36,43-44] 注：PLC-磷脂酶；IP3-三磷酸；cAMP-環(huán)磷酸腺苷

4 結(jié)論

呈味肽包括甜味肽、鮮味肽、苦味肽、咸味肽、酸味肽和濃厚感肽。它們的呈味效果與其所含的特定氨基酸殘基、親疏水性和陰陽離子有關(guān)，但具體定性定量的關(guān)系還未明晰，仍然在發(fā)掘階段。對于呈味肽呈味的機制，目前已經(jīng)找到基礎(chǔ)的受體，但環(huán)境對呈味肽呈味效果的影響以及受體與呈味肽特殊結(jié)構(gòu)之間的識別方式尚未研究，導(dǎo)致不少呈味肽的結(jié)構(gòu)與其呈味機理并不完全相符。

食用菌富含高質(zhì)量的蛋白質(zhì)，且多數(shù)味道鮮美，是呈味肽的來源之一。目前，針對食用菌的呈味肽研究僅集中在鮮味肽，對于其他呈味肽的研究甚少，且缺少不同種類食用菌之間呈味肽含量和種類的對比，以及各種食用菌呈味肽提取方法之間的比較。食用菌呈味肽可能成為今后的熱點，還應(yīng)該進行更深入的研究。