劉 迎，劉利強，李慧芳，劉 娜，劉彥威，杜 娟

（1. 河北交通職業(yè)技術(shù)學院，河北 石家莊 050091；2. 河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056021）

0 引言

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis） 是好氧兼性厭氧菌，屬于腸桿菌科（Proteobacteriaceae） 變形桿菌屬（Proteobacteriaceae） 細菌，呈G+，廣泛分布于生活用水、土壤、人和動物體內(nèi)，是一種機會致病菌[1]。奇異變形桿菌除了可以引起人和動物發(fā)生敗血癥等疾病以外，也能夠通過加熱不徹底的食物進入人體，引發(fā)食物中毒。食物中奇異變形桿菌的污染率為3.8%～100.0%，以動物源食品帶菌率較高，特別是新鮮肉，在全國已屢次發(fā)生消費者食用被奇異變形桿菌污染的食品引發(fā)食物中毒的事件[2]。

熒光定量PCR 技術(shù)是針對細菌高度保守序列設(shè)計引物，進行PCR 擴增，具有結(jié)果穩(wěn)定、靈敏度高、污染小、重復性好、標準化操作等特點，已用于食品中致病菌的檢測[3]。但目前國內(nèi)關(guān)于熒光定量PCR方法檢測新鮮雞肉中奇異變形桿菌的研究比較少見。近年來，由于抗生素在食品動物中的不規(guī)范使用，奇異變形桿菌耐藥性已廣泛傳播，但不同來源的菌株耐藥性卻大不相同，目前還未見新鮮雞肉源奇異變形桿菌耐藥性報道[4]。為此，建立熒光定量PCR 檢測方法對河北省某地市場現(xiàn)售新鮮雞肉奇異變形桿菌污染進行檢測，并對新鮮雞肉中分離到的菌株進行耐藥性分析，了解本地流行株的耐藥特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

LB 肉湯、SS 瓊脂培養(yǎng)基、MHA 瓊脂培養(yǎng)基、細菌基因組DNA 提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司提供；熒光定量PCR 儀，美國Bio-Rad 公司提供；Oxoid 藥物敏感性試驗紙片：分別為四環(huán)素（TCY）、強力霉素（DOX）、青霉素（PEN）、阿莫西林（AMX）、氨芐西林（AMP）、氯霉素（CHL）、鏈霉素（STR）、卡那霉素（KAN）、慶大霉素（GEN）、壯觀霉素（SPT）、甲氧芐氨嘧啶（TMP）、磺胺甲惡唑（SMZ）、諾氟沙星（NOR）、環(huán)丙沙星（CIP）、紅霉素（ERY）、林可霉素（LIN）、克林霉素（CLI），共17 種，均為Oxiod Ltd Basingstoke Hampshire England 公司提供；藥敏質(zhì)控菌株為ATCC 25922 大腸埃希菌，中國科學院微生物所菌種保藏中心提供。

1.2 引物種類

細菌通用引物16S rDNA：上游引物F：5'-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3'，下游引物R：5'-GAGTT TGATCMTGGCTCAG-3'，擴增產(chǎn)物預期大小為750 bp。奇異變形桿菌的尿素酶基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（CP034090） ， 上 游 引 物 為 qrrA-F:5， -TTTATCAAAGCCTCAAACCC-3， 下 游 引 物 為 qrrA-R:5，-TGCGTCACCCTCTAACTCATC-3，擴增產(chǎn)物預期大小為395 bp。細菌通用引物16S rDNA 和奇異變形桿菌qrrA 特異性引物由奧美德諾（北京） 基因科技有限公司合成。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的采集

在河北省某農(nóng)貿(mào)市場用無菌棉簽涂抹新鮮雞肉表面，然后放入無菌離心管中并作標記，低溫送回實驗室，共計100 份樣品。

1.3.2 細菌分離

將采集的雞肉樣品在SS 瓊脂上進行劃線分離，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h。觀察菌落大小、顏色、形態(tài)、邊緣整齊度和光滑度等細菌菌落特征。挑取可疑變形桿菌的菌落進行革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察。

1.3.3 奇異變形桿菌鑒定

奇異變形桿菌采用分子生物學的鑒定方法，即利用細菌16S rDNA 通用引物進行PCR 擴增，對PCR 產(chǎn)物進行測序分析。挑取SS 瓊脂上疑似奇異變形桿菌單菌落，按照細菌基因組DNA 提取試劑盒說明提取奇異變形桿菌DNA，進行PCR，擴增產(chǎn)物送生工生物工程（上海） 股份有限公司進行基因測序。對測到的序列結(jié)果登錄https://www.ncbi.nlm.nih.gov/在線BLAST，進行同源性比對，比對結(jié)果相似大于97%以上的即可確定為奇異變形桿菌。奇異變形桿菌PCR 反應采用 25 μL 體系。

奇異變形桿菌PCR 反應體系見表1。

表1 奇異變形桿菌PCR 反應體系/μL

PCR 擴增反應程序：預變性94 ℃-5 min；變性94 ℃-40 s，退火 60 ℃-30 s；延伸 72 ℃-55 s，共35 個循環(huán)；再72 ℃延伸7 min，于4 ℃保存。

1.3.4 奇異變形桿菌熒光定量PCR 的建立

（1） qPCR 擴增。①熒光定量PCR 反應體系為SYBR Premix Ex Taq（2×） 12.5 μL，上游引物 F1、下游引物下游引物F2分別加入1 μL，加入Proteus DNA 模板 1.0 μL，再加入滅菌的雙蒸水補足反應體系，共25 μL。②qPCR 反應條件為預變性、變性、退火、延伸的溫度和時間分別為94 ℃-4 min，94 ℃-15 s，56 ℃-35 s，72 ℃-30 s，反應 40 個循環(huán)（cycle），再72 ℃-10 min 延伸，保存于4 ℃，然后進行統(tǒng)計和分析。

（2） 標準曲線的繪制。奇異變形桿菌在LB 肉湯增菌培養(yǎng)，用營養(yǎng)瓊脂平板涂布法測定分離到的奇異變形桿菌菌液濃度。用LB 肉湯稀釋最后調(diào)整奇異變形桿菌濃度為106CFU/mL 后提取奇異變形桿菌DNA，將106CFU/mL 奇異變形桿菌菌液的DNA以10x倍比系列用無菌雙蒸水進行稀釋至相當于101CFU/mL 奇異變形桿菌菌液的DNA。經(jīng)qPCR 擴增后，以奇異變形桿菌菌液濃度（CFU/mL） 為橫坐標，以PCR 反應的循環(huán)數(shù)（Ct 值） 為縱坐標繪制濃度標準曲線。

（3） 特異性試驗。奇異變形桿菌和雞肉中常見的7 種常見致病菌為對照菌株，分別為沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、腸球菌 （Enterococcus）、鏈球菌 （Streptococcus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、枯草芽孢菌（Bacillus subtilis）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae） 的基因組DNA 為模板進行熒光定量PCR，檢測構(gòu)建方法的特異性。

（4） 敏感性試驗。以雞肉中奇異變形桿菌qPCR反應和普通PCR 反應分析比較，檢測所構(gòu)建qPCR方法的敏感性，以101～106CFU/mL 奇異變形桿菌DNA 6 個濃度梯度分別進行普通PCR 和qPCR 擴增，以2 種方法所能檢測到最低濃度來比較敏感性的差異。

（5） 重復性試驗。從雞肉中分離到奇異變形桿菌為出發(fā)點，在不同濃度DNA 梯度中隨機選擇2 個濃度梯度，每個濃度分別為3 個重復，對構(gòu)建方法的重復性進行檢驗，根據(jù)奇異變形桿qPCR 反應的Ct 值計算2 個濃度組之間變異系數(shù)（CV/%），檢查奇異變形桿菌qPCR 檢測方法穩(wěn)定性。

（6） 組織樣品檢測。將在市場采集的新鮮雞肉樣品用無菌棉簽進行涂抹后，置于LB 培養(yǎng)液中培養(yǎng)1 h，按照試劑盒操作說明提取DNA，設(shè)定陽性和陰性對照樣品，用所構(gòu)建的熒光定量PCR 方法對采集的雞肉新鮮樣品檢測，根據(jù)的Ct 值計算雞肉中奇異變形桿菌數(shù)量，評價所構(gòu)建方法的實用性。

1.3.5 藥物敏感性檢測

按WHO 推薦的K-B 紙片法進行奇異變形桿菌的抗菌藥物敏感性分析。挑取SS 瓊脂上生長并用分子生物學方法鑒定為奇異變形桿菌的菌株接種于LB肉湯培養(yǎng)搖菌（180 r/min） 培養(yǎng)6～8 h，調(diào)整菌液含量為108CFU/mL。吸取100 μL 菌液涂布于MHA 瓊脂培養(yǎng)基，用無菌鑷子將藥敏紙片輕輕置于培養(yǎng)基表面，稍按壓使藥敏片與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，18～24 h 進行培養(yǎng)后測量藥敏片抑菌圈直徑。根據(jù)美國臨床試驗室標準委員會（CLS，2006） 最新頒布的抗微生物藥物敏感性試驗標準判定奇異變形桿菌對選用的17 種抗生素的耐藥結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 奇異變形桿菌的分離

在100 份樣品中，有68 份樣品在SS 瓊脂上長有疑似奇異變形桿菌的菌落，特征為表面光滑，圓形、扁平、中等大小、中心呈黑色。染色后鏡檢顯示菌體革蘭陰性菌，多數(shù)為桿狀、兩端鈍圓，少部分為絲狀。

2.2 分子生物學鑒定

樣品經(jīng)PCR 擴增、測序，基因比對，結(jié)果表明此次在68 份疑似變形桿菌中鑒定出66 株奇異變形桿菌，其分離率為66.0%。

2.3 奇異變形桿菌熒光定量PCR 的檢測

2.3.1 奇異變形桿菌引物的特異性

奇異變形桿菌經(jīng)尿素酶qrrA 特異性引物PCR 擴增后，瓊脂糖凝膠電泳形成一單條帶，片段約為395 bp，與設(shè)計引物的預期基因片段大小相同。經(jīng)基因測序、NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov） 比對，所擴增序列與基因庫奇異變形桿菌尿素酶基因的相似度為99.91%。

2.3.2 定量PCR 特異性

經(jīng)定量PCR 擴增后形成單一擴增曲線和熔解曲線，而沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢菌、陰溝腸桿菌都沒有擴增曲線和熔解曲線，說明該方法能夠區(qū)分奇異變形桿菌和雞肉其他中常見的治病菌。

熒光定量PCR 結(jié)果見圖1。

2.3 .3 敏感性試驗

以奇異變形桿菌DNA 相當于菌液106～101CFU/mL的6 個菌落總數(shù)用普通PCR 檢測、qPCR 分別上機測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)定量PCR 方法可以檢測到1×101CFU/mL（圖2），常規(guī)PCR 檢測到1×103CFU/mL（圖3），結(jié)果顯示熒光定量PCR 的敏感度比常規(guī)PCR 高100 倍。

奇異變形桿菌qPCR 擴增曲線見圖2，奇異變形桿菌DNA 6 個菌落總數(shù)PCR 電泳見圖3。

圖2 奇異變形桿菌qPCR 擴增曲線

圖3 奇異變形桿菌DNA 6 個菌落總數(shù)PCR 電泳

2.3.4 重復性試驗結(jié)果

將106CFU/mL 奇異變形桿菌提取DNA 后，隨機選擇了106和1042 個菌落總數(shù)，用SYBR Green I熒光定量PCR 進行了3 次擴增，根據(jù)反應后的Ct 值計算組內(nèi)變異系數(shù)（CV%），Ct 值的變異系數(shù)分別為1.3%，0.9%，均比2%低，證明構(gòu)建的奇異變形桿菌檢測方法穩(wěn)定性較好。結(jié)果顯示，擴增曲線和熔解曲線在相同菌落總數(shù)的3 個重復基本一致（圖4）。

奇異變形桿菌熒光定量PCR 變異系數(shù)見表2，熒光定量PCR 重復性試驗結(jié)果見圖4。

表2 奇異變形桿菌熒光定量PCR 變異系數(shù)

圖4 熒光定量PCR 重復性試驗結(jié)果

2.3.5 熒光定量PCR 檢測

用無菌棉簽在新鮮雞肉表面進行涂抹后及時置于無菌LB 肉湯離心管中，于37 ℃下培養(yǎng)1 h 后按照試劑盒說明提取新鮮雞肉DNA，加入PCR 反應體系中進行擴增檢測，檢測呈陽性樣品有Ct 值，呈陰性樣品對照無Ct 值，所采集的100 份新鮮雞肉中有66 份（66.0%） 檢出了奇異變形桿菌。

樣品檢測結(jié)果見圖5。

圖5 樣品檢測結(jié)果

2.4 奇異變形桿菌耐藥性結(jié)果

根據(jù)CLSI 標準判定，在新鮮雞肉分離的66 株奇異變形桿菌對養(yǎng)殖中常用的17 種抗生素均有不同程度的耐藥，其中對鏈霉素、紅霉素、林可霉素、克林霉素100%耐藥，對青霉素耐藥率較低，為19.7%（13/66）。奇異變形桿菌表現(xiàn)為多重耐藥性，最低為四重耐藥，共6 株；最高為九重耐藥，共3 株；此外，五重耐藥菌7 株，六重耐藥菌19 株，七重耐藥菌26 株，八重耐藥菌5 株。

66 株奇異變形桿菌對17 種抗生素的敏感性結(jié)果見表3。

表3 66 株奇異變形桿菌對17 種抗生素的敏感性結(jié)果

3 結(jié)論

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis） 是肉類食品常見的污染菌之一，常常通過消毒不徹底的肉食品進入人體，引起食物中毒。目前，國內(nèi)因奇異變形桿菌引起的家庭性食物中毒呈逐年增加趨勢，對消費者的健康造成很大的傷害，對經(jīng)濟造成很大的損失。為此必須加強新鮮肉類食品的檢測，以保證消費者的食品安全。目前，國家還未制定相應的國家標準[5]，常用的檢測方法是傳統(tǒng)的微生物檢測包括奇異變形桿菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定等方法，這些方法具有很高準確度但操作起來繁瑣，不適合日常食品衛(wèi)生檢測工作，急需建立一種實用、準確、高效的檢測方法，熒光定量PCR 檢測方法時間短、高通量、特異性強，實現(xiàn)了對致病菌的檢測，可用于對新鮮雞肉樣品的檢測。

張海霞等人[6]研究發(fā)現(xiàn)奇異變形桿菌與雞肉中常見的沙門氏菌有交叉抗原，用血清學方法檢測容易出現(xiàn)交叉凝集，發(fā)生漏檢或錯檢。該研究建立的定量PCR 方法可以區(qū)分奇異變形桿菌和沙門氏菌，防止假陽性的出現(xiàn)，可以用于新鮮雞肉樣品的檢測。食品特別是新鮮肉類食品受到奇異變形桿菌的污染情況較為嚴重，陳善嬌等人[7]對中山市某市場出售的268 份新鮮肉類食品中采用普通PCR 檢出了117 份樣品攜帶奇異變形桿菌，總攜帶率為43.7%，其中新鮮雞肉攜帶率最高，陽性率為51.6%。郭玉梅等人[8]通過菌株分離、生化鑒定的方法在154 份熟肉制品中鑒定出30 份（19.5%） 奇異變形桿菌陽性樣品。畢水蓮等人[9]對奇異變形桿菌標準菌株采用普通PCR和qPCR 2 種檢測方法相比，普通PCR 和熒光定量PCR 對檢測結(jié)果具有一致性，但是相對于傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)的檢測周期長、要求高的不足，熒光定量PCR完成檢測的時間為2～3 h，奇異變形桿菌熒光定量PCR 檢測方法能夠大大節(jié)省時間。王慧[10]采用普通PCR方法檢測雞源奇異變形桿菌敏感度為104CFU/mL，該研究中常規(guī)PCR 檢測限為103CFU/mL 和定量PCR檢測限為101CFU/mL，定量PCR 方法比常規(guī)PCR 方法靈敏度高100 倍，具有高靈敏度的優(yōu)點。

奇異變形桿菌耐藥性相對嚴重，菌體本身攜帶耐藥性R 質(zhì)粒能夠在同種屬不同菌株甚至不同種屬的細菌之間進行轉(zhuǎn)移，并形成復合R 質(zhì)粒，導致菌體抵御抗菌藥物的進化加快，耐藥性增加[11]。何欣怡等人[12]對雞源奇異變形桿菌的耐藥性研究中發(fā)現(xiàn)株菌對紅霉素、四環(huán)素耐藥率為100%（7/7）。梁紫璐等人[13]對臨床分離的奇異變形桿菌耐藥性結(jié)果表明，菌株對紅霉素的耐藥率為97.4%（75/77），對四環(huán)素的耐藥率為72.73%（56/77）。孫冷寧等人[14]對來源于市場所售鮮肉的奇異變形桿菌耐藥性分析也表明，奇異變形桿菌對鏈霉素等18 種抗菌藥物的耐藥性較為嚴重，其中對鏈霉素、紅霉素耐藥率為100%（71/71），對四環(huán)素類藥物多西環(huán)素的耐藥率為80.3%（57/71）。該研究中分離到的66 株奇異變形桿菌對紅霉素耐藥情況相似，對四環(huán)素類耐藥性有差異，但總體上耐藥率較高，可能與樣品來源或區(qū)域不同有關(guān)。該研究中分離的奇異變形桿菌共66 株，數(shù)量相對較少，耐藥性分析結(jié)果不能全面反映奇異變形桿菌的耐藥情況，但從現(xiàn)有的數(shù)據(jù)分析表明，奇異變形桿菌的總體耐藥性較為嚴重，需要相關(guān)部門多加關(guān)注。

有研究表明，新鮮雞肉中奇異變形桿菌的污染較為嚴重，存在食品安全風險，且奇異變形桿菌耐藥率較高。因此，首先要加強食品特別是生鮮肉類食品中奇異變形桿菌的監(jiān)測，防止食品污染，減少食物中毒現(xiàn)象；其次要根據(jù)本地區(qū)奇異變形桿菌流行株引起的食物中毒菌株耐藥特征，選擇合理的藥物，減少盲目治療；最后建議消費者學習健康知識，食物徹底加熱，防止交叉污染，提高食源性疾病的防范意識。