孫曉紅，王迎迎，李 洋，辛偉娟，史麗新，曹福紅，蘇魯濱

（煙臺(tái)喜旺肉類食品有限公司，山東 煙臺(tái) 264000）

肉及肉制品是人體營(yíng)養(yǎng)的主要來(lái)源，能為人類提供必需營(yíng)養(yǎng)素。社會(huì)生活中，肉制品的數(shù)量和質(zhì)量已成為衡量人民生活質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展和進(jìn)步，消費(fèi)者的觀點(diǎn)得到更新，口感、營(yíng)養(yǎng)、健康已成為廣大居民的第一選擇，因此低溫肉制品以其結(jié)實(shí)的肉質(zhì)、富有彈性的結(jié)構(gòu)、最大程度保留肉類的營(yíng)養(yǎng)等特點(diǎn)，越來(lái)越受到廣大消費(fèi)者的歡迎[1]。但是，低溫肉制品儲(chǔ)存不當(dāng)極易變質(zhì)。因此，為了確保低溫肉制品的食品安全，需要從源頭開(kāi)始控制微生物。采取對(duì)入廠的原料、輔料、包材進(jìn)行消毒、殺菌，生產(chǎn)過(guò)程嚴(yán)格控制衛(wèi)生，對(duì)終產(chǎn)品進(jìn)行殺菌等方式。目前，生產(chǎn)過(guò)程控制、產(chǎn)品殺菌都有成型的方式方法進(jìn)行應(yīng)用，而對(duì)原料的消殺大部分為二氧化氯浸泡，二氧化氯消毒后有殘留，長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生傷害。隨著社會(huì)的發(fā)展進(jìn)步，人們對(duì)食品安全越來(lái)越重視，在加工食品過(guò)程中選擇安全無(wú)殘留的能源，是大勢(shì)所趨。臭氧殺菌就是一種安全無(wú)殘留的殺菌方式，完美契合了我國(guó)食品加工業(yè)營(yíng)養(yǎng)健康、安全環(huán)保的發(fā)展主題。

臭氧具有強(qiáng)氧化性[2]，通過(guò)生物化學(xué)氧化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)滅菌，臭氧分解產(chǎn)生新生氧的氧化能力實(shí)現(xiàn)殺菌。臭氧會(huì)自行分解為氧氣，不產(chǎn)生殘留污染，消毒后不需通風(fēng)換氣，可用作殺菌或防霉保鮮直接對(duì)食品使用，簡(jiǎn)單方便。臭氧有效殺菌濃度對(duì)食品而言是極微弱的濃度，對(duì)食品無(wú)害。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凍豬肉，德州金鑼肉制品有限公司提供；平板計(jì)數(shù)瓊脂，北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供；三氯乙酸、鹽酸、甲基紅、亞甲基藍(lán)等，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司提供。

PL-2001-L 型電子天平，梅特勒- 托利多儀器（上海） 有限公司產(chǎn)品；HPX-9162MBE 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；TU-1810D 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；德拉瓦伊解凍設(shè)備，上海德拉瓦伊食品機(jī)械貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；臭氧發(fā)生器，濟(jì)南瑞清臭氧設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)

（1） 臭氧質(zhì)量濃度對(duì)殺菌效果的影響。將拆箱后的冷凍豬肉放入德拉瓦伊設(shè)備中，按設(shè)備要求擺放在解凍架上，設(shè)備參數(shù)設(shè)置為17 ℃，待肉的中心溫度達(dá)到-5～0 ℃時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行臭氧殺菌。每次測(cè)定重復(fù)3 次，取平均值。

臭氧試驗(yàn)分組見(jiàn)表1。

表1 臭氧試驗(yàn)分組

（2） 殺菌時(shí)間對(duì)臭氧殺菌效果的影響。將拆箱后的冷凍肉放入德拉瓦伊設(shè)備的解凍架上，設(shè)備參數(shù)設(shè)置為17 ℃，待肉的中心溫度達(dá)到-5～0 ℃時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行臭氧殺菌，臭氧質(zhì)量濃度設(shè)為6 mg/L，殺菌時(shí)間分別為1.0，1.5，2.0 h，殺菌后取出進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。每次測(cè)定重復(fù)3 次，取平均值，同時(shí)做對(duì)照試驗(yàn)。

（3） 殺菌溫度對(duì)臭氧殺菌效果的影響。將拆箱后的冷凍肉放入德拉瓦伊設(shè)備的解凍架上，德拉瓦依設(shè)備溫度分別設(shè)置為10，17，25 ℃，濕度控制在90%，待肉的中心溫度達(dá)到-5～0 ℃時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行臭氧殺菌，臭氧質(zhì)量濃度設(shè)為6 mg/L，殺菌時(shí)間設(shè)為1.5 h。殺菌后進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定，每次測(cè)定重復(fù)3 次，取平均值，同時(shí)做對(duì)照試驗(yàn)。

1.2.2 正交法確定殺菌參數(shù)

在對(duì)臭氧質(zhì)量濃度、殺菌時(shí)間、殺菌溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化三因素三水平得到最優(yōu)組合，以菌落總數(shù)、蛋白羰基含量、TBARS 為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行分析。

臭氧殺菌關(guān)鍵參數(shù)確定正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2。

表2 臭氧殺菌關(guān)鍵參數(shù)確定正交試驗(yàn)因素水平

1.2.3 菌落總數(shù)的測(cè)定

參照GB/T 4789.2-2016 進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 蛋白羰基含量的測(cè)定

根據(jù)Soglia F 等人[3]的方法進(jìn)行修改。豬肉樣品攪碎，取1 g 樣品，加入0.15 mol/L 冰浴KCl 溶液10 mL，以轉(zhuǎn)速 3 000 r/min 均質(zhì) 60 s，取 100 μL 的均質(zhì)液2 份，分別加入200 g/L 三氯乙酸溶液1 mL，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心5 min，棄去上清液，加入50 g/L 十二烷基磺酸鈉溶液400 μL，2 份混合樣品同時(shí)超聲60 min，一份樣品加入含質(zhì)量濃度為2 g/L的2,4- 二硝基苯肼（DNPH），另一份只加入2 mol/L的 HCl 溶液 800 μL 做空白。放置 30 min，加入400 g/L 三氯乙酸溶液400 μL，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心5 min。移除上清液，加入體積比為1∶1 的乙醇- 乙酸乙酯混合液1 mL，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min。重復(fù)操作3 次后，在沉淀中加入pH 值6.5、含有 6 mol/L 的鹽酸胍的 20 mmol/L 的 NaH2PO4溶液1.5 mL，蛋白質(zhì)溶解后，于4 ℃條件下放置12 h，于波長(zhǎng)280 nm 和370 nm 處分別測(cè)定吸光度。

1.2.5 脂質(zhì)過(guò)氧化（TBARS） 的測(cè)定

參照Klaenhammer T R[4]略作修改。肉樣攪碎，稱取10 g，加入50 mL 含0.1%EDTA 的7.5%三氯乙酸，振搖30 min，過(guò)濾，取上清液5 mL，加入0.02 mol/L TBA 5 mL，沸水浴加熱40 min，取出冷卻，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心20 min ，取上清液，加入5 mL 氯仿，搖勻，靜置分層，取上清液，在波長(zhǎng)532 nm 處測(cè)比色。計(jì)算公式如下：

式中：A532——待測(cè)液在波長(zhǎng)532 nm 下的吸光度；

Ws——樣品的質(zhì)量，g。

1.2.6 感官品質(zhì)評(píng)定[5]

依據(jù)《GB 2726 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)熟肉制品》，選取10 名人員按照表3 產(chǎn)品進(jìn)行評(píng)價(jià)，匯總數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

產(chǎn)品感官評(píng)分項(xiàng)目與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表3。

表3 產(chǎn)品感官評(píng)分項(xiàng)目與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.7 保質(zhì)期的測(cè)定

將臭氧殺菌技術(shù)進(jìn)行了3 次試驗(yàn)驗(yàn)證，采用臭氧殺菌技術(shù)、正常工藝生產(chǎn)的冷切腸，各取500 袋，分別置于25 ℃下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)。每20 d 檢測(cè)1 次菌落總數(shù)，同時(shí)進(jìn)行感官檢驗(yàn)。菌落總數(shù)檢驗(yàn)值達(dá)到103CFU/g 或產(chǎn)品感官變質(zhì)率達(dá)到1%時(shí)，結(jié)束恒溫培養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)中數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次，使用IBM SPSS Statistics 26 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)p＜0.05 時(shí)，認(rèn)為組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 臭氧質(zhì)量濃度對(duì)殺菌效果的影響

臭氧質(zhì)量濃度對(duì)菌落總數(shù)的影響（*p＜0.05） 見(jiàn)圖1。

圖1 臭氧質(zhì)量濃度對(duì)菌落總數(shù)的影響（*p＜0.05）

由圖1 可知，第1 組與對(duì)照組的菌落總數(shù)變化差異不顯著（p＞0.05），第2，3，4 組與對(duì)照組相比殺菌效果顯著（p＜0.05），但是第2，3，4 組間差異不顯著（p＞0.05），這是因?yàn)槌粞鯕⒕荒軐?duì)豬肉表面進(jìn)行殺菌，豬肉內(nèi)部的細(xì)菌依然存活。臭氧化學(xué)性質(zhì)活潑具有極強(qiáng)的氧化能力，可以同細(xì)菌的細(xì)胞壁中存在的蛋白質(zhì)等有機(jī)物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使細(xì)胞壁通透性增加，細(xì)胞內(nèi)容物流出，使其失去活性[6]。臭氧破壞或分解細(xì)胞壁迅速擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞里氧化了細(xì)胞內(nèi)酶或RNA、DNA從而致死菌原體[7]。因臭氧具有強(qiáng)氧化性，導(dǎo)致在殺菌過(guò)程原料肉的蛋白羰基含量、TBARS 明顯升高[8]。

臭氧質(zhì)量濃度對(duì)蛋白氧化的影響見(jiàn)圖2，臭氧質(zhì)量濃度對(duì)脂質(zhì)氧化的影響見(jiàn)圖3。

圖2 臭氧質(zhì)量濃度對(duì)蛋白氧化的影響

圖3 臭氧質(zhì)量濃度對(duì)脂質(zhì)氧化的影響

2.1.2 臭氧殺菌時(shí)間對(duì)殺菌效果的影響

殺菌時(shí)間對(duì)殺菌效果的影響見(jiàn)圖4。

由圖4 可知，臭氧殺菌的效果顯著（p＜0.05），殺菌時(shí)間越長(zhǎng)，殺滅的菌落越少。但隨著殺菌時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白氧化、脂質(zhì)氧化程度越來(lái)越高，殺菌1.5 h與2.0 h，蛋白氧化、脂質(zhì)氧化差異不顯著（p＞0.05）。

圖4 殺菌時(shí)間對(duì)殺菌效果的影響

2.1.3 殺菌溫度對(duì)臭氧殺菌效果的影響

殺菌溫度對(duì)殺菌效果的影響見(jiàn)圖5。

圖5 殺菌溫度對(duì)殺菌效果的影響

臭氧的殺菌效果受溫度影響較大，由圖5 可知，隨著殺菌溫度的升高，菌落總數(shù)數(shù)值逐漸升高，低溫時(shí)微生物的殺滅效果較好，10 ℃殺菌后菌落總數(shù)為3.62±0.06 lg CFU/g， 17 ℃殺菌后的菌落總數(shù)為3.85±0.05 lg CFU/g，25 ℃殺菌后的菌落總數(shù)為3.80±0.08 lg CFU/g。此外，隨著殺菌溫度的升高，蛋白氧化、脂質(zhì)氧化的速度也在加快。

2.2 正交試驗(yàn)法確定殺菌參數(shù)

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)對(duì)臭氧質(zhì)量濃度、殺菌時(shí)間和殺菌溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，使用三因素三水平正交設(shè)計(jì)優(yōu)化得到最優(yōu)組合。在貯藏期間，通過(guò)菌落總數(shù)、蛋白羰基含量與TBARS 進(jìn)行分析。根據(jù)表5 各指標(biāo)的值確定各因素的最優(yōu)水平組合為菌落總數(shù)A3B2C1，蛋白羰基含量A1B1C1，TBARS A1B1C1。由于各項(xiàng)指標(biāo)分析得到的最優(yōu)組合均不一致，考慮到對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)影響較大的因素為菌落總數(shù)，而國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)蛋白羰基含量與TBARS 未作規(guī)定，經(jīng)綜合平衡分析，得到最優(yōu)組合為A3B2C1，即臭氧質(zhì)量濃度8 mg/L，殺菌時(shí)間1.5 h，殺菌溫度10 ℃。

后期對(duì)最優(yōu)組合的進(jìn)行效果驗(yàn)證過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，殺菌質(zhì)量濃度為8 mg/L 時(shí)，會(huì)使產(chǎn)品中帶有一些令人不悅的氣味，這可能與臭氧自身帶有的特殊氣味有關(guān)。原料肉正常的解凍溫度為17 ℃，解凍后需將溫度調(diào)整為10 ℃進(jìn)行臭氧殺菌，操作比較繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)。因此，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用情況，對(duì)最優(yōu)組合的參數(shù)進(jìn)行調(diào)整為臭氧質(zhì)量濃度6 mg/L，殺菌時(shí)間1.5 h，殺菌溫度17 ℃。

2.3 臭氧殺菌技術(shù)的驗(yàn)證

2.3.1 臭氧殺菌技術(shù)對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)分的影響

產(chǎn)品存放過(guò)程感官評(píng)分的變化情況見(jiàn)圖6。

圖6 產(chǎn)品存放過(guò)程感官評(píng)分的變化情況

由圖6 可知，臭氧殺菌技術(shù)與對(duì)照產(chǎn)品感官評(píng)分均隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，總體來(lái)看，臭氧殺菌技術(shù)的產(chǎn)品感官好于對(duì)照產(chǎn)品。存放0，15，30 d的感官評(píng)分，二者無(wú)顯著差別（p＞0.05），說(shuō)明應(yīng)用臭氧殺菌技術(shù)處理原料肉對(duì)產(chǎn)品感官影響不大。45 d以后，對(duì)照產(chǎn)品的感官評(píng)分下降趨勢(shì)明顯，至75 d時(shí)，臭氧殺菌技術(shù)的產(chǎn)品評(píng)分明顯高于對(duì)照產(chǎn)品（p＜0.05）。由此可見(jiàn)，臭氧處理原料肉在一定程度上能保持冷切腸的感官品質(zhì)。

2.3.2 臭氧殺菌技術(shù)對(duì)產(chǎn)品保質(zhì)期的影響

臭氧殺菌技術(shù)對(duì)保質(zhì)期的影響見(jiàn)圖7。

圖7 臭氧殺菌技術(shù)對(duì)保質(zhì)期的影響

由圖7 可知，臭氧殺菌的產(chǎn)品25 ℃保質(zhì)期可以達(dá)到90 d，而對(duì)照產(chǎn)品的保質(zhì)期為75 d，臭氧殺菌能夠使產(chǎn)品保質(zhì)期延長(zhǎng)20%。

2.3.3 臭氧殺菌技術(shù)對(duì)產(chǎn)品脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

產(chǎn)品存放過(guò)程TBARS 的變化情況見(jiàn)圖8。

圖8 產(chǎn)品存放過(guò)程TBARS 的變化情況

由圖8 可知，臭氧殺菌產(chǎn)品的TBARS 值高于對(duì)照產(chǎn)品，其脂質(zhì)過(guò)氧化的問(wèn)題可在后期通過(guò)改進(jìn)包裝形式等方式進(jìn)行調(diào)整。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)獲得了臭氧殺菌的最優(yōu)組合，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用，最優(yōu)組合為臭氧質(zhì)量濃度6 mg/L，殺菌時(shí)間1.5 h，殺菌溫度17 ℃。臭氧殺菌技術(shù)的驗(yàn)證過(guò)程中，冷切腸存放至75 d 時(shí)，感官評(píng)分為86.7±0.08 分，均顯著優(yōu)于對(duì)照組 （p＜0.05）；而TBARS 則高于對(duì)照組。結(jié)果表明，臭氧殺菌處理原料肉能有效抑制產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，但是如何延緩產(chǎn)品脂質(zhì)氧化方面，需要繼續(xù)進(jìn)行研究。