于翠翠,張文會,陳 鋒
(西藏自治區(qū)農牧科學院農產品開發(fā)與食品科學研究所,西藏 拉薩 850000)
西藏蕪菁(Brassica rapa) 是十字花科(Cruciferae) 蕓苔屬 (Brassica) 二年生草本植物[1],是藏區(qū)特有的高寒低氧的惡劣環(huán)境下孕育出來的藥、食、飼三用植物[2]。藏醫(yī)學名著《四部醫(yī)典》記載,蕪菁具有味甘性溫、清熱解毒、滋補、增氧的功能[3]。藏醫(yī)使用時常將其根洗凈、切片、煎煮濃縮成膏狀入藥作為抗缺氧的食物。《四川省藏藥材標準》記載蕪菁塊莖中含有豐富的蛋白質、糖類、酸類、礦物質、維生素等[4]?,F(xiàn)代研究表明,蕪菁功能性組分主要含有多糖類[5]、皂苷類[6]、黃酮[7]、三萜類[8]及有機酸等;具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗疲勞及耐缺氧等功效,為開發(fā)蕪菁保健食品提供了理論依據(jù)[9]。主要探究3 種提取方法下蕪菁中總黃酮、總皂苷及三萜類物質含量變化及其抗氧化能力,為后續(xù)蕪菁開發(fā)利用提供理論基礎。
蕪菁粉,采摘西藏自治區(qū)拉薩市;薯蕷皂苷標準品,上海源葉生物科技有限公司提供;蘆丁標準品,國藥集團化學試劑有限公司提供;齊墩果酸標準品,上海安普實驗科技股份有限公司提供;DPPH,梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司提供;總抗氧化能力(T-AOC) 試劑盒,南京建成生物研究所提供;無水乙醇、纖維素酶、果膠酶、蛋白酶;亞硝酸鈉、氯化鋁、香草醛、高氯酸、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫等,均為國產分析純。
恒溫水浴鍋,常州國語儀器制造有限公司產品;酶標儀,北京凱奧科技發(fā)展有限公司產品;超聲波清洗機,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司產品;電熱恒溫鼓風干燥箱,上海齊欣科學儀器有限公司產品;紫外分光光度計,上海欣茂儀器有限公司產品。
1.3.1 樣品制備
芫菁根經清洗、除雜后切片烘干,粉碎過80 目篩,按照下述方法進行提取。
1.3.2 提取方法
①水提法:準確稱取蕪菁干粉5 g,按1∶30 料液比加入純水,在50 ℃條件下提取5 h;②超聲-醇提法:準確稱取蕪菁干粉5 g,按1∶30 料液比加入70%乙醇,在超聲400 W 條件下65 ℃提取30 min;③酶法:準確稱取蕪菁干粉5 g,按1∶30 液料比加入純水,加入由纖維素酶、果膠酶(質量比2∶1),酶添加量為2%,調節(jié)pH 值為7 后在50 ℃條件下提取3 h;全部提取液經過濾紙除雜后備用。
1.3.3 蕪菁提取液活性物質含量測定
(1) 總黃酮含量測定[10]。準確稱取蘆丁標準品1 mg,置于10 mL 容量瓶中,加乙醇定容至刻度線,得質量濃度0.1 mg/mL 的蘆丁標準液。精確吸取標準品 0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mL 于 10 mL 離心管中,加入5%亞硝酸鈉0.15 mL 混勻放置6 min,加入10%硝酸鋁0.15 mL 混勻放置6 min,最后加入4%氫氧化鈉2 mL,用乙醇定容至5 mL,在波長510 nm下測定吸光度(OD51)0[11]。以蘆丁質量為橫坐標(X),以OD510為縱坐標(A),繪制標準曲線,得回歸方程為A=6.308 6X+0.006 3,R2=0.997 3;標準曲線在蘆丁質量為0.05~0.25 mg 范圍內線性關系良好。
取2 mL 蕪菁提取液,取按照蘆丁標準曲線測定方法測定黃酮類質量濃度,計算黃酮質量濃度,并根據(jù)以下公式計算黃酮得率,重復3 次計算平均值。
式中:C——根據(jù)標準曲線計算出反應液的黃酮質量濃度,mg/mL;
V——反應液體積;
V2——提取液總體積,mL;
V1——待測液移取的體積,mL;
M——稱取的蕪菁質量,g。
(2) 總皂苷質量濃度測定[12]。準確稱取薯蕷皂苷標準品10 mg,置于25 mL 容量瓶中,加甲醇定容至刻度線,得質量濃度0.4 mg/mL 的薯蕷皂苷標準液。精確吸取標準品0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.10 mL于1.5 mL 離心管中,水浴65 ℃揮干溶劑后;加入質量分數(shù)5%香草醛冰醋酸(新鮮配制) 0.04 mL 和高氯酸0.16 mL,于65 ℃水浴中加熱15 min,冷卻后加冰醋酸0.5 mL,于波長540 nm處測定吸光度(OD54)0[11]。以薯蕷皂苷質量為橫坐標(X),以OD540為縱坐標(A),繪制標準曲線,得回歸方程為A=7.759 1X,R2=0.997 5;標準曲線在薯蕷皂苷質量為0.008~0.040 mg 范圍內線性關系良好。取蕪菁提取液1 mL用無水乙醇稀釋至15 mL,取稀釋后液體0.1 mL 取按照薯蕷皂苷標準曲線測定方法測定皂苷含量,計算皂苷得率。重復3 次計算平均值。
式中:C——芫根總皂苷質量,g;
M——原料質量,g;
N——提取液稀釋倍數(shù)。
取蕪菁提取液1 mL 用無水乙醇定容至5 mL,取定容后液體0.2 mL 取按照齊墩果酸標準曲線測定方法測定三萜類含量,計算三萜類得率。重復3 次計算平均值。
式中:C——根據(jù)標準曲線計算出反應液的三萜質量濃度,mg/mL;
V——反應液體積;
V2——提取液總體積,mL;
V1——待測液移取的體積,mL;
M——稱取的蕪菁質量,g。
1.3.4 蕪菁提取物體外抗氧化活性試驗
在國際社會不可再生能源日趨枯竭和節(jié)能環(huán)保理念愈發(fā)深入人心的當下,畢總認為在中國市場中雖然“油改電、鋰電化”已推行了一段時間,但進程仍需加快和加深,在叉車和電池技術上有著自己獨特優(yōu)勢的比亞迪叉車,仍繼續(xù)前進,為“油改電、鋰電化”做出貢獻。
(1) DPPH 自由基清除能力測定[13]。用無水乙醇配制0.1 mml/L DPPH 溶液,樣品組:取蕪菁提取液1 mL 分別加入DPPH 溶液2 mL,為A1;空白組:取DPPH 溶液2 mL 加入純水1 mL,為A0;干擾組:取不同濃度蕪菁提取液1 mL 分別加入純水2 mL,為A2;搖勻后在室溫條件下避光靜置15 min,在波長517 nm 處檢測吸光度,計算DPPH 自由基清除率。
(2) 總抗氧化能力測定。采用南京建成生物有限公司試劑盒,按照其方法取提取液0.1 mL 進行總抗氧化能力的測定,并按照公式進行總抗氧能力的計算。
式中:A0——對照OD 值;
A1——測定OD 值。
1.3.5 羥自由基清除能力的測定[14]
在比色管中依次加入濃度為6 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液2 mL,濃度為6 mmol/L 水楊酸溶液2 mL,濃度為6 mmo/L 過氧化氫溶液2 mL 后搖勻,樣品組加入1 mL 提取液,為A1;空白組加入1 mL 純水代替提取液,為A0;干擾組以2 mL 純水代替過氧化氫,為A2。
3 種提取方法下3 種活性物質含量見表1。
表1 3 種提取方法下3 種活性物質含量/ %
由表1 可知,超聲- 醇提法下總黃酮含量最高為0.173%,與水法和酶法提取總黃酮含量對比呈現(xiàn)顯著性增加;3 種提取方法下蕪菁總皂苷含量均存在差異顯著性,酶法提取總皂苷含量最高為14.96%,其次超聲- 醇提法下蕪菁總皂苷含量為11.83%,水提法總皂苷含量最小,為8.93%;3 種提取方法下酶法提取三萜含量最高為7.45%,超聲- 醇法提取測定總皂苷和三萜含量為6.05%,這2 種提取方法較水法提取顯著性增加。
2.2.1 不同提取方法下DPPH 自由基清除能力測定
不同提取方法下DPPH 自由基清除能力見圖1。
由圖1 可知,3 種提取方法下提取液對DPPH 自由基清除率均大于90%,水提法提取液對DPPH 自由基清除率最小為90.28%,超聲醇提法、酶法提取液對DPPH 自由基清除率分別為94.74%,95.65%,其中酶法提取液對DPPH 自由基清除率最高,3 種提取方法下DPPH 自由基清除率不存在顯著性差異。
圖1 不同提取方法下DPPH 自由基清除能力
2.2.2 不同提取方法羥基自由基清除能力測定
不同提取方法下羥基自由基清除能力見圖2。
圖2 不同提取方法下羥基自由基清除能力
由圖2 可知,超聲- 醇法提取液對羥基自由基清除率最小,為60.37%,水提法、酶法提取液對羥基自由基清除率分別為78.72%,90.40%,水提與醇提2 種方法均與超聲- 醇法提取液對羥基自由基清除率存在顯著性差異。
2.2.3 不同提取方法下總抗氧化能力測定
不同提取方法下總抗氧化能力見圖3。
圖3 不同提取方法下總抗氧化能力
由圖3 可知,超聲- 醇提法提取液總抗氧化能力最高,為11.59 U/mL;水提法、酶法提取液總抗氧化能力分別為7.4 U/mL,9.04 U/mL,超聲- 醇提法與水提法總抗氧化能力存在顯著性差異,與酶提法總抗氧化能力不存在顯著差異。
超聲- 醇提法總黃酮得率顯著性高于其他2 種提取方法,酶法提取測定總皂苷和三萜得率均為最高,且顯著高于水法提??;酶法提取對DPPH 自由基清除和羥基自由基清除能力上最強,在對羥基自由基清除能力上與其他2 種提取方法存在顯著性差異,在總抗氧化能力上超聲- 醇提法顯著高于其他2 種提取方法;綜上所述,酶法提取可作為提取蕪菁較為方便的方法。