劉道泉

（福州市動物疫病預防控制中心，福建福州 350002）

轉(zhuǎn)移因子（transfer factor，TF）是淋巴細胞釋放的一類細胞因子，不僅具有非特異免疫增強作用，而且還帶有致敏淋巴細胞的特異性免疫信息，具有特異免疫增強作用，可特異地將供體細胞免疫功能轉(zhuǎn)移給受體，進而激發(fā)受體的特異性免疫[1-3]。根據(jù)淋巴細胞來源不同，TF 可分為人胎盤TF、豬胎盤TF、豬脾TF、牛胎盤TF、牛脾TF、羊胎盤TF、羊脾TF、雞脾TF 和鵝脾TF 等。TF 具有可超越種屬界限應(yīng)用、無抗原性和不引起過敏反應(yīng)等優(yōu)點，是具有生物活性的相對分子質(zhì)量小于10 kD 的非均一性小分子混合物，包括多肽、核糖、16～18 種游離氨基酸及多種金屬元素等，具有廣闊的應(yīng)用前景[4-5]。

在提高疫苗免疫效果方面，研究[6-9]顯示，TF可明顯提高豬繁殖與呼吸綜合征病毒活疫苗（CH-1R 株），雞毒支原體弱毒疫苗（F 株），新城疫病毒（NDV）活疫苗（La Sota 株），重組禽流感病毒H5 亞型二價滅活疫苗（Re-6 株+Re-8 株），NDV（La Sota 株）、禽傳染性支氣管炎病毒（M41株）、H9 亞型禽流感病毒（HL 株）三聯(lián)滅活疫苗，雞傳染性法氏囊病毒活疫苗（B87 株）等疫苗的免疫水平，但是缺少TF 在雞群臨床應(yīng)用效果方面的研究。

基于此，為了明確TF 對臨床生產(chǎn)中雞群的安全性、效力和實際使用效果，本研究按照具有自主知識產(chǎn)權(quán)的中國發(fā)明專利[9-11]，以豬脾臟為原料，經(jīng)勻漿、細胞破碎、滅活、微濾、超濾、配置、除菌后，制備豬脾TF，用于雞臨床安全性試驗和臨床有效性試驗。在臨床安全性試驗中，觀察TF 接種后臨床雞群的精神、采食、飲水、糞便和注射部位反應(yīng)情況，記錄并計算雞群的死淘率及產(chǎn)蛋率，剖檢觀察有無組織和器官病變；在臨床有效性試驗中，分別采用NDV 血凝抑制（HI）試驗和淋巴細胞增殖試驗，檢測NDV HI 抗體效價和外周血淋巴細胞刺激指數(shù)（stimulation index，SI），并以NDV HI 抗體效價和淋巴細胞SI 作為指示參數(shù)，用于評價TF 的臨床應(yīng)用效果。本研究通過上述試驗，以期對TF 做出完整、科學、合理的評價，對TF 制備工藝的不足之處進行改進，為TF 的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

1、14 日齡，8、26 周齡愛拔益加（AA+）肉種雞，由福建甲肉種雞場提供并就地開展臨床試驗；1、7、14、21 日齡愛拔益加（AA+）肉雞，由福建乙肉雞場提供并就地開展臨床試驗。

1.2 TF 制備

按照專利[9-11]，以健康豬脾臟為原料，經(jīng)勻漿、細胞破碎、滅活、微濾、超濾、除菌后制備3 批豬脾TF（TF-1～3）。經(jīng)檢驗，TF-1 的多肽含量、核糖含量和脫E 受體活力分別為3.5 mg/mL、72.0 μg/mL 和15%，TF-2 分 別 為3.3 mg/mL、68.0 μg/mL 和14%，TF-3 分 別 為3.1 mg/mL、79.0 μg/mL 和13%。TF-1、TF-2 和TF-3 的D260nm/D280nm比值分別為2.23、2.21 和2.15，在252 nm 波長處均有最大吸收，pH 均為7.0，細菌內(nèi)毒素含量均小于10 EU/mL，蛋白質(zhì)定性檢驗、外源病毒檢驗、支原體檢驗、無菌檢驗、熱原檢驗、異常毒性檢查、過敏反應(yīng)檢查和安全檢驗均合格。

1.3 試劑與儀器

NDV 活疫苗（La Sota 株），購自國內(nèi)某生物制品企業(yè)；標準NDV La Sota 株抗原、陽性對照血清和陰性對照血清，均購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；植物血凝素P（PHA-P）粉劑、四甲基偶氮唑鹽（MTT），均購于美國Sigma 公司；完全RPMI-1640 培養(yǎng)液，購于美國GIBCO 公司；犢牛血清，購自杭州四季青生物工程材料有限公司；淋巴細胞分離液，購自天津灝洋生物工程公司。酶標儀，美國Thermo 公司產(chǎn)品，型號為Multiskan MK3。

1.4 試驗設(shè)計

1.4.1 安全性試驗 將TF-1、TF-2 和TF-3 設(shè)盲隨機抽取，按不同劑量分別肌內(nèi)注射1、14 日齡，8、26 周齡愛拔益加（AA+）肉種雞（共6 110 羽）以及1、7、14、21 日齡愛拔益加（AA+）肉雞（共3 690 羽），進行安全性試驗，同時對肉種雞和肉雞分別設(shè)立不注射的對照組（表1、2）。注射后14 d 內(nèi)，對雞群的應(yīng)激反應(yīng)、精神狀況、采食、飲水、糞便、注射部位反應(yīng)、死淘等情況，每天早晚各觀察1 次，對進入產(chǎn)蛋期的肉種雞記錄產(chǎn)蛋情況。所得死淘率和產(chǎn)蛋率，采用χ2檢驗（chi-square test）分析，P＜0.05 為差異顯著。14 d 觀察期結(jié)束后，從1、14 日齡肉種雞和1、7 日齡肉雞不同注射劑量的試驗組雞群中，各抽取10 只進行剖檢，觀察有無組織和器官病變。

表1 肉種雞安全性試驗設(shè)計

表2 肉雞安全性試驗設(shè)計

1.4.2 效力試驗 將TF-1、TF-2 和TF-3 設(shè)盲隨機抽取與雞NDV 活疫苗（La Sota 株）聯(lián)合免疫 1、14 日齡，8、26 周齡愛拔益加（AA+）肉種雞（共3 648 羽）以及1、7、14、21 日齡愛拔益加（AA+）肉雞（共2 430 羽），進行效力試驗，同時對肉種雞和肉雞分別設(shè)立只免疫雞NDV 活疫苗的對照組（表3、4），所有試驗雞群點眼免疫NDV 活疫苗1.0 羽份。各組各日齡雞群均分別隨機抽取15 羽雞于聯(lián)合免疫后14 和21 d，采血分離血清和外周血淋巴細胞，采用HI 試驗和淋巴細胞增殖試驗，分別測定NDV HI 抗體和淋巴細胞SI。

表3 肉種雞效力試驗設(shè)計

1.5 NDV HI 抗體效價測定

參照出入境檢驗檢疫行業(yè)標準[12]，采用HI試驗進行雞NDV HI 抗體效價測定，測定結(jié)果以log2X表示，計算各聯(lián)合免疫組NDV HI 抗體幾何平均滴度及其與單獨免疫組的差值，并采用單因素方差分析和最小顯著性差法（LSD）進行分析，P＜0.05 為差異顯著。

表4 肉雞效力試驗設(shè)計

1.6 淋巴細胞SI 測定

按照已建立的雞外周血淋巴細胞增殖試驗方法[6]，分別以630 nm 和490 nm 為參考波長和測量波長進行淋巴細胞SI 測定。SI=（試驗組OD490nm-空白組OD490nm）/（對照組OD490nm-空白組OD490nm）。所得數(shù)據(jù)用單因素方差分析和最小顯著性差法（LSD）進行分析，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 安全性試驗

注射后相同條件下隔離喂養(yǎng)。在14 d 的觀察期內(nèi)安全性試驗結(jié)果（表5、6）顯示：安全性試驗組1、14 日齡，8、26 周齡肉種雞群，1、7、14、21 日齡肉雞群，以及安全性對照組雞群，均無應(yīng)激反應(yīng)，其精神狀況、采食、飲水、糞便、注射部位反應(yīng)情況均正常；安全性試驗組雞群剖檢均未發(fā)現(xiàn)組織、器官病變，且雞群死淘率均不高于安全性對照組（P＞0.05）；安全性試驗組26 周齡肉種雞注射后2 周內(nèi)產(chǎn)蛋情況均正常，且產(chǎn)蛋率均高于安全性對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。

表5 肉種雞安全性試驗結(jié)果

2.2 效力試驗

2.2.1 NDV HI 抗體效價 HI 抗體檢測結(jié)果（表7、8）顯示：與單獨免疫組1 相應(yīng)日齡肉種雞相比，免疫后14 d，TF-2 聯(lián)合免疫組肉種雞的NDV HI 抗體幾何平均滴度提高了1.3～1.5，TF-3 聯(lián)合免疫組提高了1.2～1.7；免疫后21 d，TF-2 聯(lián)合免疫組肉種雞群NDV HI 抗體幾何平均滴度提高了1.2～1.6，TF-3 聯(lián)合免疫組提高了1.2～1.4。經(jīng)單因素方差分析和最小顯著性差法（LSD）分析發(fā)現(xiàn)，免疫后14 和21 d，聯(lián)合免疫組間的NDV HI 抗體差異不顯著，但均顯著高于單獨免疫組1（P＜0.05）。與單獨免疫組2 相應(yīng)日齡肉種雞相比，免疫后14 d，TF-1 聯(lián)合免疫組肉雞群的NDV HI 抗體幾何平均滴度提高了1.1～1.3，免疫后21 d 提高了1.2～1.4。經(jīng)單因素方差分析和最小顯著性差法（LSD）分析發(fā)現(xiàn)，免疫后14 和21 d，TF-1聯(lián)合免疫組NDV HI 抗體顯著高于單獨免疫組2（P＜0.05）。

表6 肉雞安全性試驗結(jié)果

表7 肉種雞NDV HI 抗體效價 單位：log2

表8 肉雞NDV HI 抗體效價 單位：log2

2.2.2 淋巴細胞SI 淋巴細胞SI 測定結(jié)果（表9、10）顯示：免疫后14 和21 d，TF-2、TF-3 聯(lián)合免疫組各日齡肉種雞的淋巴細胞SI 差異均不顯著，但均顯著高于單獨免疫組1（P＜0.05）；TF-1 聯(lián)合免疫組各日齡肉雞的淋巴細胞SI 均顯著高于單獨免疫組2（P＜0.05）。與單獨免疫組1相比，TF-2 聯(lián)合免疫組肉種雞淋巴細胞SI，免疫后14 d 提高了0.322～0.528，免疫后21 d 提高了0.399～0.632；TF-3 聯(lián)合免疫組免疫后14 d 提高了0.243～0.462，免疫后21 d 提高了0.431～0.479。與單獨免疫組2 相比，TF-1 聯(lián)合免疫組肉雞淋巴細胞SI 免疫后14 d 提高了0.376～0.448，免疫后21 d提高了0.322～0.471。與單獨免疫組相比，聯(lián)合免疫組的淋巴細胞SI 均提高明顯（P＜0.05）。

表9 肉種雞淋巴細胞SI 測定結(jié)果

表10 肉雞淋巴細胞SI 測定結(jié)果

3 討論

TF 是一種具有免疫增強作用且安全的新型免疫制劑[13-18]。為進一步明確TF 對臨床生產(chǎn)中雞群的安全性、效力和實際使用效果，本研究選取了6 110 羽肉種雞、3 690 羽肉雞，共9 800 羽雞用于安全性試驗，選取了3 648 羽肉種雞、2 430 羽肉雞，共6 078 羽雞用于效力試驗，研究結(jié)果可為TF 的生產(chǎn)實際臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

本試驗TF 采用具有自主知識產(chǎn)權(quán)的TF 制備與檢驗技術(shù)獲得，通過原料外源病毒檢驗技術(shù)、滅活工藝技術(shù)、超濾純化技術(shù)等制備技術(shù)獲得了無外源病毒、細菌和無支原體污染，內(nèi)毒素含量小于10 EU/mL、相對分子質(zhì)量小于10 kD 的TF，并經(jīng)家兔熱原檢查、小鼠異常毒性檢查和豚鼠過敏反應(yīng)等檢驗技術(shù)檢測合格，確保了TF 的安全性[9-11]。前期研究[6-8]已初步驗證了所制備豬脾TF 的安全性。本次臨床安全性試驗發(fā)現(xiàn)，在14 d 的觀察期內(nèi)，安全性試驗組和對照組雞群均無應(yīng)激反應(yīng)，其精神狀況、采食、飲水、糞便、注射部位反應(yīng)情況均正常，剖檢均無組織、器官病變，且安全性試驗組雞群的死淘率并不高于安全性對照組，安全性試驗組肉種雞群產(chǎn)蛋情況均正常。上述結(jié)果表明，肌內(nèi)注射TF 對肉種雞和肉雞的安全性良好。與此結(jié)果類似，山東省畜牧總站的相關(guān)研究也證明了TF 的安全性[19]。

1949 年，Lawrence 首次發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌素陽性供者的活淋巴細胞能使皮試陰性受者轉(zhuǎn)變?yōu)槠ぴ囮栃浴?953—1955 年，Lawrence 等將結(jié)核菌素陽性供者的白細胞可透析物質(zhì)重復試驗后發(fā)現(xiàn)，白細胞可透析物質(zhì)具備活淋巴細胞同樣的功能，即其提取物仍具有轉(zhuǎn)移遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的作用，并把引起這種效應(yīng)的物質(zhì)稱為“轉(zhuǎn)移因子”[1，3]。后續(xù)研究[2]顯示，TF 進入機體后可使造血系統(tǒng)迅速產(chǎn)生大量白細胞，并活化淋巴細胞，進一步促進T 淋巴細胞分化，從而促進Th細胞產(chǎn)生，增強機體的免疫功能。HI 試驗和淋巴細胞增殖試驗是檢測機體體液免疫水平和細胞免疫功能的主要檢測方法[6]。本研究選擇HI 試驗和淋巴細胞增殖試驗用于TF 的臨床有效性試驗。結(jié)果顯示，免疫后14 d，聯(lián)合免疫組NDV HI 抗體滴度比單獨免疫組提高了1.1～1.7，淋巴細胞SI 提高了0.243～0.528；免疫后21 d，聯(lián)合免疫NDV HI 抗體滴度比單獨免疫組提高了1.2～1.6，淋巴細胞SI 提高了0.322～0.632。研究結(jié)果表明，TF可提高肉種雞和肉雞的NDV HI 抗體滴度和淋巴細胞SI，具有免疫增強作用，這與前期研究[6-8]結(jié)果接近。

本研究通過TF 的臨床安全性和有效性試驗，明確了TF 對臨床肉種雞群和肉雞群具有良好的安全性，并具有增強雞群免疫功能的作用。TF 已成為人類臨床上免疫抑制疾病的標準療法，且被廣泛用作輔助藥物。隨著我國規(guī)?；?、集約化養(yǎng)雞業(yè)的迅速發(fā)展，雞病的復雜程度和免疫抑制病的控制難度將會逐年增加，因此TF 將具有廣闊的市場前景。

致謝：

福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所黃瑜研究員，福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院和派生特（福州）生物科技有限公司共建福建省動物保健與食品安全應(yīng)用技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心的楊慧教授、徐磊博士、劉毅發(fā)獸醫(yī)師、鐘云欽獸醫(yī)師、蔣鈴獸醫(yī)師和謝杼倢獸醫(yī)師，對該試驗提供了指導和幫助。