邵衛(wèi)星,蓋文燕,左媛媛,孫明軍,焉 鑫,孫世雄,劉蒙達,張研博
(1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心,山東青島 266032;2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院,山東濰坊 261061)
布魯氏菌?。ê喎Q“布病”)是由布魯氏菌引起的一種嚴重威脅動物和人類健康的全球性重要人獸共患病。本病主要引起動物流產(chǎn)、不孕和不育,以致降低生產(chǎn)性能。人感染布魯氏菌后主要表現(xiàn)為波浪熱、關節(jié)痛、肌肉痛和不育;如果不及時治療可轉(zhuǎn)為慢性,往往難以治愈。世界動物衛(wèi)生組織(WOAH)將其列為須通報的多種動物疫病,我國將其列為二類動物疫病。近年來,我國畜間和人間布病疫情持續(xù)加重,病例數(shù)量一直維持高位,每年因患布病導致的流產(chǎn)和產(chǎn)奶量下降給奶牛業(yè)帶來很大經(jīng)濟損失。在開展布病診斷、監(jiān)測、陽性動物篩查等工作時,虎紅平板凝集試驗(rose bengal test,RBT)是一種必不可少的、經(jīng)典的常規(guī)抗體檢測方法,尤其在人力、財力和物力有限地區(qū),RBT 以其操作簡單、不需特殊儀器設備、獲得結果快、結果直觀、成本低等優(yōu)點而被廣泛使用[1];但在實際應用中,由于對其特性缺乏足夠了解和認識,常出現(xiàn)檢測結果不準確、結果解釋不規(guī)范等問題而導致被“誤用”,從而影響了RBT 在布病防控中所應起到的作用。本文將從動物感染布魯氏菌后產(chǎn)生抗體的種類及特點,凝集反應中存在的“前帶現(xiàn)象”和非特異性反應,以及RBT 的特性,陽性結果需“確證”及不同臨床情形下的應用5 個方面進行闡述,使相關職業(yè)人員能認識和理解RBT特點,在布病防控中能合理解釋和應用其檢測結果,避免RBT 被“誤用”,以利于發(fā)揮其應有的作用。
布魯氏菌是細胞內(nèi)寄生菌,可誘導機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫。在血清、乳汁、陰道分泌物、關節(jié)水瘤液和精液中都含有布魯氏菌抗體[2]。光滑型布魯氏菌(通常為牛種、羊種和豬種布魯氏菌)感染動物后,細菌脂多糖(S-LPS)能誘導機體產(chǎn)生強烈的、不同抗體類型的體液免疫反應。例如,牛感染牛種布魯氏菌后產(chǎn)生的抗體類型包括IgM、IgG1、IgG2 和少量的IgA,但以IgG1 為主。感染布魯氏菌后,不同類型抗體出現(xiàn)的先后順序不同,一般先產(chǎn)生IgM,然后很快轉(zhuǎn)換為產(chǎn)生IgG??贵w類型轉(zhuǎn)換需要的時間很短,如犢牛和成年牛可分別在感染后4 d 和7 d 內(nèi)完成抗體類型轉(zhuǎn)換[3-4]。在正常生理條件下,IgM、IgG 和IgA 可分為凝集抗體、非凝集抗體和阻斷抗體。一般來講,凝集抗體包括IgM、IgG 和IgA,非凝集抗體包括大部分IgG1 和血清中部分IgA(不包括奶中的IgA)。一些血清還含有所謂的“阻斷抗體”。該抗體是非凝集抗體的一個亞類,與凝集抗體共存,在正常生理條件下可以阻止凝集抗體發(fā)生凝集。當血清中的“阻斷抗體”效價過高時,就不發(fā)生凝集反應和沉淀反應。動物感染布魯氏菌(包括疫苗接種)后,首先產(chǎn)生凝集抗體,達到峰值后逐漸被非凝集抗體取代[5]。
在體外生理(生理pH 和離子濃度)條件下,布魯氏菌與陽性血清發(fā)生的凝集反應會受到阻斷抗體影響,出現(xiàn)所謂的“前帶現(xiàn)象”,即在抗體濃度高的時候,反而出現(xiàn)非凝集現(xiàn)象。但血清經(jīng)過稀釋,降低了阻斷抗體的滴度,可使阻斷凝集反應的效應消失[5]。實際上,含有高滴度IgM 或凝集抗體的血清一般不會產(chǎn)生“前帶現(xiàn)象”,通常只在加熱處理一些血清(為排除IgM 干擾)時才出現(xiàn)。這表明“前帶現(xiàn)象”是凝集抗體(IgM、IgG 和IgA)和非凝集抗體(IgG1 和IgA 部分)之間競爭的結果。這兩類抗體在血清中的滴度和親和力,隨動物感染布魯氏菌的時間進程而不同。因此,“前帶現(xiàn)象”可降低凝集試驗的診斷敏感性(DSe)。
在體外生理條件(生理pH 和離子濃度)下,凝集反應還會受到非特異性凝集反應影響。非特異性凝集主要來自兩個方面:一方面來自布魯氏菌抗原與血清中其他抗原的IgM 抗體發(fā)生非特異性凝集反應。據(jù)估計,約0.6%無布魯氏菌感染牛的血清(布魯氏菌抗體陰性)在1:100 及以上稀釋時,可對光滑型(S 型)布魯氏菌產(chǎn)生凝集反應。研究[6]表明,沒有感染布魯氏菌的小母牛血清中含有的IgM,在ELISA 試驗中也可以與布魯氏菌脂多糖(LPS)結合,其中與粗糙型菌(R 型)LPS的結合強度比與S 型菌的高。這一非特異性結合現(xiàn)象在大腸桿菌和假單胞桿菌中也存在。出現(xiàn)非特異性凝集反應的原因是,血清中的非布魯氏菌抗體IgM 通過其Fc 部分,能夠識別布魯氏菌和其他革蘭氏陰性菌的LPS 核心脂質(zhì)A(lipid A-core)上共有的抗原決定簇[7]。如果抗原懸液中含有裂解的布魯氏菌,就會加重這種非特異性凝集。另一方面是因為布魯氏菌胞外多糖(OPS)與一些革蘭氏陰性菌的OPS 存在抗原交叉。在這些細菌中,小腸結腸炎耶爾森氏菌血清型O:9(Y.O:9)可與布魯氏菌OPS 產(chǎn)生強的交叉反應,是布魯氏菌抗體檢測中出現(xiàn)假陽性反應(FPSR)的最常見因素。Y.O:9可感染牛、豬,也可感染綿羊。在反芻動物中,引起布魯氏菌抗體FPSR 的細菌可能還有大腸桿菌O:157 和沙門氏菌群N(O:30),但這些細菌表現(xiàn)出的抗原交叉反應性較低[8-10]。盡管霍亂弧菌O:1和一些嗜麥芽窄食單胞菌的OPS 中也攜帶有N-替代的過氧胺[11],但從來沒有報道過其在反芻動物中可引起FPSR。因而,很難確定引起FPSR 的所有來源[12]。
為消除凝集反應中的“前帶現(xiàn)象”和非特異性反應,人們采取了多種措施,來降低或排除血清中IgM 對凝集反應的干擾。常用方法包括:向血清中加入EDTA 和利凡諾,優(yōu)先沉淀IgM;對血清加熱,向血清中加入硫醇或酸化血清,使血清中的IgM 變性。在這些措施中,使血清酸化是消除“前帶現(xiàn)象”和非特異性凝集反應的最有效方法,但對因存在抗原交叉(如耶爾森菌O:9)細菌感染產(chǎn)生的非特異性凝集反應無效。
為了區(qū)分特異性凝集和非特異性凝集,Rose 和Roepke 在1957 年報道了一種經(jīng)過改進的RBT。他們發(fā)現(xiàn),在檢測前將所用的抗原緩沖液處于pH4.0 條件下,可抑制牛種布魯氏菌抗原與牛血清的非特異性反應,而血清中的布魯氏菌抗體活性卻基本不受影響。向血清中加入弱酸,使血清pH在3.7~4.1 范圍內(nèi),可最大程度消除非特異性凝集;pH 在3.8~4.2 范圍內(nèi),牛血清的緩沖能力最強。乳酸和醋酸對酸化牛血清最有效[13]。由于直接酸化血清不方便操作,改為酸化RBT 抗原,當抗原與血清混合時,血清得到酸化,從而達到抑制非特異性凝集反應的目的。RBT 抗原經(jīng)過酸化處理,可有效消除凝集反應中的“前帶現(xiàn)象”,這是由于存在非布魯氏菌抗體IgM,從而使產(chǎn)生的非特異性反應大大降低。盡管在pH3.8~4.2 范圍內(nèi),酸化抗原可以極大減少非特異性凝集反應,但該條件下抗原不穩(wěn)定,為此1965 年美國農(nóng)業(yè)部(USDA)國家動物疫病實驗室對酸性平板凝集試驗進行修改,采用虎紅染料對牛種布魯氏菌懸液染色,并將緩沖液pH 調(diào)整為3.65[14]。該試驗方法在美國稱為卡片試驗(card test),而在其他國家,如法國、英國等,稱為虎紅平板試驗(RBPT),后來簡稱RBT[15-16]。研究[17]發(fā)現(xiàn),在pH3.65 條件下,IgG1 的非凝集特性轉(zhuǎn)變?yōu)槟苣剪斒暇?。IgG1 凝集能力改變的原理并不清楚,推測可能是在酸性條件下,打開了IgG1 的鉸鏈區(qū),使抗體分子變?yōu)槎r,使其具有凝集布魯氏菌的能力;診斷實驗室在持續(xù)檢測中發(fā)現(xiàn),在pH3.65 條件下開展RBT 檢測,血清中存在的阻斷凝集效應和相關的“前帶現(xiàn)象”也消失了。
制備RBT 抗原所用的菌株、培養(yǎng)菌的批次,特別是抗原濃度,能對RBT 性能(敏感性和特異性)造成很大影響。為使RBT 性能保持一致,需用參考血清對不同菌株和批次的RBT抗原進行標準化,這是非常重要的。世界動物衛(wèi)生組織(WOAH)的參考血清被認定為國際標準血清,是所有其他標準血清(如國家標準血清、工作標準血清)進行校準的依據(jù)。用國家標準血清對RBT 抗原進行標準化,可使不同廠家制備的RBT 抗原達到統(tǒng)一標準,使檢測結果在國內(nèi)具有一致性。但需要注意的是,抗原標準化并不一定意味著RBT 具有最佳的診斷敏感性(DSe)和診斷特異性(DSp),還需用血清盤進行驗證,以獲得最佳檢測性能。
常用的RBT 抗原標準化方法是,將牛種標準陽性血清用0.5%石碳酸生理鹽水或生理鹽水進行1/45 和1/55 比例稀釋,按RBT 試驗程序檢測,抗原應與1/45 比例稀釋的標準血清發(fā)生清晰的凝集反應,但不與1/55 比例稀釋的標準血清發(fā)生可見的凝集反應[1]。用該方法標化的RBT 抗原在檢測小反芻動物(如山羊、綿羊等)血清時,會降低其敏感性,與補體結合試驗(CFT)檢測結果存在偏差[18],因此,當RBT 用于檢測小反芻動物血清時,為提高敏感性,可將血清和抗原的體積比改為3:1(如分別為 75 μL 和25 μL),而不是標準操作程序中的1:1,但該方法并不適用于檢測牛和豬血清。
經(jīng)過抗原酸化的RBT,其診斷性能得到大大提高,在診斷布魯氏菌感染方面,比試管凝集試驗(SAT)更準確。
具體表現(xiàn)在:一是診斷特異性得到提高,這是因為消除了由非布魯氏菌抗體IgM 引起的非特異性凝集反應;二是診斷敏感性也大大提高,對于某些血清樣品,SAT 檢測(生理條件下pH7.2~7.4)結果為陰性,而用RBT 檢測,結果可能為陽性(這是因為抗原酸化的RBT 不再受“前帶現(xiàn)象”影響,因此比SAT 的敏感性高);三是能更早地檢測出感染布魯氏菌動物,由于部分布魯氏菌抗體IgM在酸性條件下仍然具有活性,能與RBT 抗原發(fā)生凝集反應,因此比其他試驗方法,如補體結合試驗(CFT)、間接ELISA,能更早地檢測出感染布魯氏菌動物。
不同廠家生產(chǎn)的RBT 抗原凝集IgG2 和IgM的能力不同,但是都能有效凝集IgG1,這使得RBT 的檢測結果與CFT 結果有非常好的一致性(因為CFT 也是檢測IgG1)。研究[15]表明:將聯(lián)合使用CFT 和SAT 獲得的試驗結果與RBT 結果進行比較,可獲得90.8%的一致性,隨后又證明一致性可高達97%;以聯(lián)合使用SAT 和CFT 的檢測結果作為“金標準”,RBT 的敏感性和特異性可分別達到96%和97%,從而說明抗原酸化的RBT具有更好的檢測性能。RBT 已成功用于美國和歐洲布病根除計劃中。但在酸性條件下,抗體與抗原的結合強度降低,與其他方法(如CFT)比較,對于抗體效價低的血清,能降低RBT 的分析靈敏性(最小檢出能力),但不會對敏感性造成不良影響[19]。需要注意的是,必須在抗原與血清混合后4 min 內(nèi)判讀結果,如果時間延長,有時就會因為出現(xiàn)纖維蛋白凝塊而導致假陽性。
RBT 無法區(qū)分S 型布魯氏菌疫苗免疫產(chǎn)生的抗體和野生布魯氏菌感染誘導的抗體。在免疫情況下,RBT 的特異性大大降低。在20 世紀60 年代末,人們發(fā)現(xiàn)犢牛接種S19 疫苗后12 個月,用RBT 進行檢測,還有相當比例的牛能被檢測出疫苗抗體,但是用CFT 檢測,在免疫后幾個月(通常6~8 個月)就檢測不出疫苗抗體。在免疫狀況下,由于CFT 比RBT 特異性高,在實際檢測工作中,開始將CFT 與RBT 聯(lián)合使用,即用CFT 對RBT 陽性結果進行確證[20],以增加檢測的特異性,減少疫苗抗體陽性動物被“冤殺”。因此,在疫苗接種的情況下,CFT 成為RBT 陽性結果的“確認性”檢測方法,并在一些國家被推薦使用[1]。這就是在免疫情形下RBT 陽性結果需進行“確證性”檢測的起因。
在實際檢測中,對RBT 陽性結果需再次進行“確證性”檢測這一做法常存在誤用,即無論流行病學背景如何以及是否免疫接種,RBT 陽性結果都必須用CFT 或其他檢測方法(如iELISAs、cELISAs、SAT)進行“確證性”檢測。根據(jù)歷史經(jīng)驗和近期研究,在沒有接種疫苗的情況下,RBT的敏感性和特異性較高,均超過95%[21-22]。因此,在布病流行地區(qū)(或養(yǎng)殖場),對于非免疫動物,特別是為評估群體流行率而開展抗體檢測時,RBT陽性結果無需用其他方法進行確證。一些國家實施S19 疫苗接種和聯(lián)合使用RBT-CFT 進行檢測的防控策略,成功根除了牛群中的布病。該策略之所以能成功,是因為這些國家具有良好的基礎條件,能對可疑畜群(群中存在RBT 陽性,但CFT 為弱陽性的動物)不斷進行重復檢測,跟蹤這些可疑動物CFT 抗體滴度的變化,從而做出準確診斷。盡管如此,該策略也不可避免地導致相當比例的接種疫苗動物被認為感染了布魯氏菌而被“冤殺”,增加了額外的資金補償。
我國現(xiàn)行的《動物布魯氏菌病診斷技術》(GB/T18648—2018)將SAT 作為RBT 陽性結果的確證方法,但有研究[15]表明,用SAT 檢測接種S19 疫苗牛血清,其特異性并不高。一些成功實施牛群布病根除計劃國家的經(jīng)驗表明,SAT(或含巰基乙醇的SAT)并不能很好區(qū)分野生布魯氏菌感染抗體和S19 疫苗抗體[15-16]。同時,必須注意到,SAT 只能檢測血清中的IgM 和凝集抗體,而這二類抗體通常在動物感染布魯氏菌的早期產(chǎn)生,因此SAT 更適于早期感染的檢測,而不適合感染后期的檢測,特別是不適合對慢性感染動物的檢測。但RBT 不存在上述問題。在一項研究[23]中,比較了幾種檢測方法,結論是RBT 和iELISAs 敏感性高,而SAT 是一種較差的檢測方法。WOAH 的《陸生動物診斷試驗與疫苗手冊》(2020 年版)中有關SAT 的描述是,在國際貿(mào)易中用SAT 診斷布病,結果通常是不可靠的。在該手冊的“牛種、羊種和豬種布魯氏菌感染的診斷方法”列表中,明確指出SAT 不適用于疑似或臨床病例的確證[1]。
根據(jù)RBT 特性,自1966 年,它作為一種布病篩選試驗而被廣泛使用。在一個國家、地區(qū)或養(yǎng)殖場實施布病預防、控制或凈化措施時,RBT 主要用于以下幾種情形。
在實施布病防控措施前,評估當?shù)貏游锶翰疾×餍新剩ㄔ趥€體水平,更重要的是在群體水平上)對于評估布病在當?shù)卦斐傻奈:σ约皼Q定采取哪種干預策略至關重要[24-26]。在資源有限地區(qū)(通常指自由放牧和輪牧飼養(yǎng)模式,但有時也包括中小規(guī)模密集飼養(yǎng)模式),RBT 以其操作簡單、價格便宜、結果易判定的特點而成為評估流行率最實用的檢測方法[27-28]。
在全面免疫(所有動物都進行免疫接種)情形下,評估疫苗接種的有效性是首要目標,而將檢測和撲殺布魯氏菌感染動物作為次要目標??贵w陽轉(zhuǎn)率是評估疫苗接種有效性的重要指標。接種疫苗2~3 周后,用RBT 檢測接種疫苗(S 型)動物,評估抗體陽轉(zhuǎn)率。長期實踐經(jīng)驗表明,接種動物的抗體陽轉(zhuǎn)率達70%~90%(如果經(jīng)眼結膜途徑接種,抗體陽性率會低一些,一般在60%以上),證明本次疫苗接種有效;如果接種動物的抗體陽轉(zhuǎn)率低于50%,表明疫苗接種效果不良,不能提供足夠的免疫保護[29-30]。
當采用“免疫+檢測+撲殺”防控策略時,一般只對未成年動物進行免疫,在動物性成熟后(牛一般在接種后12 個月,羊一般在接種后6 個月)用RBT 進行檢測。檢測的目的是初篩布魯氏菌感染動物。在免疫情形下,RBT 的特異性會下降。為排除疫苗抗體對RBT 結果造成的干擾,需用特異性更高的確證性試驗(如CFT 和HN 瓊脂擴散試驗等)[29]或補充性試驗(如iELSA、cELISA、FPA 等)[27],對RBT 檢測為陽性的血清樣品進行再次檢測,確證動物是否感染野生布魯氏菌,以減少疫苗抗體陽性動物被“冤殺”。在此情形下,選擇合適的檢測時機也非常重要。檢測時機通常與接種動物的日齡、劑量、途徑、頻次及疫苗的菌株等因素有關,而且需有經(jīng)驗的流行病學專家根據(jù)當?shù)夭疾×餍械木唧w情況,確定合適的檢測時機[31-32]。
對于無布魯氏菌感染的動物群,可將RBT 作為一種群體水平的篩查方法,在適當時機(一般1年2 次)對全群動物進行檢測,證明無布病,即可確定動物群無布魯氏菌感染[1],以維持動物群的無疫狀態(tài)。在這種情形下,對于RBT 檢測出的陽性動物,一般需用病原學方法(如細菌分離鑒定、熒光PCR 等)在合適的時機(如產(chǎn)后1 個月內(nèi))重新采集樣品,進行確證檢測(因為此時血清學檢測方法的陽性預測值非常低,即陽性結果的可靠性低),以提高檢測的特異性。
作為一種經(jīng)典的常規(guī)方法,RBT 是常用的布魯氏菌抗體檢測方法之一。RBT 經(jīng)過抗原酸化處理后,其敏感性和特異性大大提高。在免疫或布病流行率很低的情況下(流行率幾乎接近于0),RBT 檢測出的陽性動物需用特異性更好的“確證性”或“補充性”試驗進行再次檢測,以盡可能減少疫苗抗體對布病檢測結果的干擾,或FPSR 對可疑病例確診造成的影響。但在布病流行地區(qū),對于非免疫動物,無需對RBT 檢測出的陽性樣品進行再次確證。應根據(jù)不同的臨床情形正確選擇使用RBT,避免被“誤用”。應選用經(jīng)過標準化的RBT 抗原試劑,否則會影響RBT 性能(敏感性和特異性)和檢測結果的正確性。認識和了解RBT的特性,根據(jù)不同臨床情形正確解釋和應用檢測結果,不但可以降低布病檢測成本,而且可極大發(fā)揮RBT 在布病防控中的作用。