王飛 吳毅 沈智文

手術(shù)產(chǎn)生的創(chuàng)傷，或者圍手術(shù)期的刺激，比如大腦缺血缺氧、血壓劇烈波動、麻醉，都會對患者的認(rèn)知功能產(chǎn)生影響，從而造成術(shù)后認(rèn)知功能障礙（Post-operative cognitive dysfunction，POCD）。尤其部分有基礎(chǔ)疾病或者高齡的患者，本身認(rèn)知功能較差，加上手術(shù)、圍手術(shù)期應(yīng)激反應(yīng)，以及麻醉藥的使用，都會對患者認(rèn)知功能產(chǎn)生影響。POCD的發(fā)生不僅影響生活質(zhì)量和增加醫(yī)療負(fù)擔(dān)，而且導(dǎo)致死亡率增加。而神經(jīng)炎癥是在POCD 的病理生理機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。已有研究表明老年小鼠在經(jīng)歷剖腹探查術(shù)后發(fā)生神經(jīng)炎癥與學(xué)習(xí)記憶功能的損傷［1］。作為一種高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，右美托咪定通過激活α2腎上腺素受體產(chǎn)生鎮(zhèn)靜作用［2］。另外，右美托咪定可抑制海馬神經(jīng)元凋亡，從而減緩認(rèn)知功能障礙的進(jìn)程［3］，并且右美托咪定可通過抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞焦亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［4］，以上研究提示右美托咪定可能在認(rèn)知功能障礙中具有神經(jīng)保護(hù)作用。而這種神經(jīng)保護(hù)作用是否與其抑制海馬區(qū)炎癥有關(guān)，目前尚不清楚。本研究擬建立老年小鼠認(rèn)知功能障礙模型，研究右美托咪定是否改善老年小鼠剖腹探查術(shù)所致神經(jīng)炎癥，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF 級雄性C57BL/6 小鼠（27-34 g，16 月齡）購自廣東省動物實(shí)驗(yàn)中心。動物飼養(yǎng)環(huán)境為：室溫（22±1℃），晝夜節(jié)律（12h/12h），濕度（50±10%）。在實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)動物的使用遵循實(shí)驗(yàn)動物3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器右美托咪定（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；OlympusIX70 倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；熒光定量PCR 試劑盒（日本TaKara公司）；IL-1β 抗體（美國Cell Signaling Technology公司）、IL-6 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）、TNF-α 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）、GAPDH 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）、ELISA 試劑盒（美國R＆D Systems 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與干預(yù)措施根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表，將48 只老年C57BL/6 小鼠（16 月齡）隨機(jī)分成假手術(shù)組、手術(shù)組、右美托咪定組、右美托咪定+手術(shù)組，每組12 只。右美托咪定組腹腔注射25 μg/kg 右美托咪定；手術(shù)組行剖腹探查術(shù)；美托咪定+手術(shù)組在行剖腹探查術(shù)前20 分鐘預(yù)先腹腔注射25 μg/kg右美托咪定。假手術(shù)組腹腔注射等體積0.9%生理鹽水。剖腹探查術(shù)后8 小時(shí)，使用ELISA 試劑盒檢測各組小鼠海馬組織白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平；Western blot 檢測各組小鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α 表達(dá)情況。

1.4 動物手術(shù)模型建立首先我們使用1.5%異氟醚復(fù)合2 L/min 氧氣對老年小鼠進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉。待小鼠翻正反射消失確認(rèn)麻醉起效后實(shí)施剖腹探查術(shù)，先對小鼠腹部消毒，在腹部上腹正中部作1 至2 cm 的縱切口。隨后，逐層解剖進(jìn)入腹腔后行剖腹探查術(shù)，對小鼠的脾、肝臟、胃和腸道等臟器依次探查。整個(gè)手術(shù)過程在異氟醚麻醉下進(jìn)行，持續(xù)時(shí)間大約30 分鐘。

1.5 Westernblot 取海馬組織置于4℃冰上，然后加入適量RIPA 蛋白裂解液，充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)，使用離心機(jī)15 000 r/min 離心15 min 后取上清液，利用BCA 法進(jìn)行蛋白濃度測定。在60V，40mA 條件下電泳2 h，使用恒流250mA 將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，之后用5%BSA 封閉60 min，隨后加入一抗抗體，4℃搖床下孵育過夜，然后加入二抗后室溫孵育60 min。最后使用ImageJ 軟件進(jìn)行分析處理。

1.6 ELISA取海馬組織，按25 mL/g 加入0.9%生理鹽水，充分研磨，4℃離心取上清液，按照ELISA試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，以酶標(biāo)儀測量波長450 nm 處吸光度值，對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算對海馬炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析檢驗(yàn)對服從正態(tài)分布的計(jì)量資料進(jìn)行分析，對于組間的差異采用Turkey 法進(jìn)行兩兩比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SD）表示。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 右美托咪定減輕手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的海馬神經(jīng)炎癥見圖1。

圖1 右美托咪定對手術(shù)創(chuàng)傷誘發(fā)的促炎細(xì)胞因子表達(dá)升高的影響 A.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分析假手術(shù)組、手術(shù)組、右美托咪定組、右美托咪定+手術(shù)組海馬組織促炎細(xì)胞因子IL-1β 表達(dá)情況。B.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分析假手術(shù)組、手術(shù)組、右美托咪定組、右美托咪定+手術(shù)組海馬組織促炎細(xì)胞因子IL-6 表達(dá)情況。C.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分析假手術(shù)組、手術(shù)組、右美托咪定組、右美托咪定+手術(shù)組海馬組織促炎細(xì)胞因子TNF-α 表達(dá)情況。與假手術(shù)組相比，*P＜0.05, 與手術(shù)組相比，#P＜0.05

2.2 右美托咪定對手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的海馬促炎因子IL-1β 表達(dá)水平的影響見圖2。

圖2 右美托咪定對手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的海馬IL-1β 表達(dá)水平的影響 A. Western blot 分析假手術(shù)組、手術(shù)組、右美托咪定組、右美托咪定+手術(shù)組海馬組織IL-1β 蛋白表達(dá)情況。B. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分析各組IL-1β 與GAPDH 的比值。與假手術(shù)組相比，*P＜0.05，與手術(shù)組相比，#P＜0.05

2.3 右美托咪定對手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的海馬促炎因子IL-6 表達(dá)水平的影響見圖3。

圖3 右美托咪定對手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的海馬IL-6 表達(dá)水平的影響 A.Western blot 分析假手術(shù)組、手術(shù)組、右美托咪定組、右美托咪定+手術(shù)組海馬組織IL-6 蛋白表達(dá)情況。B.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分析各組IL-6 與GAPDH 的比值。與假手術(shù)組相比，*P＜0.05, 與手術(shù)組相比，#P＜0.05

2.4 右美托咪定對手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的海馬促炎因子TNF-α 表達(dá)水平的影響見圖4。

圖4 右美托咪定對手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的海TNF-α 表達(dá)水平的影響 A.Western blot 分析假手術(shù)組、手術(shù)組、右美托咪定組、右美托咪定+手術(shù)組海馬組織TNF-α 蛋白表達(dá)情況。B.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分析各組TNF-α 與GAPDH 的比值。與假手術(shù)組相比，*P＜0.05，與手術(shù)組相比，#P＜0.05

Western blot 結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，手術(shù)組海馬組織中促炎因子TNF-α 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），而與手術(shù)組相比，右美托咪定+手術(shù)組促炎因子TNF-α 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），表明右美托咪定能夠逆轉(zhuǎn)手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的海馬促炎因子TNF-α 表達(dá)升高。

3 討 論

前期有研究證明，手術(shù)創(chuàng)傷可導(dǎo)致神經(jīng)炎癥，從而進(jìn)一步誘發(fā)認(rèn)知功能障礙［5］。本研究通過建立老年小鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙模型，證明右美托咪定能減輕手術(shù)創(chuàng)傷誘發(fā)的神經(jīng)炎癥，逆轉(zhuǎn)手術(shù)創(chuàng)傷誘發(fā)的促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達(dá)增加。

右美托咪定常在臨床上用于患者的鎮(zhèn)靜，其神經(jīng)保護(hù)作用已被多次證實(shí)［6］。近年來，已被證實(shí)右美托咪定對神經(jīng)認(rèn)知功能具有保護(hù)作用［7］。除了鎮(zhèn)靜作用外，右美托咪定還可能具有抗炎作用，而這被認(rèn)為是其認(rèn)知保護(hù)作用的潛在機(jī)制［8］。另一項(xiàng)研究的結(jié)果表明，外周應(yīng)用右美托咪定可抑制脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥［9］。有研究通過全身使用α2 腎上腺素受體拮抗劑來證明α2 腎上腺素受體在右美托咪定發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)中的作用［4］。右美托咪定可以降低血液中促炎細(xì)胞因子的水平，而促炎細(xì)胞因子是破壞血腦屏障完整性和誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵因素［10］。在阿爾茲海默癥動物模型中，右美托咪定可以通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)保護(hù)神經(jīng)元免受變性［11］。而與以前的研究相一致，本研究結(jié)果提示右美托咪定能減輕手術(shù)創(chuàng)傷誘發(fā)的海馬神經(jīng)炎癥，逆轉(zhuǎn)剖腹探查術(shù)引起的促炎細(xì)胞因子表達(dá)升高。

本研究通過建立剖腹探查術(shù)誘導(dǎo)老年小鼠海馬組織神經(jīng)炎癥模型，發(fā)現(xiàn)手術(shù)前使用右美托咪定預(yù)處理能通過減輕手術(shù)創(chuàng)傷誘發(fā)的促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達(dá)增加，為右美托咪定用于防治術(shù)后認(rèn)知功能障礙提供科學(xué)依據(jù)。