劉洪蕾，王 真

(北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院，北京 102206)

單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes,LM)簡稱單增李斯特氏菌，是李斯特氏菌屬中唯一的一種人畜共患病的病原菌，為革蘭氏陽性兼性厭氧胞內(nèi)寄生菌，常見于食品中，人、畜及禽類均可被感染而引起李斯特氏菌病。在生物膜的作用下單增李斯特氏菌可在極端的情況下生長存活，同時具有耐高鹽、抗酸堿的特點。因其對環(huán)境及理化因素的抵抗力極強，故而可在自然界中廣泛存在，又因為該病原菌可在4℃條件下生長繁殖，也是在冷藏食品中對人類健康產(chǎn)生威脅的主要致病菌之一[1-2]。食品作為傳播中的一個重要傳染源，因此在食品的預處理加工、運輸、保藏過程中都有可能造成不同程度的LM污染，人食用污染的食品后可能會引起相應的李斯特氏菌病，出現(xiàn)一系列臨床反應如腸胃炎、腦膜炎、敗血癥、胎兒流產(chǎn)、單細胞增多等，在各個年齡層均可能引起發(fā)病，其中新生兒、老年人、孕婦以及免疫低下者的發(fā)病率最高。在主要的食源性致病菌中，單增李斯特氏菌感染引起的病死率最高達20%～40%[3-5]。世界衛(wèi)生組織(WHO)將單核細胞增生李斯特氏菌列為四大食源性的致病菌之一。

經(jīng)濟的迅速發(fā)展和人民生活水平在近些年來不斷提高，以至于人民的生活質(zhì)量也得到了極大的改善并有了更高的追求，食品安全也成為了民生關注的問題，有關于食品污染及食源性致病菌疾病的公共衛(wèi)生問題也逐漸成為熱門話題之一。沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特氏菌是目前國內(nèi)的禽肉食品中較為常見的3種食源性致病菌。經(jīng)統(tǒng)計，食源性疾病的發(fā)病率逐步升高，在各種疾病的總發(fā)病率中排名靠前。因此，對食品中單增李斯特氏菌的及時監(jiān)測尤為重要，目前檢測方法主要有傳統(tǒng)鑒定法、分子學檢測法、免疫學檢測法等[6]。本文將對上述檢測方法的研究進展對比分析，為選擇和建立更加敏感、高效的單增李斯特氏菌檢測方案提供依據(jù)參考。

1 傳統(tǒng)分離鑒定法

平板培養(yǎng)法是用于單增李斯特氏菌檢測的傳統(tǒng)方法，用選擇性培養(yǎng)基進行富集可抑制背景菌群生長，并對目標病原體進行選擇性增殖以便于其分離檢測。通過對分離菌落進行染色鏡下觀察、生化鑒定、動力試驗、血清學試驗等可得出定性檢測結(jié)果[7]。平板培養(yǎng)法靈敏度高，成本低，可給出定性和定量結(jié)果，但操作步驟多，過程較復雜，從培養(yǎng)得到可疑菌落到檢測得出確定結(jié)果，整個周期需要5 d～14 d[8]，對有效預防和控制食源性致病菌疾病的暴發(fā)有些困難。

2 分子生物學檢測技術(shù)

2.1 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)檢測技術(shù)是分子生物學技術(shù)中較為傳統(tǒng)的技術(shù)，該方法主要通過細菌的特異毒力基因序列來設計特異性強的引物，對目的基因進行擴增后完成單增李斯特氏菌的檢測工作，hlyA、plcB、actA、inlA、prfA等靶基因是PCR中比較常用的[9-10]。

2.2 多重PCR

多重PCR的原理是根據(jù)不同基因序列設計2對及以上引物，在同一反應體系中進行雙基因的擴增，可以檢測同一致病菌或不同致病菌，特異性更強，減少了酶、試管等相關實驗用品的成本，并且可實現(xiàn)樣本高通量檢測[11-13]。但是該方法對引物特異性要求很高，易引發(fā)相互干擾導致擴增效率下降。韓笑[14]利用李斯特氏菌屬和單增李斯特氏菌的特異性引物，用免疫磁珠捕獲得到的菌體作為模板建立免疫磁珠-雙重PCR聯(lián)用的LM檢測方法，優(yōu)化后的條件下該方法對純培養(yǎng)菌靈敏度達106CFU/mL。胡冰雪[12]等分別設計了針對LM、熒光假單胞菌和沙門氏菌的致病基因(hlyA、gyrB、invA)的特異性引物，用多重PCR技術(shù)同時檢測3種標準菌株，結(jié)果顯示純菌DNA檢測限可達1 pg/μL，表明該方法具有較高的特異性。Parichehr[15]等通過制備一種新的單一非選擇性預富集培養(yǎng)基(ELSS)，進行mRT-PCR檢測和定量。結(jié)果在ELSS中預富集16 h后，用mRT-PCR檢測污染牛奶中每種病原菌的檢出限為1 CFU/25 mL，包容性和排他性均達到100%。

2.3 實時熒光定量PCR

實時熒光定量 PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR的基礎上在反應體系中加入熒光染料或者熒光探針，隨著目的片段的擴增，熒光信號不斷積累變化，通過檢測器上熒光信號的變化實時監(jiān)測擴增過程，再根據(jù)標準曲線對目標菌進行定量，這種檢測技術(shù)具有高特異性，實現(xiàn)了PCR技術(shù)從定性到定量的飛躍[16]。同時，反應是在密閉體系中進行的，無需進行瓊脂糖凝膠電泳實驗可避免交叉污染。熒光定量PCR作為近年流行起來的一項新技術(shù)，既具有探針高度特異性、核酸擴增高效性和容易定量分析等的優(yōu)勢，也摒棄了普通PCR易污染、無法定量分析等缺點。不過，該方法的測試成本較高，而且酶的生物活性也很易被各種食品基質(zhì)成分所影響和控制，對引物和探針上的特異性靶基因序列選取和設計要求也相當高，如果選取和設計錯誤很可能會大大降低檢驗敏感度和特異性[17，18]。田小蘭[19]建立了利用qPCR技術(shù)對單增李斯特氏菌的特異性檢測體系，檢測結(jié)果顯示qPCR對LM的純培養(yǎng)菌液檢測限為1.12 CFU/mL，在人工污染的魚肉樣品中qPCR對單增李斯特氏菌檢測限達1.12×101CFU/mL。

2.4 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是在恒溫條件下利用有鏈置換活性特點的聚合酶，通過設計特異性引物進行核酸擴增，可以直接通過肉眼判斷檢測結(jié)果，觀察離心管的底部是否有白色的沉淀生成[20]。與常規(guī) PCR相比，LAMP不需要溫度變化、電泳、紫外線觀察結(jié)果，擴增效率極高，整個擴增只需在一個水浴鍋中恒定溫度30 min～60 min即可完成，其優(yōu)點是快速、簡單、特異性強、靈敏度高[21]。此項技術(shù)不用專門的PCR相關儀器就能滿足現(xiàn)場、高通量快速檢測的需求，而且成本比熒光定量PCR大大降低。但它也存在缺點，就是引物設計嚴格、要求擴增序列的長度小于300 bp、檢測時極易被污染，因而產(chǎn)生假陽性[22]。田小蘭[19]建立LM的特異性LAMP檢測體系，表明在60 ℃時純培養(yǎng)菌液LAMP擴增效果最好，單增李斯特氏菌的檢出時間為32 min，檢出限最低為2.0×101CFU/mL。周振森[23]等針對LM的特異性溶血素基因(hly)設計了多組引物，通過對引物對進行篩選配比進行優(yōu)化確立了檢測LM的實時熒光RT-LAMP方法，結(jié)論為對單增李斯特氏菌的菌懸液靈敏度為101CFU/mL，是RT-qPCR方法檢測靈敏度的10倍。直接檢測人工污染模型樣品的檢出限為103CFU/mL，但是對樣品進行16 h增菌后，檢出限即可提高到100 CFU/ 25 mL。Ledlod[24]等結(jié)合環(huán)介導等溫擴增和雙向側(cè)流層析技術(shù)試驗用于單增李斯特氏菌的鑒定。結(jié)果顯示基因組DNA和純培養(yǎng)物的方法檢測限分別為900 fg和20 CFU/mL，且與其他18種致病菌沒有交叉反應。在100份食品樣品中與其他標準檢測方法相比達到100%的準確性。

2.5 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)的原理是使用已知的核苷酸序列作為探針與待檢測樣品的標記基因結(jié)合，兩者進行雜交，芯片通過熒光檢測器進行掃描分析信號從而得到檢測結(jié)果。一個基因芯片上，可以加多個探針，實現(xiàn)一個實驗同時檢測出多種致病菌。因此，基因芯片技術(shù)通過提高檢驗效率，以實現(xiàn)食源性致病菌的高通量檢測分析，縮短時間，節(jié)省資源。楊彤等[25]利用特異性探針Lm-16S-2初步建立單增李斯特氏菌液相肽核酸熒光原位雜交方法，試驗結(jié)果顯示特異性很強，與傳統(tǒng)細菌生化鑒定法敏感性相同，檢測限均為104CFU/mL，且重復性、穩(wěn)定性好。

3 免疫學檢測技術(shù)

免疫學檢測技術(shù)原理是利用抗原抗體的特異性結(jié)合，對待檢樣品進行定性或定量分析，該技術(shù)的優(yōu)點主要有操作簡便、靈敏、快速、可同時檢測大量樣品等。目前的免疫學檢測方面常用的技術(shù)主要有免疫磁分離技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫層析法等。

3.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immune-sorbent assay，ELISA)是基于抗原或抗體能吸附在固相載體的表面，并保持其免疫活性，加入待檢樣品后抗原或抗體與酶結(jié)合形成的復合物，再與底物反應，經(jīng)催化后變?yōu)橛猩a(chǎn)物，根據(jù)顏色反應的深淺對待檢樣品進行定性或定量的分析，通常使用的有間接ELISA、夾心ELISA。它相較于其他技術(shù)比操作較容易，特異性強，靈敏度高，標準化程度較高，并且可以對大批量樣品進行同時檢測，但單克隆抗體應用時制備昂貴、洗板等操作過程繁瑣、成品試劑盒成本高。趙萌[26]利用兔源多抗(IgG)和雞源多抗(IgY)經(jīng)過純化后建立了LM雙抗夾心ELISA檢測方法，優(yōu)化條件后對該方法進行評價，其檢測限為6×106CFU/mL，定量限為1.2×107CFU/mL。

3.2 免疫層析法

免疫層析技術(shù)通常在毛細管的作用下，以膠體金、熒光素、量子點等多種作為標記材料，在硝酸纖維素膜等固相載體上抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應，可利用標記材料的顯色作用或熒光效應肉眼直接觀察檢測條帶，或者通過測量熒光強度得到結(jié)果來進行定性定量分析[27]。該方法對操作人員條件要求低，也無需昂貴的儀器設備，檢測時間短(10 min～15 min)，且容易進行現(xiàn)場的快速測定，故主要用作定性或半定量篩選手段。但是該方法敏感性低，檢測結(jié)果容易受周圍檢測環(huán)境的影響。張賽[28]利用免疫熒光層析篩選出了合適的配對抗體，并優(yōu)化試紙條性能，結(jié)論得出試紙條抗體標記濃度為0.6 mg/mL，檢測線的抗體濃度為2 mg/mL，層析時間是20 min的最佳條件；純培養(yǎng)物的檢測限為4×105CFU/mL，人工污染樣品最低檢測到4×105CFU/mL。張帥等[29]制作的膠體金免疫層析試紙可以同時進行生鮮肉中的單增李斯特氏菌、志賀氏菌和沙門氏菌檢測，3種致病菌靈敏度均可達1×104CFU/g。

3.3 免疫磁分離技術(shù)

免疫磁分離技術(shù)(immunomagnetic beads，IMBS)是對具有超順磁性特性的微顆粒表面進行修飾，使之能與相應的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，結(jié)合后可形成特異性抗體-免疫磁珠復合物，在磁場條件下兩者進行分離，以達到富集靶標抗原的目的。此方法技術(shù)特異性高，敏感性好，分離富集快速，應用范圍廣泛。在實際應用中，該方法可以單獨使用或與ELISA技術(shù)、PCR技術(shù)等聯(lián)合使用以縮短檢測時間，改進和增強方法的靈敏度。但是該技術(shù)的不足是其對靶標抗原的特異性要求很高，否則容易捕獲到許多雜菌。李敏等[30]將免疫磁珠技術(shù)與雙重PCR技術(shù)相結(jié)合檢測 LM，極大程度地提高了檢測特異性，降低了檢測結(jié)果中出現(xiàn)假陽性的概率，不僅為下一步的篩選工作減少時間，也降低了工作量。Wang等[31]將納米免疫磁分離技術(shù)與量子點熒光分析相結(jié)合，可實現(xiàn)2 h內(nèi)同時靶向檢測食物樣品中的單增李斯特氏菌、大腸埃希氏菌和鼠傷寒沙門氏菌，在樣品中檢測限為20 CFU/mL～50 CFU/mL。Garrido[32]等將實時重組酶聚合酶擴增和免疫磁性分離結(jié)合并成功應用于檢測50份煙熏三文魚樣品，預富集24 h后，檢測到2×102-9.3×102CFU/25 g 單增李斯特氏菌，檢測結(jié)果有了很大的提高，該方法檢測限為6.3 CFU/25 g，靈敏度、特異性和準確度相比于其他RPA方法更高。

4 生物傳感器

生物傳感器是由生物識別和信號轉(zhuǎn)換兩種元件組成，通過檢測目標化合物輸出的電和光信號，以此進行分析檢測。根據(jù)生物傳感器的信號轉(zhuǎn)換器不同，可以將其分為電化學式生物傳感器、光學式生物傳感器等。生物傳感器這種方法可快速完成檢測，有的甚至只需幾個小時就可完成并且操作簡單。但是在實際應用中該技術(shù)讀取熒光時需使用大型儀器，不便捷且對實驗的環(huán)境要求比較高[33，34]。黃閃閃[35]制備了兩種傳感器分別為以道諾霉素為雜交指示劑和無需指示劑的電化學生物傳感器。檢出限達3.78×10-14moL/L，敏感度較高，且具良好的特異性、穩(wěn)定性與重現(xiàn)性。程超男[36]將免疫分析與電化學技術(shù)結(jié)合構(gòu)建了基于夾心法模式的計時電流法電化學免疫傳感器，用于快速靈敏地檢測單增李斯特氏菌。在優(yōu)化的條件下定量檢測結(jié)果表明檢測限為102CFU/mL，檢測時間只需200 s且無交叉反應。應用于對牛奶中LM檢測結(jié)果得出范圍在103CFU/mL～106CFU/mL且不需要對樣品進行前處理可以直接檢測。Wang[37]等建立了一種基于PCR的一步通用生物傳感器，利用動態(tài)光散射(DLS)技術(shù)檢測核酸和蛋白質(zhì)的大小。該傳感系統(tǒng)采用DNA修飾的AuNPs(AuNPs DNA)探針作為TaqMan信號探針，該策略可實現(xiàn)目標雙鏈DNA(ds DNA)的序列特異性識別，克服PCR周期增加引起的背景信號變化。進一步證明了其在檢測食源性病原體單增李斯特氏菌的適用性，檢測限為1.2 fg/μL，比比色法更靈敏。

5 代謝組學技術(shù)

代謝組學是研究微生物代謝產(chǎn)物動態(tài)變化的規(guī)律，應用較廣泛的是ATP生物發(fā)光檢測技術(shù)。利用的是由于活菌內(nèi)含有ATP ，當細菌死亡后ATP被細胞內(nèi)的酶分解，通過熒光素酶和熒光素可以使其釋放能量并產(chǎn)生熒光信號，因此熒光信號的量與ATP 濃度成線性關系[38]。活菌總數(shù)通過ATP 的濃度測定即可推算出。該法操作簡單，不需要培養(yǎng)樣本中的微生物，靈敏度高，可用于檢測食物中LM，但是易受溫度、酸堿、食品中基質(zhì)等條件影響，該法無特異性。

6 展望

傳統(tǒng)的單增李斯特氏菌檢測技術(shù)所需要的檢測成本少，而且對操作人員的要求不像分子學方法一樣高，不足之處是耗費時間浪費人力，對一些不可培養(yǎng)或者較難培養(yǎng)的致病菌無法完成檢測，檢測過程往往耗時較長需幾天才能完成，無法實現(xiàn)對結(jié)果有效的監(jiān)控和預防。分子生物學技術(shù)雖然具有高敏感性、高特異性的特點，但是對檢測人員的操作要求高，預處理較復雜，需要的相關試劑和設備價格高昂，主要用于實驗室分析且不適合現(xiàn)場檢測。目前應用最多的是實時熒光定量PCR以及LAMP，市場上也有相應試劑盒，檢測更為方便快捷，可對樣品進行定量。免疫學測定方法，簡單快捷，尤其是免疫層析試紙條攜帶非常方便，很適合進行現(xiàn)場的快速檢測，但易受其他雜菌干擾，靈敏度不夠高。免疫磁分離技術(shù)也逐漸發(fā)展起來，利用其作為樣品預處理進行增菌并與其他分子免疫學方法聯(lián)合應用可極大地提高靈敏度。以免疫學和核酸分析為基礎的生物傳感器檢測技術(shù)也逐漸運用到檢測致病菌中，而且不需要對樣品預增菌處理，但是制備傳感器復雜而且較難推廣開。以上這些技術(shù)雖然目前還存在很多不足，但是隨著科學技術(shù)的不斷更新發(fā)展會得到進一步的完善和改進措施，特別是近年來不同學科之間的相互滲透日益加強，不同方法之間的結(jié)合使用也會成為未來食源性單增李斯特氏菌檢測的發(fā)展前景。