段洪峰

(淮南市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，安徽淮南 232000)

喹諾酮類藥物(quinolones)，又稱吡酮酸類或吡啶酮酸類，是人工合成的含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的抗菌藥，其發(fā)展迅速，目前已有四代產(chǎn)品。因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、與其他抗菌藥物無(wú)交叉耐藥性、毒副作用小、組織穿透力強(qiáng)、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、給藥方便等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，主要作用是促進(jìn)畜禽和魚類生長(zhǎng)以及預(yù)防治療疾病，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中用于疾病防治，由于缺乏相應(yīng)的科學(xué)理論指導(dǎo)，長(zhǎng)期不合理使用這類抗菌藥，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，在動(dòng)物體內(nèi)積累產(chǎn)生一定的殘留，對(duì)人體健康構(gòu)成威脅，若長(zhǎng)期食用被此類藥物殘留物染的食品，可能誘導(dǎo)人類病原微生物產(chǎn)生耐藥性和抗藥性，嚴(yán)重時(shí)，會(huì)對(duì)食用者產(chǎn)生直接毒性及潛在“三致”(致癌、致畸、致突變),從而影響該類藥物的臨床療效，控制喹諾酮類藥物在水產(chǎn)品中的殘留至關(guān)重要。因此，檢測(cè)水產(chǎn)品中喹諾酮類獸藥殘留并保證結(jié)果的可靠性十分重要，那么評(píng)定其不確定度就具有重要意義。目前常用的檢測(cè)方法有高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析法，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定魚肉中環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星能更加準(zhǔn)確的定量。

測(cè)量不確定度作為測(cè)量結(jié)果的一部分，合理表征了被測(cè)量值的分散性，對(duì)測(cè)量結(jié)果的可信性、可比性和可接受性都有重要影響，是評(píng)價(jià)測(cè)量活動(dòng)質(zhì)量的重要指標(biāo)。該試驗(yàn)采用農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-1—2008方法對(duì)魚肉樣品中4種喹諾酮類獸藥殘留進(jìn)行檢測(cè)，待測(cè)草魚樣品來(lái)源于淮南市2021年風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)抽樣。

1 材料與方法

PL602E、XA205DU電子天平(梅特勒-托利多)；I-Class XEVOTQ-Micro超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)；環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星液標(biāo)混標(biāo)，氘代環(huán)液沙星、氘代恩諾沙星內(nèi)標(biāo)混標(biāo)(天津阿爾塔)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋。準(zhǔn)確吸取環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星100 μg/mL的液標(biāo)混標(biāo)儲(chǔ)備液1 mL，置于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度線配制成1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液A，再吸取A液1 mL置于10 mL容量瓶中配制成0.1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液B；用同樣的方法將內(nèi)標(biāo)混標(biāo)儲(chǔ)備液稀釋成1 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液；吸取一定量的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液分別加入空白樣品中，經(jīng)過(guò)前處理上機(jī)得到濃度為5、10、20、50、100、200 ng/mL的工作曲線。

樣品前處理。稱取(5.00±0.02)g魚肉樣品于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入50 μL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，渦旋混合30 s，避光放置10 min,加入5 g無(wú)水硫酸鎂，渦旋混勻，再加入20 mL酸化乙腈，渦旋混合1 min,超聲提取10 min;7 000 r/min 離心5 min，取上清液于125 mL梨形瓶中。殘?jiān)僦貜?fù)提取一次，合并2次提取液，于40 ℃旋蒸至干。加1.0 mL甲醇溶液溶解殘留物并過(guò)0.2 μm濾膜，最后用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

測(cè)定結(jié)果由儀器工作站按內(nèi)標(biāo)法自動(dòng)計(jì)算，樣品中喹諾酮類獸藥殘留量按公式(1)計(jì)算。所有的數(shù)據(jù)均按照《數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定》方法進(jìn)行修約。

(1)

式中，為樣品中待測(cè)組分的含量(μg/kg)；為測(cè)定液中待測(cè)組分的濃度(ng/mL)；為樣品定容體積(mL)；為樣品稱樣量(g)。

2 結(jié)果與分析

依據(jù)JJF 1059.1—2012，評(píng)估不確定度時(shí)，應(yīng)該是集中精力分析貢獻(xiàn)最大的不確定度分量，然后合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，給出擴(kuò)展不確定度，最后準(zhǔn)確表述檢測(cè)結(jié)果。對(duì)檢測(cè)和校準(zhǔn)結(jié)果測(cè)量不確定度來(lái)源的識(shí)別應(yīng)從分析測(cè)量過(guò)程入手，即對(duì)測(cè)量方法、測(cè)量系統(tǒng)和測(cè)量程序進(jìn)行詳細(xì)研究。該試驗(yàn)不確定度來(lái)源主要有樣品稱量、標(biāo)準(zhǔn)溶液、方法回收率、樣品定容、結(jié)果重復(fù)性以及最小二乘法擬合曲線引入的不確定度，將所有不確定度來(lái)源進(jìn)行整理，然后再逐個(gè)進(jìn)行分析。魚肉中喹諾酮類獸藥殘留檢測(cè)的不確定度來(lái)源如圖1所示。

圖1 不確定度來(lái)源Fig.1 Sources of uncertainty

標(biāo)準(zhǔn)溶液不確定度來(lái)源主要有標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度、標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋和標(biāo)準(zhǔn)溶液添加。

標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋引入的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行兩級(jí)稀釋，用到100、10 mL容量瓶以及1 000 μL移液槍，不確定度來(lái)源主要有容量瓶和移液槍的校準(zhǔn)、溫度、重復(fù)性，不確定度分量如下。

100 mL容量瓶引入的不確定度。

(2)溫度變化引入的不確定度。容量瓶檢定溫度為22 ℃，實(shí)驗(yàn)室溫度變化為±4 ℃，甲醇的膨脹系數(shù)為0.001 24，甲醇的體積變化△=±0.496 mL，按矩形分布，則溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.290 mL。

(3)重復(fù)性引入的不確定度。10次重復(fù)稱量得到標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.023 mL，則重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.023 mL。

100 mL容量瓶引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.290 mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.002 9。

10 mL容量瓶引入的不確定度。計(jì)算過(guò)程同“...”，容量允差為±0.020 mL，校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.008 mL，溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.029 mL，10次重復(fù)稱量得到標(biāo)準(zhǔn)偏差0.003 mL，重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.003 mL，則10 mL容量瓶引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.030 mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.003 0。

標(biāo)準(zhǔn)曲線添加引入的不確定度。用50、200 μL移液槍添加6個(gè)濃度點(diǎn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，不確定度來(lái)源主要有校準(zhǔn)、重復(fù)性、溫度;按矩形分布，計(jì)算過(guò)程同“..”，標(biāo)準(zhǔn)曲線添加引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(add)=0.046 0。

樣品定溶液為3%甲醇水溶液，用1 000 μL移液槍移取，計(jì)算過(guò)程同“..”；校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=5.8 μL，溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=4.7 μL，重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=1.4 μL，則樣品定容引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=7.6 μL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.007 6。

在重復(fù)性條件下對(duì)樣品進(jìn)行9次獨(dú)立測(cè)試，采用貝塞爾公式法計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度，測(cè)試結(jié)果及不確定度如表2～3所示。

表1 各組分的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

表2 重復(fù)測(cè)量結(jié)果

表3 各組分的不確定度

采用6個(gè)濃度點(diǎn)各測(cè)定一次，用最小二乘法擬合成直線得到不同濃度的響應(yīng)值()的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線=+C，由于內(nèi)標(biāo)峰面積參與響應(yīng)值計(jì)算，故不考慮內(nèi)標(biāo)的不確定度，具體數(shù)據(jù)如表4所示。計(jì)算公式如下：

表4 最小二乘法擬合曲線的不確定度

接下表

計(jì)算合成各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式如下：

利用合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度和結(jié)果的平均值計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度()，擴(kuò)展不確定度=()×，采用置信概率為95%，包含因子=2，結(jié)果表述如表5。

表5 樣品的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3 結(jié)論與討論

在日常檢測(cè)活動(dòng)中評(píng)定不確定度是必不可少的，目的是為了評(píng)價(jià)測(cè)量結(jié)果的可靠性，能更加直觀地發(fā)現(xiàn)整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中影響測(cè)量結(jié)果的各類因素，通過(guò)分析各類因素的測(cè)量不確定度對(duì)試驗(yàn)的各個(gè)部分進(jìn)行補(bǔ)充、優(yōu)化，從而降低各不確定度分量給結(jié)果帶來(lái)的影響，讓測(cè)量結(jié)果更加準(zhǔn)確。魚肉中喹諾酮類獸藥殘留檢測(cè)試驗(yàn)采用的是空白基質(zhì)添加曲線，然后再用與樣品相同的前處理方法進(jìn)行處理，用這種方式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線可以盡可能減小樣品前處理、基質(zhì)等帶來(lái)的誤差影響，使測(cè)量結(jié)果更加準(zhǔn)確；與大多數(shù)用溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)的不確定度評(píng)定有所不同，魚肉中喹諾酮類獸藥殘留檢測(cè)測(cè)量不確定度評(píng)定增加了標(biāo)準(zhǔn)曲線添加所引入的不確定度，最后通過(guò)觀察所有的不確定度分量的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線添加引入的不確定度帶來(lái)的影響不容忽視，說(shuō)明評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)曲線添加引入的不確定度是有必要的。影響測(cè)量結(jié)果的不確定度分量不僅只有魚肉中喹諾酮類獸藥殘留檢測(cè)測(cè)量不確定度評(píng)定中計(jì)算的最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率以及標(biāo)準(zhǔn)溶液等，還有很多其他因素對(duì)測(cè)量結(jié)果能產(chǎn)生影響，如抽樣、樣品制備、凈化時(shí)間、儀器設(shè)備等，將來(lái)都應(yīng)該要納入不確定度的評(píng)定中。