楊偉輝， 賀鑫， 丁丹妮

miR-889-3p調(diào)控vimentin乙酰化對妊娠糖尿病胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲功能的影響*

楊偉輝△， 賀鑫， 丁丹妮

［湖南省人民醫(yī)院（湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院）產(chǎn)科，湖南 長沙 410000］

探討微小RNA-889-3p（miR-889-3p）調(diào)節(jié)妊娠糖尿?。℅DM）胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲功能的作用機制。將2020年1～12月的30名GDM產(chǎn)婦和30名正常葡萄糖耐量產(chǎn)婦選入本研究。通過qRT-PCR檢測miR-889-3p在產(chǎn)婦胎盤、人腫瘤細(xì)胞系、人滋養(yǎng)層HTR-8/SVneo細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）中的表達水平。進行細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、MTT測定、EdU檢測、傷口劃痕實驗和Transwell實驗，以確定miR-889-3p的沉默和過表達對HTR-8/SVneo細(xì)胞生物功能的影響。通過生物信息學(xué)分析確定miR-889-3p與波形蛋白（vimentin）的結(jié)合關(guān)系。分別使用雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)和蛋白質(zhì)印跡分析miR-889-3p過表達對雙螢光素酶活性和vimentin乙酰化的影響。HTR-8/SVneo細(xì)胞的相對miR-889-3p表達水平高于其他腫瘤細(xì)胞和HUVEC，GDM產(chǎn)婦胎盤的相對miR-889-3p表達水平低于正常葡萄糖耐量產(chǎn)婦胎盤（<0.05）。miR-889-3p過表達抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞生長、遷移和侵襲（<0.05），而miR-889-3p敲減促進細(xì)胞生長、遷移和侵襲（<0.05）。通過生物信息學(xué)分析確定vimentin是miR-889-3p的直接靶點。在轉(zhuǎn)染vimentin-WT的HTR-8/SVneo細(xì)胞中，miR-889-3p模擬物的施用抑制了螢光素酶活性（<0.05），并顯著提高vimentin乙酰化水平（<0.05）。上調(diào)vimentin部分拮抗miR-889-3p過表達對細(xì)胞生長、遷移和侵襲的抑制作用（<0.05），而下調(diào)vimentin減弱了由miR-889-3p敲減誘導(dǎo)的細(xì)胞生長、遷移和侵襲增強（<0.05）。胎盤組織中miR-889-3p的下調(diào)參與GDM病理過程。miR-889-3p通過促進vimentin乙?；瘉頊p弱滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲功能。

微小RNA-889-3p；波形蛋白；妊娠糖尿?。惶ケP；細(xì)胞侵襲

妊娠糖尿?。╣estational diabetes mellitus， GDM）是妊娠期最常見的并發(fā)癥之一，定義為妊娠期出現(xiàn)或首次出現(xiàn)的任何程度的葡萄糖不耐受［1］。GDM有多種致病因素，可能是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。然而，GDM的確切發(fā)病機制仍需進一步研究。研究表明，胎盤功能障礙與GDM的發(fā)病機制有關(guān)，因為GDM相關(guān)的高血糖可以在胎盤分娩后得到解決［2］。絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞（extravillous trophoblast， EVT）是胚胎的重要組成部分，它侵入母體蛻膜和子宮內(nèi)膜以重塑螺旋動脈［3］。具有正常生物學(xué)功能的EVT對胎盤發(fā)育至關(guān)重要；如果EVT的功能過度或不足，可能會導(dǎo)致妊娠并發(fā)癥，包括GDM［4］。因此，針對EVT功能障礙的研究可能是探索GDM發(fā)病機制的有效策略。微小RNA（microRNA， miRNA， miR）是一類單鏈小分子非編碼RNA，在進化過程中高度保守，并在表觀遺傳學(xué)水平上發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用［2］。近年來，越來越多研究證實miRNA在GDM的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用［5-6］。Shah等［7］使用miRNA芯片篩選GDM和正常對照組胎盤中差異表達的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-889-3p在胎盤中差異表達，但miR-889-3p在GDM中的功能和分子機制尚不清楚。已有研究證實，miR-889-3p通過靶向波形蛋白（vimentin）參與抑制肺癌細(xì)胞的侵襲［8］。vimentin是參與細(xì)胞滋養(yǎng)層侵襲過程的最保守和最豐富的蛋白質(zhì)之一，并經(jīng)歷各種重要的翻譯后修飾，如磷酸化、糖基化、磺?；鸵阴；?］。然而，尚未明確miR-889-3p介導(dǎo)的vimentin在滋養(yǎng)層中的作用。因此，本研究分析了GDM患者胎盤組織中miR-889-3p水平的變化，并進一步觀察其對滋養(yǎng)層細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以期為GDM的治療提供參考資料。

材料和方法

1　胎盤樣本采集

本研究于2020年1～12月，參照美國糖尿病協(xié)會推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)［10］，共納入30例GDM產(chǎn)婦。診斷后，所有GDM孕婦都接受飲食和鍛煉的指導(dǎo)。孕婦自行調(diào)整飲食活動1周后，抽靜脈血查血糖，根據(jù)血糖值進一步指導(dǎo)調(diào)整膳食及體力活動方案，并進行家庭血糖監(jiān)測。若空腹血糖和餐后2 h的血糖水平控制不滿意（空腹血糖>5.3 mmol/L，餐后2 h血糖>6.7 mmol/L），則進行胰島素治療。本研究無GDM孕婦接受胰島素治療。此外，選取大約在同一時間懷孕，口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test， OGTT）結(jié)果正常，并且沒有產(chǎn)科并發(fā)癥的30例產(chǎn)婦作為對照。所有研究對象均對本研究知情同意，本研究獲湖南省人民醫(yī)院（湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院）倫理委員會批準(zhǔn)同意。

收集位于臍帶插入部位近端2 cm處的胎盤小葉（從基底層到滋養(yǎng)層）并用等滲溶液沖洗，然后將這些組織塊在液氮中冷凍并儲存在-80 ℃用于提取總RNA。為確保樣本間的可比性和均一性，所有胎盤樣本均采集自分娩足月嬰兒后的產(chǎn)婦，并因母體要求、臀位或子宮瘢痕而接受剖宮產(chǎn)且無其他相關(guān)疾?。ㄈ绺哐獕?、孕前糖尿病等）。

2　細(xì)胞培養(yǎng)

人滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/SVneo購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，維持在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中。該細(xì)胞系最初由孕早期的絨毛外植體產(chǎn)生，被認(rèn)為是人類絨毛外滋養(yǎng)層的代表性模型［11］，已被用作替代模型來研究妊娠和妊娠相關(guān)疾病中的胎盤功能。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umlibical vein endothelial cells， HUVEC）購自ATCC，接種于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液。人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和HCC1937，人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3和SKOV3，以及人胰腺癌細(xì)胞系MIAPACA2和BXPC3均購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，接種于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液。所有細(xì)胞進行傳代培養(yǎng)，取第3代用于實驗。

3　主要試劑和儀器

胎牛血清、青霉素-鏈霉素和RPMI-1640培養(yǎng)液均購自Gibco；pGL3對照載體、Trizol試劑和Lipofectamine 2000均購自Invitrogen；TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit和TaqMan Univel PCR Master Mix均購自Applied Biosystems；MTT購自Promega；二甲基亞砜、蘇木精和伊紅均購自Sigma-Aldrich；Cell-LightTMEdU Apollo?567體外成像試劑盒購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自Corning；Matrigel購自BD；PVDF膜購自Amersham；兔抗vimentin、沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1， Sirt1）和乙?；痸imentin（acetylated vimentin， Ac-vimentin）多克隆抗體均購自Cell Signaling Technology；小鼠抗GAPDH單克隆抗體購自Abcam；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）偶聯(lián)的山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG購自Jackson ImmunoResearch Laboratories；ECL試劑購自Millipore；pmirGLO載體和雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)購自Promega。

LSM 710 META激光掃描共聚焦顯微鏡購自Carl Zeiss；BX61顯微鏡購自O(shè)lympus；X射線膠片購自Kodak；Model 3550 96孔板讀數(shù)器和Quantity One分析系統(tǒng)購自Bio-Rad。

4　主要方法

4.1質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染將野生型（wild-type， WT）vimentin 3'非翻譯區(qū)（3'-untranslated region， 3'-UTR）和vimentin 3'-UTR突變（mutant， MUT）序列通過PCR擴增（vimentin-WT的上游引物序列為5'-CCGCTCGAGCCCTCCAGACATGCACTTAC-3'，下游引物序列為5'-GCTCTAGACCTACCAAGGTGAGGTCTTTATG-3'；vimentin-MUT的上游引物序列為5'-GCTTTCTTTCTACAGATTTTACTACTCTTGGTCT-3'，下游引物序列為5'-TAGTAAAATCTGTAGAAAGAAA? GCTGGGGGGTAA-3'）。用I和I雙酶切后，將PCR產(chǎn)物克隆到pGL3對照載體。將vimentin序列的編碼區(qū)擴增并克隆到pcDNA3.1載體中，命名為pcDNA3.1-vimentin。所有構(gòu)建體均通過DNA測序驗證。用于RNA干擾實驗的vimentin siRNA和scrambled siRNA購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。miR-889-3p mimic、mimic control、miR-889-3p inhibitor和inhibitor control由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，并通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。

4.2qRT-PCR檢測miR-889-3p表達用Trizol試劑分離來自人胎盤的總RNA，然后用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit和TaqMan Univel PCR Master Mix通過qRT-PCR檢測miR-889-3p的表達。通過2-ΔΔCt法將目標(biāo)基因的表達水平歸一化為相對于核小RNA U6的表達水平。miR-889-3p的上游引物序列為5'-GTTGCTCCTGTCAGTTTGTCAAA-3'，下游引物序列為5'-TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC-3'；U6的上游引物序列為5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，下游引物序列為5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。

4.3MTT法檢測HTR-8/SVneo細(xì)胞活力將HTR-8/SVneo細(xì)胞接種在96孔板中（每孔5 000個細(xì)胞）并使其附著過夜。用50 nmol/L miR-889-3p模擬物、miRNA模擬物陰性對照、miR-889-3p抑制物或miRNA抑制物陰性對照轉(zhuǎn)染細(xì)胞。48 h后，向每個孔中加入20 μL MTT（5 g/L）并在37 ℃下孵育4 h。然后去除上清液，并將150 μL二甲基亞砜添加到每個孔中。用96孔板讀數(shù)器在570 nm處記錄吸光度值。

4.4EdU法檢測HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖能力使用Cell-LightTMEdU Apollo?567體外成像試劑盒。轉(zhuǎn)染50 nmol/L miR-889-3p模擬物、miRNA模擬陰性對照、miR-889-3p抑制物或miRNA抑制物陰性對照48 h后，將HTR-8/SVneo細(xì)胞在37 ℃下暴露于50 μmol/L EdU 2 h。然后用Hoechst 33342對細(xì)胞核進行染色。在LSM 710 META激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察樣品并成像。在隨機選擇的3個視野（×400）中分別計算增殖細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果表示為增殖細(xì)胞數(shù)量與總細(xì)胞數(shù)量的比率。

4.5傷口劃痕實驗評估HTR-8/SVneo細(xì)胞在體外的遷移能力將用50 nmol/L miR-889-3p模擬物、miRNA模擬物陰性對照、miR-889-3p抑制物或miRNA抑制物陰性對照轉(zhuǎn)染的HTR-8/SVneo細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)皿中，每孔約2×106個細(xì)胞。孵育24 h后，用無菌的200 μL移液器尖端垂直制作水平傷口。每個孔用1 mL新鮮生長培養(yǎng)液洗滌2次以去除脫落的細(xì)胞，然后在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用數(shù)碼相機系統(tǒng)獲取傷口在同一點制作后0 h和48 h的圖像，使用標(biāo)準(zhǔn)卡尺定量評估傷口寬度。

4.6Transwell小室測定HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲能力將用50 nmol/L miR-889-3p模擬物、miRNA模擬物陰性對照、miR-889-3p抑制物或miRNA抑制物陰性對照轉(zhuǎn)染的HTR-8/SVneo細(xì)胞接種在24孔板的頂室中，加入40 μL 1 g/L Matrigel。孵育24 h后，用棉簽小心去除小室頂部未浸潤的細(xì)胞，并用4%甲醛固定小室底部的侵襲細(xì)胞。然后用蘇木精和伊紅對細(xì)胞進行染色。在BX61顯微鏡下觀察，以隨機選擇3個不同的視野（×400）來計算侵襲細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果表示為每個視野的平均細(xì)胞數(shù)。

4.7蛋白質(zhì)印跡分析提取的蛋白質(zhì)在SDS/β-巰基乙醇樣品緩沖液中煮沸。60 μg蛋白質(zhì)在6%～10%梯度聚丙烯酰胺凝膠上電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。將膜與兔抗vimentin多克隆抗體（1∶1 000）、兔抗Ac-vimentin多克隆抗體（1∶500）、兔抗Sirt1多克隆抗體（1∶1 000）或小鼠抗GAPDH單克隆抗體（1∶1 000）在27 ℃下孵育2 h。然后將膜與HRP偶聯(lián)的山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG （1∶10 000）在37 ℃下孵育1 h。將膜與ECL試劑一起溫育1 min，并暴露于X射線膠片。GAPDH蛋白用作上樣對照。使用Quantity One分析系統(tǒng)分析條帶。蛋白質(zhì)水平表示為目標(biāo)信號與GAPDH信號的相對比率。

4.8雙螢光素酶報告基因?qū)嶒瀸imentin 3'-UTR的部分序列和vimentin 3'-UTR中突變的miR-889-3p靶位點分別克隆到pmirGLO載體中螢火蟲螢光素酶基因的下游。將HTR-8/SVneo細(xì)胞接種在48 孔板中孵育過夜，然后使用Lipofectamine 2000將50 nmol/L miR-889-3p模擬物或miRNA模擬物陰性對照轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h。使用雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測量雙螢光素酶活性。

5　統(tǒng)計學(xué)分析

所有統(tǒng)計分析均采用SPSS 22.0軟件進行。數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）。使用雙尾檢驗進行兩組（配對和非配對）間的比較；單因素方差分析和Turkey事后檢驗用于多組間的比較。以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1　miR-889-3p在HTR-8/SVneo細(xì)胞和GDM產(chǎn)婦胎盤樣本中的表達

通過qRT-PCR定量miR-889-3p在不同細(xì)胞中的表達，包括HTR-8/SVneo細(xì)胞、HUVEC、乳腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞。結(jié)果顯示，miR-889-3p在HTR-8/SVneo細(xì)胞中的表達最高（圖1A）。為了進一步證實miR-889-3p的異常表達是否與妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞功能異常有關(guān)，我們檢測了產(chǎn)婦胎盤中miR-889-3p的表達水平。表1列出了研究對象的臨床特征，與正常葡萄糖耐量產(chǎn)婦相比，GDM產(chǎn)婦OGTT-fast、OGTT-1h、OGTT-2h和HbA1c的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（<0.05）。與正常葡萄糖耐量組相比，GDM組胎盤組織中的miR-889-3p水平顯著降低（<0.01），見圖1B。

Figure 1.　Expression of miR-889-3p in HTR-8/SVneo cells and GDM placental samples. A： qRT-PCR analysis of miR-889-3p expression in HTR-8/SVneo cells， human umlibical vein endothelial cells （HUVEC）， breast cancer MDA-MB-231 and HCC1937 cells， ovarian cancer OVCAR3 and SKOV3 cells， and pancreatic cancer MIAPAPA2 and BXPC3 cells （n=3）； B： qRT-PCR analysis of miR-889-3p expression in placental tissues from GDM group and normal glucose tolerance group （n=30）. Mean±SD. **P<0.01 vs normal （glucose tolerance） group.

表1　GDM和正常葡萄糖耐量產(chǎn)婦和胎兒的臨床特征

2　miR-889-3p對HTR-8/SVneo細(xì)胞生長的影響

為了檢測miR-889-3p模擬物和抑制物的轉(zhuǎn)染效率，通過qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后HTR-8/SVneo細(xì)胞中的miR-889-3p表達水平。miR-889-3p模擬物顯著增強miR-889-3p表達水平（<0.01），而miR-889-3p抑制物顯著降低miR-889-3p表達水平（<0.01），見圖2A、B。通過MTT法和EdU法分析miR-889-3p對HTR-8/SVneo細(xì)胞生長的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-889-3p模擬物降低細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞增殖（<0.05），而miR-889-3p抑制物增強細(xì)胞活力，促進細(xì)胞增殖（<0.05），見圖2C～F。

Figure 2.　The effect of miR-889-3p on the growth of HTR-8/SVneo cells. A and B： miR-889-3p expression was detected after HTR-8/SVneo cells were transfected with miR-889-3p mimic or inhibitor； C and D： MTT assay was used to detect the viability of HTR-8/SVneo cells 48 h after transfection with miR-889-3p mimic or inhibitor； E and F： EdU method was used to detect the proliferation of HTR-8/SVneo cells 48 h after transfection with miR-889-3p mimic or inhibitor （scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs mimic or inhibitor control group.

3　miR-889-3p調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和侵襲

為了進一步分析miR-889-3p在GDM發(fā)生中的作用，通傷口劃痕實驗和Transwell實驗評估m(xù)iR-889-3p對滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和侵襲的影響。與模擬物對照組相比，miR-889-3p模擬組遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)量顯著減少（<0.05），見圖3A、B；而與抑制物對照組相比，miR-889-3p抑制物組遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)量顯著增加（<0.05），見圖3C、D。

Figure 3.　miR-889-3p regulated trophoblast migration and invasion. A and B： wound scratch assay and Transwell assay to detect the migration and invasion of HTR-8/SVneo cells 48 h after miR-889-3p mimic transfection （scale bar=50 μm）； C and D： wound scratch assay and Transwell assay to detect the migration and invasion of HTR-8/SVneo cells 48h after miR-889-3p inhibitor transfection （scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs mimic or inhibitor control group.

4　miR-889-3p與vimentin相互作用并促進其乙酰化水平

通過生物信息學(xué)分析確定，人類vimentin在其3'-UTR內(nèi)具有一個保守的miR-889-3p結(jié)合位點（圖4A）。在vimentin-WT轉(zhuǎn)染的HTR-8/SVneo細(xì)胞中，miR-889-3p模擬物的施用抑制了螢光素酶活性，而在vimentin-MUT轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，miR-889-3p模擬物對螢光素酶活性的抑制作用被消除（圖4B）。據(jù)報道，vimentin在K120處被乙酰化，該位點的去乙酰化與肝細(xì)胞癌細(xì)胞遷移能力增強有關(guān)［12］。因此，我們進一步檢查了miR-889-3p對vimentin乙?；挠绊憽＝Y(jié)果顯示，miR-889-3p模擬物顯著提高vimentin乙?；?，并下調(diào)了vimentin和Sirt1（一種使vimentin去乙?；拿撘阴Ｃ福┑谋磉_（圖4C）。

Figure 4.　miR-889-3p interacted with vimentin and inhibited its acetylation. A： the putative binding site between miR-889-3p and vimentin； B. vimentin-WT or vimentin-MUT was co-incubated with HTR-8/SVneo cells transfected with miR-889-3p mimic or mimic control， and luciferase activity was measured； C： Western blot to detect the protein levels of acetylated vimentin （Ac-vimentin）， vimentin and Sirt1 in HTR-8/SVneo cells 48 h after miR-889-3p mimic transfection. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs mimic control group.

5　vimentin是miR-889-3p的功能靶點

為了分析vimentin是否是miR-889-3p的功能靶標(biāo)，我們進行了靶基因補償實驗。與對照組相比，miR-889-3p模擬物組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲顯著抑制（<0.05）；當(dāng)vimentin在轉(zhuǎn)染miR-889-3p模擬物的細(xì)胞中過表達時，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力強于單獨轉(zhuǎn)染miR-889-3p模擬物的細(xì)胞（<0.05），見圖5A～C。與對照組相比，miR-889-3p抑制物組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲顯著增加（<0.05）；當(dāng)vimentin在轉(zhuǎn)染miR-889-3p抑制物的細(xì)胞中被敲減時，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力弱于單獨轉(zhuǎn)染miR-889-3p抑制物的細(xì)胞（<0.05），見圖5D～F。

Figure 5.　Vimentin was a functional target of miR-889-3p. A， B and C： miRNA mock control and pcDNA3.1 control vectors were co-transfected into HTR-8/SVneo cells as controls， while pcDNA3.1 control vector or vimentin-pcDNA3.1 was co-transfected with miR-889-3p mimic； D， E and F： miRNA inhibitor control and scrambled siRNA control vectors were co-transfected into HTR-8/SVneo cells as controls， while scrambled siRNA control or vimentin siRNA （si-vimentin） was co-transfected with miR-889-3p inhibitor. Cell viability was detected by MTT assay （A and D）， and cell migration and invasion were detected by wound scratch assay （B and E） and Transwell assay （C and F， scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs mimic control group； #P<0.05， ##P<0.01 vs mimic or inhibitor control group.

討論

GDM對胎兒和母親都有嚴(yán)重后果，其影響是長期的［3］。妊娠期患有GDM的婦女剖宮產(chǎn)和妊娠高血壓綜合征的發(fā)生率增加，并且在以后的生活中更容易患肥胖癥、糖尿病和其他代謝性疾?。?3］?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為胎盤在GDM的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用。胎盤是連接母親和胎兒的唯一接口，它不僅是參與母親和胎兒之間物質(zhì)交換和循環(huán)的重要器官，而且還具有重要的內(nèi)分泌功能［14］。妊娠后，胎盤合成胎盤催乳素、性激素和母體腎上腺皮質(zhì)激素，可拮抗胰島素的功能，使孕婦靶組織對胰島素的敏感性降低，從而導(dǎo)致GDM的發(fā)生［15］。因此，胎盤已成為研究GDM發(fā)病機制的重要器官。胎盤特異性miRNA可能有助于GDM的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，GDM患者胎盤組織中miR-889-3p的表達顯著降低。先前研究在GDM大鼠胎盤中發(fā)現(xiàn)，miR-889-3p表達也減少［16］。這些數(shù)據(jù)表明miR-889-3p的減少可能與GDM有關(guān)。

滋養(yǎng)層細(xì)胞是滋養(yǎng)層的衍生物，完成胎盤的內(nèi)分泌、交換、侵襲和植入過程。為了研究滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能，研究者建立了不同的細(xì)胞系［17］。例如，JAR、JEG-3、BeWo和HTR-8/SVneo。但值得注意的是，JAR、JEG-3和BeWo細(xì)胞系是絨毛膜癌的癌細(xì)胞，而HTR-8/SVneo最初是在妊娠早期由絨毛外植體生成的。因此，我們在體外實驗選擇HTR-8/SVneo細(xì)胞用于檢測miR-889-3p對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，結(jié)果顯示miR-889-3p過表達抑制細(xì)胞生長、遷移和侵襲，而miR-889-3p敲減促進細(xì)胞遷移和侵襲。對胎盤細(xì)胞生物學(xué)行為的研究表明，GDM孕婦胎盤中滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖增加［18］。CYP1B1在GDM女性的胎盤中高度表達，并促進絨毛外滋養(yǎng)層活動，包括增殖、遷移和侵襲［11］。由此推測，抑制miR-889-3p可通過促進絨毛外滋養(yǎng)層的活動參與GDM的發(fā)生過程。

通常，miRNA通過調(diào)節(jié)其靶基因的表達來執(zhí)行功能。本研究證實了vimentin的3'-UTR具有miR-889-3p響應(yīng)元件，這是不同物種間高度保守的結(jié)構(gòu)域。雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明，miR-889-3p反向調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞中的vimentin表達，并且miR-889-3p模擬物顯著增加vimentin乙酰化。據(jù)報道，vimentin在K120處被乙?；撐稽c的去乙?；c肝細(xì)胞癌細(xì)胞遷移能力增強有關(guān)［12］?；謴?fù)vimentin表達可以挽救miR-889-3p過表達對滋養(yǎng)層細(xì)胞的抑制作用；減少vimentin表達可能會減弱miR-889-3p敲減對滋養(yǎng)層細(xì)胞的促進作用。這些數(shù)據(jù)進一步證實vimentin是miR-889-3p的功能靶標(biāo)。vimentin通過非經(jīng)典轉(zhuǎn)錄非依賴性機制促進結(jié)直腸癌細(xì)胞生長［19］。miR-320的過表達通過下調(diào)vimentin表達來抑制胃癌細(xì)胞的體外增殖、侵襲和遷移以及體內(nèi)腫瘤生長［20］。所有這些事實表明，miR-889-3p通過反向調(diào)節(jié)vimentin表達來調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的活性。

總之，本研究表明胎盤組織中miR-889-3p的下調(diào)參與GDM病理過程。miR-889-3p通過上調(diào)vimentin乙酰化來減弱滋養(yǎng)層細(xì)胞的活性。

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miR-889-3p attenuates invasive function of placental trophoblast cells in gestational diabetes mellitus by promoting vimentin acetylation

YANG Wei-hui△， HE Xin， DING Dan-ni

［，（），410000，］

To explore the mechanism of microRNA-889-3p （miR-889-3p） regulating the invasion function of placental trophoblastic cells in gestational diabetes mellitus （GDM）.From January to December 2020， 30 parturient women with GDM and 30 parturient women with normal glucose tolerance were enrolled in this study. The expression levels of miR-889-3p in maternal placenta， human cancer cell lines， human trophoblast HTR-8/SVneo cells and human umlibical vein endothelial cells （HUVEC） were detected by qRT-PCR. Cell culture， cell transfection， MTT assay， EdU assay， wound scratch assay， and Transwell analysis were carried out to determine the effects of silencing and overexpression of miR-889-3p on the HTR-8/SVneo cells. The binding relationship between miR-889-3p and vimentin was determined by bioinformatics analysis. The effects of miR-889-3p overexpression on dual-luciferase activity and vimentin acetylation were analyzed by dual-luciferase reporter assay and Western blotting， respectively.Relative miR-889-3p expression level in HTR-8/SVneo cells was higher than that in cancer cells and HUVEC， and was lower in the GDM placentas than that in the normal placentas （<0.05）. miR-889-3p overexpression inhibited the growth， migration and invasion of HTR-8/SVneo cells （<0.05）， while miR-889-3p knockdown promoted cell growth， migration and invasion （<0.05）. Vimentin was identified as a direct target of miR-889-3p by bioinformatics analysis. In the HTR-8/SVneo cells transfected with vimentin-WT， administration of miR-889-3p mimic significantly inhibited luciferase activity and increased vimentin acetylation level （<0.05）. Up-regulation of vimentin partially antagonized the inhibitory effect of miR-889-3p overexpression on cell growth， migration and invasion （<0.05）， while enhancement of cell growth， migration and invasion induced by miR-889-3p knockdown was attenuated by down-regulation of vimentin （<0.05）.Down-regulation of miR-889-3p in placental tissue is involved in the pathological process of GDM. miR-889-3p attenuates the invasive function of trophoblast cells by up-regulating vimentin acetylation.

MicroRNA-889-3p； Vimentin； Gestational diabetes mellitus； Placenta； Cell invasion

1000-4718（2022）09-1625-09

2022-04-08

2022-06-27

13874920040； E-mail： yangweihui198@163.com

R714.256； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.09.012

［基金項目］湖南省衛(wèi)生計生委科研課題（No. 20190118）

（責(zé)任編輯：林白霜，羅森）