張春霞，李 鑫，歐蘭欣，葉碧錦，李 波，王紅彩，張浩吉，唐文強，王海峰，黃福強*

(1.青海農牧科技職業(yè)學院，青海湟源 812100；2.佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東佛山 528231；3.西藏自治區(qū)農牧科學院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850009；4.常加(上海)農業(yè)科技有限公司，上海 201414)

棘球蚴病(Echinococcosis)由棘球絳蟲屬絳蟲感染引起，是全世界范圍流行的人畜共患慢性寄生蟲病。根據感染棘球絳蟲的種類不同，棘球蚴病可分為由細粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)的幼蟲引起的囊型棘球蚴病(Cystic echinococcosis，CE)和多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis)的幼蟲引起的泡型棘球蚴病(Alveolar echinococcosis，AE)[1]。我國是棘球蚴病發(fā)病率較高的國家之一，并且某些地區(qū)以泡型棘球蚴病為主。

棘球絳蟲蟲卵在外界環(huán)境中耐受性較強，0℃可以存活116 d，50℃可以生存1 h，并且對化學物質的抵抗力也極強[2]。成蟲寄生于食肉類動物犬、狼等動物的小腸，中間宿主為偶蹄類動物如牛、羊等以及靈長類(包括人)動物。棘球蚴通過消化道進入宿主體內，再借助血液或者淋巴循環(huán)遷移到其寄生部位[3]，主要侵犯肝臟，其次是肺臟，其他部位也可受罹。

目前，臨床上常用阿苯達唑、吡喹酮以及奧苯達唑等藥物為感染病畜治療，但是治療效果欠佳，副作用大，且存在耐藥性等潛在風險[4]。相反，疫苗具有安全、無殘留、接種動物無休藥期等優(yōu)點，并且符合當前“預防為主，治療為輔”的工作方針，疫苗免疫是疫病防控的重要手段之一。因此，加速研制出有效的棘球蚴病疫苗對畜牧養(yǎng)殖業(yè)以及人類的健康均具有重要意義。

自2013年開始，來自多個國家的兩個聯合科研團隊分別完成了細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲的全基因組測序工作[5-6]?；蚪M測序工作的完成，為后續(xù)對棘球蚴代謝、發(fā)育和免疫逃避等生命活動的研究奠定了重要基礎，其診斷標志物和疫苗的研究也得以受益。研究人員也利用各種先進技術合成了多種棘球蚴標志性抗原分子，例如AgB、Eg95、EgA31等，并利用這些標志性抗原制成了針對棘球蚴病的疫苗和診斷試劑。

1 疫苗

抗蠕蟲疫苗的研發(fā)是一個非常有挑戰(zhàn)性的課題，因為蠕蟲在宿主體內的寄生過程中會觸發(fā)一系列的逃避機制。有科研團隊研究發(fā)現，在細粒棘球蚴和多房棘球蚴的基因組中分別有7個和6個抗原B基因，這些基因所表達的蛋白能分泌到體外，在其免疫逃避中發(fā)揮了重要作用[7]。這些逃避機制大大增加了疫苗研制的難度。除此之外，由于棘球絳蟲是多細胞寄生蟲，抗原結構和生活史相對都比較復雜，使得單價抗原疫苗可能出現抗原漂移，從而造成疫苗的免疫效果大打折扣。

尋找對不同宿主、不同發(fā)育階段的棘球蚴都有效的疫苗抗原是現在疫苗研發(fā)工作最重要、最艱難的任務，尤其是針對終末宿主犬疫苗的研發(fā)。目前，疫苗的研發(fā)工作中，已經出現了比較成熟的可用于對羊大面積免疫接種的Eg95抗原以及諸如EgA31、EgM、EgTPx和TSP3等在實驗室表現較好的候選抗原。

1.1 粗抗原

最初的棘球蚴疫苗主要是以棘球絳蟲分泌物和代謝物、六鉤蚴或原頭蚴分泌物等為抗原制成的。朱興全、Osborn PJ曾分別對細粒棘球絳蟲六鉤蚴分泌物的免疫原性進行研究，結果發(fā)現其免疫保護力可達96%～99%。但是由于粗抗原的成分過于復雜，含有多種抗原蛋白，并且生產成本過高，很難批量生產，因此現在已經不可避免地被其他類型的疫苗所替代。

1.2 Eg95/Em95基因家族

Eg95/Em95基因家族分別屬于細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲，都由多個基因組成,該基因家族成員編碼的蛋白均含有類纖連蛋白Ⅲ結構域(fibronectin type Ⅲ domain-like).該基因家族不僅在同基因型不同基因間高度保守，在不同基因型之間亦高度保守[8]。

棘球絳蟲六鉤蚴、原頭蚴以及成蟲的體表都含有大量Eg95/Em95基因所編碼的蛋白質，該蛋白表面共有6個抗原決定簇。Eg95/Em95蛋白在棘球絳蟲的整個生長發(fā)育過程中必不可少，這提示了其能夠誘導宿主產生免疫保護，可以利用這一特性以Eg95/Em95蛋白為抗原制作棘球蚴病的疫苗。

1.2.1 合成肽疫苗 構象表位是Eg95蛋白誘導免疫應答的主要部位，同時也是宿主的保護性抗原表位結構類型，這為棘球蚴病合成肽疫苗研發(fā)提供了理論依據。Woollard D J曾完成了合成Eg95表位4條多肽的工作，并在做成偶聯肽后加入佐劑制成合成肽疫苗。試驗結果顯示，該疫苗具有較高的免疫保護率，但是這些多肽都僅具有免疫原性，能夠誘導宿主產生大量特異性抗體，卻都沒有反應原性[9]。Lightowlers M W也做過類似的試驗，為羊注射Eg95重組蛋白疫苗，羊群同樣得到了較好的保護。

合成肽疫苗全部是由人工合成的，沒有核酸成分，并且可以彌補常規(guī)疫苗的一部分不足，因此被認為是一種更加高效、穩(wěn)定、經濟的疫苗。但是疫苗的自身組成和宿主的免疫系統(tǒng)都可以影響其抗原性及免疫原性，免疫對象的免疫力也不能垂直傳播，還有一些中和表位都為構象表位。這些問題極大地限制了合成肽疫苗的開發(fā)和推廣。

1.2.2 核酸疫苗 核酸疫苗即DNA疫苗，是通過為宿主接種某種編碼特定抗原蛋白的核酸，使該蛋白在宿主體內得以表達，從而刺激宿主產生針對該抗原蛋白的特異性免疫應答反應。

林仁勇團隊研究發(fā)現，Eg95抗原基因在棘球絳蟲不同成長階段的基因序列幾乎沒有差異，這一發(fā)現提示了Eg95基因的核酸疫苗針對不同發(fā)育階段的棘球絳蟲都是有效的[10]。該團隊還成功克隆并構建了棘球蚴的核酸疫苗pcDNA3-Eg95，后續(xù)試驗也證明了該疫苗的有效性。Scheerlink JP也開展了相關試驗，不同的是他先用攜帶有Eg95基因的質粒進行免疫，然后用了Eg95蛋白疫苗進行加強免疫，結果顯示免疫對象體內產生了相當高水平的IgG1抗體[11]。

1.2.3 基因工程疫苗 基因工程重組疫苗的原理就是利用DNA重組技術，將編碼保護性抗原的基因導入到原核或真核表達系統(tǒng)，使其高效表達，從而提取到保護性抗原的肽鏈，再加入佐劑即制成了基因工程的重組疫苗。

棘球蚴病首個Eg95基因工程重組疫苗由Heath DD研制成功，實驗室試驗結果顯示免疫效果較好。此后多個研究團隊也陸續(xù)展開了對棘球蚴基因工程疫苗的相關研究與探索。丁劍冰團隊成功構建了Eg95基因的原核表達質粒，于琳琳團隊也成功構建了Eg95-(C3d)3重組桿狀病毒表達系統(tǒng)。這些試驗都強有力地證明了重組質粒所表達的重組蛋白具有良好的免疫原性。

除此之外，還有一種應用非常廣泛的基因重組疫苗是重組病毒活載體疫苗。有研究團隊曾用羊口瘡病毒作為重組疫苗病毒(recombinant vaccinia virus,VACA)載體，成功構建了Eg95載體病毒活疫苗。使免疫動物在產生針對口瘡病毒抗體的同時，也產生了針對Eg95的特異性抗體，并且該抗體水平不亞于用純化抗原制備疫苗刺激產生的抗體水平。

1.2.4 其他類型疫苗 除了以上3種主流疫苗以外，還有一些新型疫苗技術被用于棘球蚴病疫苗的開發(fā)，例如基因工程重組細菌載體活疫苗、轉基因植物疫苗等。這些疫苗所具有的共同點就是都利用了Eg95基因或Eg95基因家族所編碼的蛋白。盡管現在已經有了如此多種類的疫苗，但是只有細粒棘球絳蟲羊株(G1)的Eg95基因工程亞單位疫苗在生產中應用，其余大多數疫苗都還處于實驗室探索階段。

1.3 EgA31、EgTrp

EgA31和EgTrp蛋白均在胚乳期表達，尤其是在原頭節(jié)下水平表達，參與了原頭蚴和成蟲的發(fā)育過程，是細粒棘球絳蟲成蟲發(fā)育調控的重要蛋白之一[12]。以EgA31為抗原的疫苗主要是針對細粒棘球蚴病的終末宿主犬，該類疫苗可以大幅度降低棘球絳蟲的產卵率，減緩蟲體發(fā)育速度，并能提高宿主的IgA抗體水平[13]。

Fraize M的研究表明EgA31、EgTrp或EgA31-EgTrp能大幅提高IgG和IgA的抗體滴度[14]。Petavy AF以沙門氏菌弱毒株為載體，制成了EgA31和EgTrp的口服重組疫苗，對犬口服免疫，這也再次證明了EgA31可以作為包蟲病終末宿主疫苗的候選蛋白。

1.4 EgM家族

EgM家族蛋白主要由EgM4、EgM9以及EgM123共3種蛋白組成，可以抑制棘球絳蟲蟲體的生長，對蟲卵和六鉤蚴的抑制作用尤為明顯[3]。并且EgM蛋白疫苗的主要免疫對象為棘球絳蟲的終末宿主犬，可以在犬的體內發(fā)揮免疫保護作用，誘導其產生免疫應答從而阻止蟲體的發(fā)育。

張文寶團隊成功利用EgM家族蛋白中的EgM9對犬進行免疫，結果顯示抑制蟲體發(fā)育的效果非常顯著，使蟲體發(fā)育受阻，不能產卵。這也正是針對終末宿主的疫苗最需要的效果之一。

1.5 EgTPx

EgTPx蛋白是棘球絳蟲體內的一種硫氧還蛋白過氧化物酶，可以保護蟲體免受宿主氧化損傷過程造成的傷害，起著非常重要的抗氧化作用[15]。對蟲體在人和其他中間宿主內穩(wěn)定寄生、生長和存活十分重要。王慧團隊成功實現了EgTPx編碼基因的原核表達，又通過對小鼠進行免疫，制備了EgTPx抗體。

1.6 p29

作為一種重組抗原分子，p29也得到了多方學者的研究。據GO富集和KEGG通路聯合分析的結果可以得出，在p29免疫和細粒棘球蚴感染的兩個階段中，和免疫有關的多個過程比如免疫正調控、炎癥反應、B細胞穩(wěn)態(tài)以及細胞因子受體相互作用等，被注釋出了多種差異表達的mRNA[2，16]，而這些過程正是宿主在疫苗免疫和感染后機體會產生的變化。

Shi Z的團隊也對p29抗原分子做了相關研究，結果顯示對繼發(fā)感染細粒棘球蚴的小鼠可以產生96.6%的免疫保護力，對感染蟲卵的綿羊也能產生94.8%的免疫保護力[17]。

1.7 FABP

蠕蟲寄生蟲體內含有一種多基因家族編碼的低分子質量包漿蛋白，稱為脂肪酸結合蛋白(FABP)。目前已經在細粒棘球絳蟲中鑒定出兩種類型的脂肪酸結合蛋白家族，即EgFABP1和EgFABP2[18]?，F已有研究證明，在宿主體內將脂質分子運輸到寄生蟲細胞的過程中，FABPs作為載體蛋白發(fā)揮著關鍵的中間作用[19]。這也提示了這些FABP可用于構建針對細粒棘球絳蟲的疫苗。在后來的疫苗試驗中，口服rEgFABP1免疫產生了比較顯著的高水平抗體。

1.8 其他疫苗候選分子

除了前文介紹的這些抗原分子，還有大量蛋白被研究團隊作為疫苗的候選抗原研究，并且效果較好。比如包蟲囊腫液(HCF)中的Antigen 5,因為rEgAg5含有多個具有高免疫原性的B細胞和T細胞激活表位，可作為終末宿主和中間宿主疫苗的候選抗原[20]。但因為EgAg5在成蟲期僅有弱表達，并且容易與p29發(fā)生交叉反應[21],因此該抗原還停留在實驗室研究階段。還有如Eg14-3-3，作為一個普遍存在的蛋白質家族，是棘球絳蟲成蟲喙腺的分泌成分，它在細胞周期、分化以及生長調節(jié)和細胞凋亡調節(jié)等多個過程中發(fā)揮著關鍵作用[22]。除此之外，還有EmⅡ/3-10[23]、ANX[24]、EgTeg[25]、TSP3[26]等，還有學者將多個抗原整合起來制成一個多細胞表位的抗原，都有不錯的免疫效果。

2 診斷

目前，棘球蚴病的診斷方式主要是采用影像學檢查，再結合臨床癥狀和流行病學確診。遺憾的是影像學技術還無法實現棘球蚴病的早期診斷，這時就需要借助在早期診斷中非常有優(yōu)勢的免疫學檢測方法[27]。

2.1 血清學診斷

棘球絳蟲病免疫診斷的抗原主要來自于包囊液(HF)。針對不同類型的棘球蚴病，所用到血清中的抗原也不盡相同。

2.1.1 細粒棘球蚴抗原 HF脂蛋白抗原B(AgB)和抗原5(Ag5)廣泛應用于細粒棘球蚴引起的囊性棘球蚴病(CE,即包蟲病)的血清學分析。經手術切除證實的CE患者血清學檢測方法的敏感性和特異性從60%～90%不等。使用富集Ag5以及基于重復串聯細粒棘球蚴的重組AgB和Ag5均可以極大地提高其診斷價值[28]。大量其他新抗原例如表皮蛋白EgTeg、堿性磷酸酶EgAP和EpC1在所選血清樣本上也都表現出了90%左右的敏感性和特異性[29]。

但是，對它們的性能還從未進行過大規(guī)模的評估，僅停留在實驗室階段。目前報告的抗原敏感性和特異性還不夠高，導致其無法作為診斷或大規(guī)模人群篩查的首選工具。Casoni的皮內試驗也證實了這些抗原的特異性和敏感性不夠高，僅可用于側面印證影像學的診斷結果。

2.1.2 多房棘球蚴抗原 相比于CE，由多房棘球蚴引起的泡性棘球蚴病(AE)所用到的血清學檢查較為可靠。Em2和Em492代表了完整囊尾蚴排泄物和分泌物的成分，EmAP和EmP2對多房棘球蚴感染診斷具有較高的特異性[30]。Em10或其衍生物EmⅠ/3以及由Em10部分基因序列編碼的蛋白Em18在診斷AE方面顯示出較高的性能，但其純化十分困難，難以滿足需求。目前一種商業(yè)化的EM2-葡聚糖酶聯免疫吸附試驗(ELISA)已廣泛用于AE的臨床診斷，其敏感性和特異性均超過了90%。

一些報告顯示，在一些大規(guī)模使用血清學篩查的地方，一部分人口的血清學檢查呈陽性，卻沒有AE病變。在患有AE的免疫抑制患者中，血清學檢查也經常呈陰性，因此還不應將血清學診斷結果單獨用作該疾病的診斷論據[31]。

2.2 卵抗原

棘球絳蟲的主要卵抗原(major egg antigen，EmMEA)中的p40(MEAp40)是一種免疫原性良好的分子，可以誘導宿主產生較為強烈的體液免疫和細胞免疫反應，可以作為診斷試劑甚至疫苗的候選抗原。Western-blot和ELISA的結果也進一步證實了重組EmMEA可與多房棘球蚴感染小鼠的血清發(fā)生特異性反應，且敏感性和特異性均達到了99%以上[32]。

2.3 游離DNA

存在于血液、尿液和唾液等體液中的細胞外游離狀態(tài)的DNA分子被稱為游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)。通過基因組重測序技術和生物信息學分析相互印證，發(fā)現在細粒棘球絳蟲病患者的血漿中存在著屬于細粒棘球蚴的蟲源cfDNA，近期也有相關研究再次證實了這一觀點[33]。這些結果都表明了體液中的蟲源cfDNA可以作為標志物應用于棘球絳蟲病的診斷。后續(xù)通過采集感染不同生長時期、不同型別棘球絳蟲患者的血樣，有望篩選出更加理想的核酸診斷標志物。

2.4 其他抗原

曾用于棘球絳蟲病疫苗的粗抗原也可用于AE或CE的免疫學診斷，但是因為容易與其他寄生蟲的抗原發(fā)生不同程度的交叉反應，所以即使其具有較好的敏感性和特異性，也不能制成可靠的診斷試劑。除此之外，還有學者通過構建pET30α-Eg95-5載體，成功獲得了Eg95-5蛋白。Western blot的結果顯示該蛋白可以與患病動物的陽性血清發(fā)生反應[34]，提示其具有用于棘球蚴病檢測的潛力。

3 展望

不管是AE還是CE，都是十分嚴重的人畜共患寄生蟲病，對畜牧養(yǎng)殖業(yè)和人類生活都能產生巨大的影響。在棘球蚴的生活史和傳播途徑中，犬是一個十分重要的終末宿主，在其體內還有大量的蟲卵。因此，目前控制該病傳播的重要措施便是給犬定期驅蟲，阻止在中間宿主體內的發(fā)育。這也提示了根據免疫對象的不同，需要不同功能的疫苗。針對終末宿主犬，需要讓疫苗發(fā)揮清除蟲卵，降低成蟲產卵率，阻止棘球蚴傳播的作用。針對中間宿主牛、羊，更需要疫苗可以激發(fā)免疫對象的免疫系統(tǒng)，使其被棘球蚴感染以后可以快速產生大量抗體，增強其抵抗力。雖說已經探索出多種可以作為候選抗原的蛋白和基因，甚至可以在不同的宿主體內亦或是針對不同時期、類型的寄生蟲發(fā)揮不同的作用，但其中的大部分都還沒有經過大規(guī)模的試驗，都還僅僅停留在實驗室探索階段。這就需要開發(fā)出免疫效果更好的候選抗原或接種方式。

棘球蚴病的傳播范圍較廣，傳播方式也較為隱蔽，這就需要能夠盡早診斷出宿主的棘球蚴病。而常用的影像學技術還無法實現早期診斷，只能依靠在早期診斷比較有優(yōu)勢的免疫學診斷。前面描述的目前常用的免疫試劑總體效果不錯，但都存在各種各樣的缺陷或者不足，比如診斷試劑所用的抗原常與宿主體內針對其他絳蟲甚至吸蟲產生的抗體發(fā)生交叉反應[35]。因此，需要開發(fā)出特異性和敏感性極高且假陽率較低的蛋白作為新的診斷試劑和候選抗原。