畢靜文，達(dá)舉云，史金蓮，張 勇

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

近年來寵物醫(yī)療行業(yè)中，貓病的比例逐漸增加，貓眼科疾病也越來越受到人們的關(guān)注。貓角膜腐骨病(feline corneal sequestrum)又稱壞死性角膜炎，絕大部分病例的腐骨片發(fā)生在角膜上皮層和基質(zhì)層，多是黑棕色。貓皰疹病毒1型(Feline herpesvirus-1，F(xiàn)HV-1)被認(rèn)為是引起貓角膜腐骨病的主要病毒之一。目前貓角膜腐骨病的治療在前期可用藥物點(diǎn)眼保守治療，腐骨片有一定概率自行脫落，手術(shù)治療最常用的方式是帶蒂結(jié)膜瓣遮蓋術(shù)，此外還有自體角膜結(jié)膜板層移植術(shù)(lamellar keratoplasty,LKP)，以及生物補(bǔ)片修補(bǔ)術(shù)。目前在異種角膜移植方面也取得了一定的進(jìn)展，Ven Hippel、Amano S等在兔、豬角膜板層移植獲得了成功[1]，后續(xù)也有許多學(xué)者對(duì)異種角膜移植進(jìn)行了研究，但寵物臨床上還沒有得到應(yīng)用。本試驗(yàn)對(duì)FHV-1陽性角膜腐骨病的患貓進(jìn)行了不同手術(shù)方式的治療并嘗試使用了新型植片，對(duì)比治療效果，為臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 本試驗(yàn)選取2019年-2021年間成都眼專科動(dòng)物醫(yī)院經(jīng)臨床診斷為角膜腐骨病的患貓90例，并采集眼鼻口拭子共90份。

1.1.2 主要耗材 生物補(bǔ)片(Vetrix BioSIS)，美國(guó)庫克生物技術(shù)公司(Cook Biotech incorporated )產(chǎn)品；SA縫線(USP8-0、USP3-0)，古氏貿(mào)易(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要藥品 聚維酮碘(100 g/L)山東安捷高科消毒科技有限公司；妥布霉素滴眼液(3 g/L 5 mL∶15 mg)s.a.ALCON-COUVREUR n.v.；重組人表皮生長(zhǎng)因子衍生物滴眼液(15 000 IU/3 mL/支)深圳市華生元基因工程發(fā)展有限公司；更昔洛韋滴眼液(8 mL∶18 mg)湖北遠(yuǎn)大天天明制藥有限公司；重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子滴眼液(21 000 IU/5 mL)珠海億盛生物制藥有限公司；硫酸新霉素眼膏(5 g/支)APEX公司；他克莫司滴眼液(1 g/L 5 mL∶5 mg以他克莫司計(jì))Senju Pharmaceutical Co.,Ltd。

1.1.4 主要儀器 離心機(jī)(5417)德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀(YK1125511)BIO-RAD公司產(chǎn)品；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒(DP315)天根生化科技北京有限公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-6C)北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PCR檢測(cè) 將90份貓眼鼻口拭子樣本在無菌條件下用生理鹽水懸浮振蕩,1 000 r/min離心10 min取上清液作為模板，應(yīng)用天根生物DNA提取盒提取DNA，按說明書步驟進(jìn)行提取。引物選擇如表1所示。用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察所得到的條帶。并將陽性樣本應(yīng)用市售免疫熒光層析試紙進(jìn)行檢驗(yàn)性檢測(cè)。對(duì)陽性結(jié)果患貓進(jìn)行治療。

表1 引物選擇Table 1 Primer selection

1.2.2 手術(shù)治療 26例病例術(shù)前檢查評(píng)估均符合手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，且FHV-1 PCR檢測(cè)及市售免疫熒光層析試紙檢測(cè)均為陽性。其中9例施行結(jié)膜瓣遮蓋術(shù)、9例施行自體角膜結(jié)膜板層移植術(shù)、8例施行生物補(bǔ)片修補(bǔ)術(shù)。術(shù)前禁食6 h，禁水2 h。

所有病例術(shù)前均進(jìn)行鎮(zhèn)靜止痛，吸入式維持麻醉。仰臥保定，用眼科手術(shù)固定枕固定頭部，對(duì)術(shù)眼的眼周進(jìn)行備皮，用1 g/L聚維酮碘沖洗眼部及周圍組織，后立即用無菌生理鹽水沖洗干凈，反復(fù)3次以清理角膜表面分泌物并達(dá)到消毒的目的。

1.2.2.1 結(jié)膜瓣遮蓋術(shù) 將角膜腐骨部位完全剔除，在最靠近角膜損傷的一側(cè)，用眼科無齒鑷伸至結(jié)膜穹隆處，提起球結(jié)膜，用眼科手術(shù)剪剪取合適大小的帶蒂結(jié)膜瓣，需能覆蓋全部損傷部位，并用眼科手術(shù)剪修剪結(jié)膜瓣至最薄程度。將帶蒂結(jié)膜瓣拉起覆蓋住角膜損傷部位，采用8-0眼科縫合線進(jìn)行連續(xù)褥式縫合。

1.2.2.2 自體角膜結(jié)膜板層移植術(shù) 清除全部腐骨片，在靠近病灶部位的健康角膜上做梯型板層切開，剝離至角鞏膜緣延續(xù)至球結(jié)膜處，分離出適合大小的結(jié)膜，制成角膜結(jié)膜移植瓣，再將角膜結(jié)膜移植瓣?duì)坷烈浦泊?，修剪角膜瓣邊緣，使其與移植床完全貼合[2]。應(yīng)用古氏SA USP8-0縫線將角膜結(jié)膜移植瓣與簡(jiǎn)單連續(xù)縫合至移植床上。

1.2.2.3 生物補(bǔ)片修補(bǔ)術(shù) 清除全部腐骨片，剪取合適大小的生物補(bǔ)片，用古氏SA USP8-0縫線進(jìn)行結(jié)節(jié)縫合。

1.2.2.4 第三眼瞼遮蓋術(shù) 所有病例均聯(lián)合第三眼瞼遮蓋術(shù)，第三眼瞼遮蓋術(shù)可以減少縫線的機(jī)械性摩擦。截取一段0.5 mm左右的無菌頭皮針的塑料軟管備用，用眼科無齒鑷輕輕提起第三眼瞼，在第三眼瞼一端進(jìn)行紐扣縫合。用PGA2-0縫線，先由內(nèi)向外，再由外向內(nèi)穿透第三眼瞼，再將兩線末端分別從上眼瞼外側(cè)結(jié)膜穹窿穿出[3]。將縫線穿過準(zhǔn)備好的塑料軟管，暫不打結(jié)，按照同樣的方法作第二道紐扣狀縫合。最后收緊縫線打結(jié)，使第三眼瞼遮蓋整個(gè)眼球。

1.2.2.5 異種角膜移植術(shù) 首先制備濕房保存液。10 mL生理鹽水中加入妥布霉素滴眼液2 mL和他克莫司滴眼液2 mL制成濕房保存液。濕房保存液是較易獲取且廉價(jià)的角膜短期保存液，本試驗(yàn)采用并改良自20世紀(jì)30年代沿用至今的4℃濕房保存眼球法，該方法由前蘇聯(lián)醫(yī)生Filotov首創(chuàng)[4]。摘取新鮮兔眼，用1 g/L聚維酮碘和生理鹽水沖洗后立即放入提前配置好的含有他克莫司和妥布霉素的濕房保存液中，置-4℃保存。移植手術(shù)在2 h～4 h內(nèi)進(jìn)行。用眼科鑷夾住球結(jié)膜固定患貓眼球，應(yīng)用角膜板層刀清除腐骨片，從濕房保存液中取出兔眼球，用板層刀延鞏膜邊緣取出不含彈力層及內(nèi)皮層的兔角膜片，制成兔角膜板層植片，修剪至合適移植床的大小，將兔角膜植片覆蓋在角膜缺損部位，避免用有齒鑷鉗夾損傷植片，應(yīng)用古氏SA縫線 USP8-0進(jìn)行連續(xù)縫合。植片移植完成后施行第三眼瞼遮蓋術(shù)。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

90例角膜腐骨患貓PCR檢測(cè)結(jié)果為26例陽性，市售免疫層析試紙重復(fù)檢測(cè)均為FHV-1陽性。

2.2 手術(shù)治療結(jié)果

圖1為結(jié)膜瓣遮蓋術(shù)手術(shù)過程，圖1中A、B、C為清除角膜腐骨部分裸露的移植床，圖1中a、b、c為施行結(jié)膜瓣遮蓋術(shù)。圖2為L(zhǎng)KP手術(shù)過程，圖2中A、B、C為清除角膜腐骨部分裸露的移植床，圖2中a、b、c為施行LKP手術(shù)。圖3為生物補(bǔ)片修補(bǔ)術(shù)過程，其中A為角膜腐骨清除，B為應(yīng)用生物補(bǔ)片修補(bǔ)角膜術(shù)后。圖4為施行第三眼瞼遮蓋術(shù)，所有病例均聯(lián)合了第三眼瞼遮蓋術(shù)。

所有病例24 h佩戴伊麗莎白圈，每日眼藥水滴眼。妥布霉素滴眼液每日4次，更昔洛韋滴眼液每日6次，重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子滴眼液每日6次，重組人表皮生長(zhǎng)因子衍生物滴眼液每日6次，硫酸新霉素眼膏每日2次。異種角膜移植術(shù)后增加他克莫司滴眼液每日2次。他克莫司滴眼液主要成份為他克莫司，是一種新型免疫抑制劑主要抑制鈣調(diào)磷酸酶，可阻斷T淋巴細(xì)胞的激活，適用于預(yù)防器官移植的排斥反應(yīng)[5]。糖皮質(zhì)激素雖然也可以抑制排異反應(yīng)，但會(huì)引起角膜潰瘍面難以愈合甚至病情加重，副作用大且會(huì)引起一系列并發(fā)癥[6]。結(jié)膜瓣遮蓋術(shù)術(shù)前及術(shù)后1個(gè)月對(duì)比如圖5所示。自體角膜結(jié)膜板層移植術(shù)術(shù)前及術(shù)后1個(gè)月對(duì)比如圖6所示。生物補(bǔ)片修補(bǔ)術(shù)術(shù)前及術(shù)后1個(gè)月對(duì)比如圖7所示。結(jié)果顯示生物補(bǔ)片修補(bǔ)術(shù)預(yù)后效果優(yōu)于自體角膜結(jié)膜板層移植術(shù)以及結(jié)膜瓣遮蓋術(shù)術(shù)后1周拆除第三眼瞼遮蓋，角膜血管爬行速度比正常情況快1倍以上，角膜透明程度良好如圖8中A所示。術(shù)后3周角膜基本恢復(fù)透明，預(yù)后良好，治療周期比傳統(tǒng)手術(shù)方式有所收短，如圖8中B所示。無明顯排異反應(yīng)，術(shù)后第1周～2周內(nèi)偶有輕微咳嗽，不排除與氣管插管導(dǎo)致的摩擦有關(guān)，尚無法證實(shí)其與排異反應(yīng)的關(guān)聯(lián)。

A、B、C.角膜腐骨清除術(shù) ；a、b、c.結(jié)膜瓣遮蓋術(shù)A,B,C.Corneal rotting bone removal surgery;a,b,c.Conjunctival flap covering surgery圖1 角膜腐骨清除術(shù)及結(jié)膜瓣遮蓋術(shù)Fig.1 Corneal rotting bone removal surgery and conjunctival flap covering surgery

A、B、C.角膜腐骨清除術(shù) ；a、b、c.LKP手術(shù)A,B,C.Corneal rotting bone removal surgery;a,b,c.Autologous corneal conjunctival lamellar transplantation surgery圖2 角膜腐骨清除術(shù)及LKP手術(shù)Fig.2 Corneal rotting bone removal surgery and autologous corneal conjunctival lamellar transplantation surgery

A.角膜腐骨清除術(shù)；B.生物補(bǔ)片修補(bǔ)術(shù)A.Corneal rotting bone removal surgery;B.Biological mesh repair transplantation surgery圖3 角膜腐骨清除術(shù)及生物補(bǔ)片修補(bǔ)術(shù)Fig.3 Corneal rotting bone removal surgery and biological mesh repair transplantation surgery

A.塑料軟管；B.第三眼瞼A.Plastic tube;B.Third eyelid圖4 第三眼瞼遮蓋術(shù)Fig.4 Third eyelid covering

A、B、C.結(jié)膜瓣遮蓋術(shù)術(shù)前 ；a、b、c.結(jié)膜瓣遮蓋術(shù)術(shù)后A,B,C.Preoperation of conjunctival flap covering surgery;a,b,c.Postoperation of conjunctival flap covering surgery圖5 結(jié)膜瓣遮蓋術(shù)術(shù)前及術(shù)后對(duì)比Fig.5 Preoperation and postoperation of conjunctival flap covering surgery

A、B、C.自體角膜結(jié)膜板層移植術(shù)術(shù)前；a、b、c.自體角膜結(jié)膜板層移植術(shù)術(shù)后A,B,C.Preoperation of corneal conjunctival lamellar autograft;a,b,c.Postoperation of corneal conjunctival lamellar autograft圖6 自體角膜結(jié)膜板層移植術(shù)術(shù)前及術(shù)后對(duì)比Fig.6 Preoperation and postoperation of corneal conjunctival lamellar autograft

A.生物補(bǔ)片修補(bǔ)術(shù)術(shù)前；B.生物補(bǔ)片修補(bǔ)術(shù)后恢復(fù)情況A.Before biological patch repair operation;B.1 month after surgery recovery of biological patch repair圖7 生物補(bǔ)片修補(bǔ)術(shù)術(shù)前及術(shù)后對(duì)比Fig.7 Comparison before and after biological patch repair operation

A.術(shù)后1周拆除第三眼瞼遮蓋；B.術(shù)后3周角膜恢復(fù)情況A.Removal of the third eyelid occlusion 1 week after surgery;B.Corneal recovery 3 weeks after surgery圖8 術(shù)后角膜恢復(fù)情況Fig.8 Corneal recovery

3 討論

針對(duì)不同手術(shù)方式來說，每種手術(shù)方式優(yōu)缺點(diǎn)如下：生物補(bǔ)片修補(bǔ)術(shù)預(yù)后角膜透明度更高，但價(jià)格高昂，且目前無動(dòng)物臨床專用的生物補(bǔ)片。結(jié)膜瓣遮蓋術(shù)價(jià)格低廉但術(shù)后恢復(fù)時(shí)間較前兩種手術(shù)方式長(zhǎng)，由于結(jié)膜本身不具有透明性，術(shù)后角膜透明性恢復(fù)較差；LKP透明度較結(jié)膜瓣手術(shù)要好，但術(shù)后角膜鞏緣會(huì)在視軸上留下痕跡，影響動(dòng)物視力。

在獸醫(yī)臨床上同種異體角膜移植的效果目前還未有明確研究，其局限性在于供體稀缺。異種角膜板層移植方式在一定程度上彌補(bǔ)了這一缺陷。貓的角膜大致分為4層，即上皮層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮層，其中90%約為基質(zhì)層[7]。角膜板層移植的術(shù)式分為前板層移植、中板層移植及后板層移植[8]。目前在獸醫(yī)臨床上所致的一般為角膜前板層移植，只移植上皮層以及部分基質(zhì)層，保留后彈力層及內(nèi)皮層。異種角膜板層移植取得進(jìn)展的原因主要在于角膜不含淋巴管及血管，本身免疫排斥發(fā)生的概率略低且角膜排異反應(yīng)主要針對(duì)內(nèi)皮層，對(duì)基質(zhì)層反應(yīng)較輕微。M Teresa Pea Gimenez等在1998年就做了相關(guān)研究，將犬角膜板層植片移植到貓角膜植床，研究也表明了貓對(duì)于基質(zhì)組織的免疫識(shí)別較低[9]。異種角膜移植研究取得進(jìn)展還有一層原因是貓的血管化傾向低，刺激新生血管快速生成可縮短角膜愈合時(shí)間，初步猜想是兔角膜植片以及縫線和傷口激活了血管內(nèi)皮源性生長(zhǎng)因子(vascular endothe-lial-derived growth factor,VEGF)，VEGF被認(rèn)為在新生血管的過程中起著至關(guān)重要的作用且是傷口修復(fù)的中心介質(zhì)，還可以下調(diào)免疫機(jī)制[10]。這一猜想還需進(jìn)一步驗(yàn)證，異種角膜移植方式治療貓角膜腐骨還需大量試驗(yàn)驗(yàn)證及優(yōu)化異體角膜植片處理方式和手術(shù)方式。