邵一鳴，張濛，連鴻凱，張新安，何姣

1.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院，河南 鄭州 450001； 2.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003；3.漯河市郾城區(qū)中醫(yī)院，河南 漯河 462300

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)是一種全身性代謝性骨病，其特征是骨量和韌性下降、骨微結(jié)構(gòu)破壞以及骨脆性增加[1]。隨著人口老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松癥患者數(shù)量不斷增加。骨質(zhì)疏松癥的嚴(yán)重后果為發(fā)生脆性骨折，從而導(dǎo)致殘疾率和死亡率增加[2]，盡早采取科學(xué)的預(yù)防策略和規(guī)范治療有著重要意義。目前，以促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收為特點(diǎn)的兩大類藥物被廣泛用于治療骨質(zhì)疏松癥[3]，但同時(shí)也存在一系列副作用，包括中風(fēng)、心血管疾病、胃腸不適及腎損傷等[4]。因此，期待能夠?qū)ふ业蒋熜Ц语@著、安全性更高的抗骨質(zhì)疏松藥物為其臨床治療提供更多選擇。

長久以來，中藥一直被用于骨質(zhì)疏松癥患者的補(bǔ)充和替代治療，在治療骨質(zhì)疏松癥中起著不可估量的作用。黃精是百合科植物滇黃精、黃精和多花黃精的干燥根莖，味甘、平，無毒，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾潤肺、益腎等功效，可用于脾胃虛弱、體倦乏力、口干食少、肺虛燥咳、精血不足、內(nèi)熱消渴等癥[5]。已有研究證明，黃精中的多糖類物質(zhì)可以逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)流失并預(yù)防骨質(zhì)疏松癥[6]。但是，由于中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，其確切的作用機(jī)制有待探索。近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的廣泛應(yīng)用為研究人員提供了新的方向和策略來闡明中藥治療疾病的作用機(jī)制?；诖耍狙芯坷镁W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討黃精治療骨質(zhì)疏松癥的有效成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和相關(guān)途徑，為今后骨質(zhì)疏松癥的臨床治療和深入研究提供方向和思路。

1 材料與方法

1.1 黃精活性成分篩選及相關(guān)靶點(diǎn)獲取采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https：//tcmsp-e.com/)篩選黃精的活性成分。將藥代動力學(xué)參數(shù)作為中藥活性成分的篩選條件，設(shè)置口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%及類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18，篩選出藥物的活性成分，并提取藥物活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點(diǎn)的獲取使用GeneCards(https：//www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫和在線人類孟德爾遺傳(online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//omim.org/)數(shù)據(jù)庫，以“osteoporosis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，得到骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 黃精治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點(diǎn)的獲取使用在線軟件VENNY2.1(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)對骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點(diǎn)和黃精活性成分相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行分析，取交集得到黃精治療骨質(zhì)疏松癥的潛在作用靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和核心靶點(diǎn)篩選將黃精治療骨質(zhì)疏松癥的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING在線數(shù)據(jù)庫(http：//string-db.org/)，設(shè)置置信度≥0.4，隱藏游離靶點(diǎn)，構(gòu)建潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行拓?fù)浞治?，并利用Cytohubba插件根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的度值篩選核心靶點(diǎn)。

1.5 “黃精-活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建為清晰呈現(xiàn)出黃精中有效成分與潛在靶點(diǎn)之間的對應(yīng)關(guān)系，采用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“黃精-活性成分-潛在靶點(diǎn)”對應(yīng)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行拓?fù)浞治?，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度值越大，表明該有效成分發(fā)揮的作用越大。

1.6 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析將潛在靶點(diǎn)提交至DAVID在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，得到黃精治療骨質(zhì)疏松癥的主要生物學(xué)功能和信號通路。

1.7 分子對接在Pubchem在線數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載節(jié)點(diǎn)度值靠前的有效成分的3D結(jié)構(gòu)，從PDB數(shù)據(jù)庫(https：//www.rcsb.org/)下載PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度值靠前的靶點(diǎn)的PDB格式文件，最后使用schrodinger軟件進(jìn)行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 黃精活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索獲得黃精化學(xué)成分38個(gè)，根據(jù)OB≥30%及DL≥0.18篩選得到活性成分12個(gè)，剔除無對應(yīng)靶點(diǎn)信息的3個(gè)活性成分，共獲得黃精活性成分9個(gè)及相關(guān)靶點(diǎn)86個(gè)。見表1。

表1 黃精活性成分信息表

2.2 骨質(zhì)疏松癥疾病靶點(diǎn)及黃精治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點(diǎn)通過GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選獲得骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點(diǎn)4 449個(gè)，OMIM數(shù)據(jù)庫獲得骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點(diǎn)136個(gè)，合并去重后共獲得疾病靶點(diǎn)4 490個(gè)。使用在線軟件VENNY2.1對骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點(diǎn)和黃精活性成分相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，取交集后，獲得59個(gè)交集靶點(diǎn)，即為黃精治療骨質(zhì)疏松癥的潛在作用靶點(diǎn)。見圖1。

圖1 黃精活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)將黃精治療骨質(zhì)疏松癥的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)包含59個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)，488條邊。將PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行拓?fù)浞治觯⒗肅ytohubba插件篩選出該網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度值排名前10位的核心靶點(diǎn)，分別是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase 1，AKT1)、腫瘤抗原p53(tumor protein p53，TP53)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(AP-1 transcription factor subunit，JUN)、絲裂原活化蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteme aspartate specific protease 3，CASP3)、雄激素受體(androgen receptor，AR)、雌激素受體1(estrogen receptor 1，ESR1)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)。采用STRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。見圖2、圖3。

圖2 黃精治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

注：節(jié)點(diǎn)大小和顏色與相互作用程度成正比圖3 黃精治療骨質(zhì)疏松癥的核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 “黃精-活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖采用 Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建“黃精-活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，圖中紅色節(jié)點(diǎn)代表黃精，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表黃精的有效成分(隱藏游離靶點(diǎn)后，剔除沒有對應(yīng)靶點(diǎn)的活性成分)，黑色節(jié)點(diǎn)代表黃精治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，度值排名靠前的有效成分分別是黃芩素(節(jié)點(diǎn)度值為28)、β-谷甾醇(節(jié)點(diǎn)度值為23)。見圖4。

圖4 “黃精-活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析通過DAVID 在線工具對潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析。GO功能富集分析得到298個(gè)生物過程(biological process，BP)，31個(gè)細(xì)胞組分(cellular component，CC)及73個(gè)分子功能(molecular function，MF)，其中BP主要涉及葡萄糖輸入的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of glucose import)、組織內(nèi)細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)態(tài)(homeostasis of number of cells within a tissues)、對有機(jī)物的反應(yīng)(response to organic substance)等；CC主要涉及樹突細(xì)胞質(zhì)(dendrite cytoplasm)、細(xì)胞膜(membrane)、髓鞘(myelin sheath)等；MF主要涉及核因子-kappa B結(jié)合[(nuclear factor-kappa B，NF-κB)binding]、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性(protein serine/threonine/tyrosine kinase activity)、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(activating transcription factor binding)等。將結(jié)果分別按照P值排序，使用微生信繪制出前10個(gè)結(jié)果的氣泡圖。見圖5。KEGG信號通路富集分析獲得85條信號通路，主要涉及癌癥相關(guān)通路(pathways in cancer)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、破骨細(xì)胞分化(osteoclast differentiation)、雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路[(tumor necrosis factor，TNF) signaling pathway]等。結(jié)果表明，黃精中多種有效成分可以通過多條不同信號通路作用于骨質(zhì)疏松癥。選取P值前15的信號通路繪制氣泡圖。見圖6。

圖5 GO功能富集分析

2.6 分子對接結(jié)果配體與受體結(jié)合能量越低，其結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，相互作用的可能性越大。當(dāng)結(jié)合能<-5.0 kcal·mol-1時(shí)，兩者具有良好的親和力。分子對接結(jié)果顯示，黃芩素和β-谷甾醇與關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1、TP53的結(jié)合能均<-5.0 kcal·mol-1，提示它們之間具有良好的結(jié)合力。見表2，圖7。

表2 黃精主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能 (kcal·mol-1)

注：氣泡大小與通路中所含靶點(diǎn)基因數(shù)量成正比圖6 KEGG信號通路富集分析

注：A：黃芩素-AKT1；B：β-谷甾醇-AKT1；C：黃芩素-TP53；D：β-谷甾醇-TP53圖7 活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對接模式圖

3 討論

數(shù)千年來，中藥一直以多成分、多靶點(diǎn)的方式用于預(yù)防和治療各種疾病，其在治療骨代謝相關(guān)疾病中更是處于舉足輕重的地位。黃精具有降血糖、 降血脂、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、抗菌、抗病毒、增強(qiáng)免疫等多種藥理作用[7]。實(shí)驗(yàn)證明，黃精中的黃精多糖可通過調(diào)控骨修復(fù)及骨代謝因子進(jìn)而提高骨質(zhì)疏松癥骨折大鼠生物力學(xué)性能及骨密度[8]。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法探索黃精的活性化合物及其治療骨質(zhì)疏松癥的潛在分子機(jī)制。

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到黃精治療骨質(zhì)疏松癥的有效化學(xué)成分包括黃芩素、β-谷甾醇、薯蕷皂苷元等。通過構(gòu)建“黃精-活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)顯示，黃芩素可能在治療骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮重要作用。黃芩素是一種黃酮類化合物，可阻斷NF-κB配體受體激活劑(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)通路誘導(dǎo)的信號分子從而抑制破骨細(xì)胞分化和成熟破骨細(xì)胞凋亡[9]。黃芩素還可通過MAPK/NF-κB/AP-1信號通路刺激成骨細(xì)胞分化[10]，通過激活NF-κB來觸發(fā)成骨細(xì)胞分化，進(jìn)而誘導(dǎo)MAPK和NF-κB的激活來加速分化過程；在分化后期，黃芩素誘導(dǎo)MAPK和其他轉(zhuǎn)錄因子如AP-1和活化T細(xì)胞核因子蛋白c1 (nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1)的激活進(jìn)一步誘導(dǎo)成骨分化。除此之外，黃芩素還可以通過抑制AKT促進(jìn)叉頭框蛋白(forkhead box other 1，F(xiàn)OXO1)的表達(dá)從而改善糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞成骨分化[11]。黃芩素具有成骨和破骨的雙向調(diào)節(jié)作用，在改善骨代謝平衡及治療骨質(zhì)疏松癥方面具有廣泛應(yīng)用前景。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析，本研究得到黃精治療骨質(zhì)疏松癥的核心靶點(diǎn)有AKT1、TP53、JUN、FOS、CASP3、MMP9、ESR1、MAPK14、PTGS2、AR等。AP-1 在骨骼系統(tǒng)中起到重要的作用，由FOS、JUN和激活轉(zhuǎn)錄因子(activating transcription factor，ATF)蛋白家族成員組成，與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡有著密切的關(guān)系[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，缺乏FOS、JUN的小鼠由于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞缺陷導(dǎo)致骨量減少[14-15]。因此，F(xiàn)OS、JUN蛋白作為骨形成過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可被用來開發(fā)作為治療低骨量疾病的藥物。AKT1是一種人類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與調(diào)節(jié)包括新陳代謝、增殖、細(xì)胞存活和血管生成在內(nèi)的許多生理過程[16]。同時(shí)，AKT1也是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化和功能調(diào)節(jié)的因子，可以介導(dǎo)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體之間的耦合[17]。AKT1還可以通過磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)通路被激活，PI3K-AKT信號通路是軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等骨骼成分細(xì)胞分化的關(guān)鍵途徑[18]。體內(nèi)外研究均表明，PI3K-AKT信號通路可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和骨形成抑制骨質(zhì)疏松[19]。

在KEGG通路富集分析中，細(xì)胞凋亡信號通路、破骨細(xì)胞分化信號通路、p53信號通路、雌激素信號通路、TNF信號通路是黃精活性成分治療骨質(zhì)疏松癥的重要信號通路。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞來源于骨髓原始多能干細(xì)胞，分別在骨形成和骨吸收中發(fā)揮重要作用[20-21]。骨形成和骨吸收之間的平衡可以維持骨重塑和骨量。此外，骨微環(huán)境中的各種細(xì)胞因子作用于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)，促進(jìn)骨重塑[22]。TNF-α由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，通過抑制成骨細(xì)胞中堿性磷酸酶在抑制骨形成和礦化中起著至關(guān)重要的作用[23]。TNF-α可以刺激破骨細(xì)胞前體的形成并促進(jìn)RANKL表達(dá)，從而影響骨吸收[24]，還可通過MAPK信號通路抑制成骨細(xì)胞分化[25]。這些證據(jù)都表明TNF-α抑制劑可能是有效預(yù)防或逆轉(zhuǎn)骨丟失的潛在治療靶點(diǎn)。p53由腫瘤抑制基因TP53編碼，通過減緩細(xì)胞生長和分裂來抑制腫瘤生長[26]。研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥患者血清p53水平升高并通過miRNA信號通路影響MSCs的功能來抑制成骨，敲低 p53 可部分逆轉(zhuǎn)骨密度降低[27-28]。雌激素是骨代謝的重要調(diào)節(jié)劑，通過骨襯細(xì)胞中RANKL的靶向表達(dá)控制骨轉(zhuǎn)換[29]。研究表明，OVX大鼠模型中雌激素缺乏會增加皮質(zhì)骨的血管孔隙率，減少骨體積分?jǐn)?shù)和小梁數(shù)量，并增強(qiáng)脛骨近端的骨小梁分離，降低骨強(qiáng)度[30]。值得一提的是，本研究所得到的靶點(diǎn)基因和信號通路相互驗(yàn)證，環(huán)環(huán)相扣，進(jìn)一步說明黃精的活性成分可能通過增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化和骨形成同時(shí)限制破骨細(xì)胞發(fā)育和骨吸收治療骨質(zhì)疏松癥。

分子對接結(jié)果顯示，黃芩素、β-谷甾醇與AKT1、TP53的對接結(jié)合力均<-5 kcal·mol-1，說明黃精活性成分與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點(diǎn)能夠產(chǎn)生較好的蛋白結(jié)合活性。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法較為全面地分析了黃精治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，黃精作用于骨質(zhì)疏松癥的方式是多通路、多靶點(diǎn)及多有效成分的，為今后的研究提供了參考和數(shù)據(jù)支持，但該研究結(jié)果還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究加以驗(yàn)證。