焦 洋 劉書杰 楊得玉 孫 璐 李積蘭 馮宇哲 崔占鴻*

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海省牦牛工程技術(shù)研究中心，青海省高原放牧家畜動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810016；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧810016)

牦牛是青藏高原地區(qū)牧民主要飼養(yǎng)的優(yōu)勢反芻家畜，能夠適應(yīng)當(dāng)?shù)剌^為惡劣的自然生態(tài)氣候和生存環(huán)境。然而在牦牛犢牛的早期培育過程中，仍存在吃奶不足、生長較慢、體況薄弱和腹瀉疾病易發(fā)等的突出問題，是牦牛培育的重要窗口期[1]。同時(shí)，在冬季極度嚴(yán)寒的狀態(tài)下，由于牦牛犢牛早期適時(shí)斷奶、補(bǔ)飼不到位而出現(xiàn)營養(yǎng)攝入不足，不能滿足前期生長發(fā)育也會影響后期培育質(zhì)量，嚴(yán)重時(shí)引發(fā)的疾病問題會導(dǎo)致牦牛犢牛發(fā)生死亡，給當(dāng)?shù)啬撩裨斐奢^大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。通過對牦牛犢牛進(jìn)行早期斷奶和補(bǔ)飼精料，提高了其生產(chǎn)性能和培育效果，促進(jìn)了其胃腸道和免疫器官的良好發(fā)育，說明早期斷奶培育和合理營養(yǎng)補(bǔ)飼對牦牛犢牛后期生長發(fā)育至關(guān)重要[3-6]。Van Niekerk等[7]研究發(fā)現(xiàn)，從液體牛乳過渡到固體飼糧的采食方式對早期牦牛犢牛的發(fā)育至關(guān)重要。因此，用代乳粉代替母乳，在適當(dāng)飼喂優(yōu)質(zhì)飼糧的同時(shí)再補(bǔ)飼精料，大大提高了其攝入的干物質(zhì)含量和營養(yǎng)水平，有利于其生長發(fā)育，也能為后期的高質(zhì)量生產(chǎn)奠定良好基礎(chǔ)。

胰腺作為內(nèi)臟器官中進(jìn)行消化代謝的腺體，其內(nèi)分泌部和外分泌部分泌的酶和激素對機(jī)體維持血糖穩(wěn)定和代謝平衡具有重要作用[8]。徐春卓等[9]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺內(nèi)外分泌部面積的增加可以促進(jìn)其內(nèi)外分泌部細(xì)胞分化和細(xì)胞分裂，促進(jìn)胰腺發(fā)育及其生物學(xué)功能的完善。江來等[10]運(yùn)用核磁共振代謝組學(xué)技術(shù)研究重癥胰腺炎大鼠的血液后發(fā)現(xiàn)，相較正常大鼠，其機(jī)體中的糖、蛋白質(zhì)、脂肪和核酸都發(fā)生了嚴(yán)重的代謝紊亂，說明了基于代謝組學(xué)技術(shù)可以更加精確地揭示其內(nèi)在的生理機(jī)制。王菊等[11]研究發(fā)現(xiàn)，給1日齡肉鴨飼喂不同磷酸氫鈣水平的飼糧，其中飼喂中等水平組肉鴨的胰腺重量、胰淀粉酶和胰蛋白酶的活性高于低水平組和高水平組。郭龍[12]研究發(fā)現(xiàn)，功能性氨基酸可以調(diào)控奶牛胰腺的發(fā)育，提高其生長發(fā)育和生產(chǎn)性能，但對于牦牛早期營養(yǎng)補(bǔ)飼從而調(diào)控胰腺發(fā)育的報(bào)道較少。哺乳期補(bǔ)飼精料可以提高牦牛犢牛營養(yǎng)攝入水平，提高胰腺分泌的消化酶和激素含量，進(jìn)而也影響了胰腺的生長發(fā)育。本試驗(yàn)以牦牛犢牛為研究對象，以哺乳期合理補(bǔ)飼精料為切入點(diǎn)，利用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，在早期斷奶后篩選其胰腺中小分子差異代謝物進(jìn)行通路分析，揭示哺乳期補(bǔ)飼精料對牦牛犢牛生長及胰腺發(fā)育的影響及作用機(jī)制，為建立牦牛犢牛培育的營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取體況健康、體重相近的斷奶(30±4)日齡的牦牛犢牛(公)20頭，分為對照組和試驗(yàn)組，每組10個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)在青海海北藏族自治州海晏海北高原生態(tài)畜牧業(yè)科技示范園的牧場中進(jìn)行。

1.2 飼養(yǎng)管理

在試驗(yàn)開始時(shí)，對照組飼喂代乳粉和苜蓿干草，試驗(yàn)組在對照組飼糧基礎(chǔ)上補(bǔ)飼精料。牦牛犢牛經(jīng)過30 d的預(yù)試期后，逐漸適應(yīng)飼喂水平和養(yǎng)殖環(huán)境。正式試驗(yàn)開始時(shí)，2組每天每頭犢牛飼喂0.48 kg代乳粉，每5 d增加0.01 kg。對照組每天每頭犢牛飼喂0.25 kg苜蓿干草，每5 d增加0.14 kg。試驗(yàn)組每天每頭犢牛飼喂0.125 kg苜蓿干草和0.125 kg精料，兩者每5 d都增加0.07 kg，即其苜蓿干草和精料飼喂量比例為1∶1。代乳粉、苜蓿干草、精料的組成及營養(yǎng)水平如表1所示。2組的固體干物質(zhì)采食量相同。試驗(yàn)期間牦牛犢牛實(shí)行單欄單圈飼養(yǎng)，自由飲水，定期做好消毒和清理活動(dòng)。

表1 代乳粉、苜蓿干草、精料營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 樣品采集

2組在經(jīng)過預(yù)試期30 d，正試期100 d后，牦牛犢牛平均日采食量達(dá)到1 kg時(shí)進(jìn)行屠宰試驗(yàn)。解剖后取出牦牛犢牛胰腺組織，采集長、寬、高分別為1.5、1.5、2.0 cm的組織樣本，用生理鹽水沖洗后，放入裝有4%多聚甲醛的50 mL離心管中固定；采集邊長為0.5 cm的小塊正方體組織樣本，裝入5 mL凍存管中再投入-196 ℃液氮罐中冷藏，最后轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.4 胰腺發(fā)育

屠宰試驗(yàn)前稱量牦牛犢牛體重，飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后分別從2組中各選取5頭牦牛犢牛進(jìn)行屠宰試驗(yàn)，取出胰腺組織進(jìn)行稱量計(jì)重，計(jì)算胰腺指數(shù)，計(jì)算公式如下：

胰腺指數(shù)(%)=100×胰腺重量/宰前體重。

經(jīng)過蘇木精-伊紅(HE)染色在顯微鏡下觀察胰腺組織切片，并在每張切片中隨機(jī)選取4個(gè)視野拍照。在統(tǒng)一視野內(nèi)總面積為1×105μm2的情況下，使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量并記錄其視野內(nèi)的胰腺面積，計(jì)算胰腺外分泌部面積總占比、胰腺內(nèi)分泌部面積總占比、胰腺內(nèi)外分泌部面積比，計(jì)算公式如下：

胰腺外分泌部面積總占比(%)=100×
胰腺外分泌部面積/胰腺總面積；
胰腺內(nèi)分泌部面積總占比(%)=100×
胰腺內(nèi)分泌部面積/胰腺總面積；
胰腺內(nèi)外分泌部面積比(%)=100×胰腺內(nèi)分泌部面積/胰腺外分泌部面積。

1.5 代謝組學(xué)分析

1.5.1 試驗(yàn)方法

將胰腺組織樣品取100 mg后用液氮研磨，加入500 μL的80%甲醇溶液充分混和均勻后置于EP管中。再用渦旋振蕩儀搖勻后水浴靜置5 min，在4 ℃離心機(jī)離心20 min。離心后取一定體積的上清液加質(zhì)譜水稀釋，直至甲醇含量為53%。再次在4 ℃離心機(jī)離心20 min，收集一定量的上清液，使用液相色譜儀-質(zhì)譜儀(LC-MS)進(jìn)行分析。

1.5.2 儀器分析

在確定色譜柱HypesilGoldcolumn (C18)后，選擇柱溫40 ℃，流速0.2 mL/min。在正離子模式下，流動(dòng)相A液0.1%甲酸，B液甲醇；在負(fù)離子模式下，流動(dòng)相A液5 mmol/L醋酸銨(pH=9.0)，B液甲醇。再經(jīng)過質(zhì)譜掃描質(zhì)荷比(m/z)100～1 500后得到數(shù)據(jù)文件。將其導(dǎo)入CD 3.1軟件中進(jìn)行處理，設(shè)置質(zhì)量偏差5 ppm、信號強(qiáng)度偏差30%、信噪比3等信息進(jìn)行峰提取與面積定量。進(jìn)行分子式預(yù)測后與mzCloud、mzVault和Masslist數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，對定量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化處理后得到代謝物的鑒定和相對定量結(jié)果。

1.6 數(shù)據(jù)處理

生長發(fā)育數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P≤0.05作為判斷存在差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

代謝組學(xué)數(shù)據(jù)使用Meta X 21.0軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法分析和判別(PLS-DA)，得出PCA圖和PLS-DA圖，并分析得出代謝物的變量投影重要度(VIP)值。利用SPSS 25.0軟件計(jì)算得出各個(gè)代謝物含量的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性P值和差異倍數(shù)(FC)值。一般情況下，差異代謝物篩選的默認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)為VIP>1，P<0.05且FC≥2或FC≤0.5?；鹕綀D和聚類熱圖分別用Ggplot 2.0和Pheatmap 1.0軟件進(jìn)行繪制后，篩選出差異代謝物。而對鑒定得到的小分子代謝物通過KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 補(bǔ)飼精料對早期斷奶牦牛犢牛胰腺發(fā)育的影響

由表2可知，試驗(yàn)組牦牛犢牛的體重、胰腺重量、胰腺指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)。

表2 哺乳期補(bǔ)飼精料對早期斷奶牦牛犢牛胰腺指數(shù)的影響

由表3可知，試驗(yàn)組牦牛犢牛的胰腺外分泌部面積總占比、胰腺內(nèi)分泌部面積總占比顯著高于對照組(P<0.05)，而試驗(yàn)組胰腺內(nèi)外分泌部面積比顯著低于對照組(P<0.05)。

表3 哺乳期補(bǔ)飼精料對早期斷奶牦牛犢牛胰腺內(nèi)外分泌部面積的影響

2.2 補(bǔ)飼精料對早期斷奶牦牛犢牛胰腺代謝組的影響

2.2.1 正離子模式下的胰腺代謝組學(xué)

由圖1可知，在正離子模式下的PCA圖中，從試驗(yàn)組與對照組之間的胰腺樣本散點(diǎn)圖可以看出，其PCA1、2、3分別為49.26%、11.68%、9.05%。

CP為對照組；EP為試驗(yàn)組。圖6同。

由圖2可知，在正離子模式下的PLS-DA圖中，R2Y=0.95，Q2Y=0.43，R2Y>Q2Y，Q2與Y軸截距小于0，說明樣本數(shù)據(jù)描述良好。

由圖3中可知，在正離子模式下的聚類熱圖中，2組胰腺樣品含有55種差異代謝物。

在正離子模式下，試驗(yàn)組與對照組相比較共鑒定出583個(gè)小分子代謝物，其中55個(gè)差異代謝物含量存在顯著變化。由圖4中可知，在正離子模式下的火山圖中，差異代謝物含量顯著上調(diào)的有47個(gè)，下調(diào)的有8個(gè)。

由圖5可知，在正離子模式下的KEGG氣泡圖中，對照組和試驗(yàn)組共篩選出20條代謝途徑。

由表4可知，在正離子模式下，與對照組相比，試驗(yàn)組在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成代謝途徑中，差異代謝物L(fēng)-苯丙氨酸的含量顯著上升(P<0.05)，苯丙酮酸的含量顯著下降(P<0.05)；在苯丙氨酸代謝途徑中，差異代謝物L(fēng)-苯丙氨酸、2-苯乙酰胺的含量顯著上升(P<0.05)，苯丙酮酸的含量顯著下降(P<0.05)。

2.2.2 負(fù)離子模式下的胰腺代謝組學(xué)

由圖6可知，在負(fù)離子模式下的PCA圖中，2組之間的散點(diǎn)圖可以清晰直觀地觀察出來，胰腺樣本PCA1、2、3分別為69.07%、8.46%、5.48%。

左圖中R2Y代表該模型解釋率；Q2Y代表該模型預(yù)測能力；右圖中R2、Q2代表運(yùn)用偏最小二乘回歸方法建立模型的評價(jià)參數(shù),Cor代表R2與Q2的相關(guān)性。圖7同。

由圖7可知，在負(fù)離子模式下的PLS-DA圖中，R2Y=0.96，Q2Y=0.24，R2Y>Q2Y，Q2與Y軸截距小于0，說明樣本數(shù)據(jù)描述良好。

由圖8中可知，在負(fù)離子模式下的聚類熱圖中，2組胰腺樣品含有20種差異代謝物。

在負(fù)離子模式下，試驗(yàn)組與對照組相比較共鑒定出402個(gè)小分子代謝物，其中20個(gè)差異代謝物含量存在顯著變化。由圖9中可以看出，在負(fù)離子模式下的火山圖中，差異代謝物含量顯著上調(diào)的有19個(gè)，下調(diào)的有1個(gè)。

由圖10可知，在負(fù)離子模式下的KEGG氣泡圖中，對照組和試驗(yàn)組共篩選出6條代謝途徑。

由表5可知，在負(fù)離子模式下，與對照組相比，試驗(yàn)組在不飽和脂肪酸生物合成的代謝途徑中，差異代謝物二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、腎上腺酸的含量顯著上升(P<0.05)；在鐵凋亡代謝途徑中，差異代謝物γ-谷氨酰半胱氨酸、腎上腺酸的含量顯著上升(P<0.05)。

3 討 論

3.1 補(bǔ)飼精料對早期斷奶牦牛犢牛胰腺發(fā)育的影響

通過結(jié)果可以看出，補(bǔ)飼精料可以提高哺乳期牦牛犢牛的體重、胰腺重量及胰腺指數(shù)。李平業(yè)[13]通過研究發(fā)現(xiàn)，牧民在青草期和枯草期補(bǔ)飼精料，可以有效增加牦牛犢牛的體重，有利于其早期的生長發(fā)育。Hirai等[14]研究發(fā)現(xiàn)，肉牛育肥期間補(bǔ)充玉米粉等精料后，可以顯著提高其平均日增重和屠宰重。這說明在哺乳期固體干物質(zhì)采食量相同的情況下，適當(dāng)補(bǔ)飼精料可以很好地促進(jìn)牦牛犢牛肌肉胴體的發(fā)育和生長，顯著影響并提高牦牛犢牛自身的生長和發(fā)育，從而得出補(bǔ)飼精料對犢牛牦牛的生長發(fā)育具有重要促進(jìn)作用。吐日根白乙拉等[15]研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)增加精料類飼料的同時(shí)，可以促進(jìn)畜體胰島分泌釋放胰島素，有利于胰腺腺體自身的生長與發(fā)育。哺乳期補(bǔ)飼精料也減少了閏管和導(dǎo)管等的分布程度，增加牦牛犢牛胰腺腺泡和胰島的分布密集程度，也增加了胰腺外分泌部面積總占比和胰腺內(nèi)分泌部面積總占比。Svensson等[16]將胰腺內(nèi)分泌和外分泌實(shí)質(zhì)中的毛細(xì)血管面積進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，胰島的毛細(xì)血管體積約為3.5%，而外分泌胰腺的毛細(xì)血管體積顯著降低為2%。這些參數(shù)之間存在差異的原因可能是缺乏淋巴毛細(xì)血管，胰島中的毛細(xì)血管腔相對較小。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺部分區(qū)域胰島細(xì)胞密度高于腺泡區(qū)域，尤其在富含胰高血糖素的胰島中細(xì)胞數(shù)量更多。劉梅英等[18]研究發(fā)現(xiàn)，給奶牛補(bǔ)飼精料后，其蛋白質(zhì)含量會影響胰腺外分泌功能。而內(nèi)外分泌部面積比則顯著降低，這是由于補(bǔ)飼精料大大增加了胰腺外分泌部的面積，從而使得內(nèi)分泌部在其中所占面積比例相對較低，也反映了補(bǔ)飼精料對胰腺外分泌部的影響效果最大。這說明補(bǔ)飼精料對哺乳期牦牛犢牛胰腺內(nèi)部的腺泡和胰島、內(nèi)分泌部和外分泌部有積極的作用效果，對牦牛犢牛胰腺的生長發(fā)育也有著積極的推動(dòng)作用。

圖中pos代表正離子模式 pos in the figure represents the positive ion mode；Hypoxanthine:次黃嘌呤；Uridine diphosphate：尿苷二磷酸；Prostaglandin A3：前列腺素A3；Creatinine：肌酐；Uracil 1-beta-D-arabinofuranoside：尿嘧啶1-β-D-阿拉伯呋喃糖苷；LSD-d3：麥角酸二乙酰胺-d3；Phosphatidylcholine (17∶2/18∶5)：磷脂酰膽堿(17∶2/18∶5)；Xanthine：黃嘌呤；Ribulose-5-phosphate：核糖-5-磷酸；Corey Lactone Diol：科立內(nèi)酯二醇；Nicotinamide：煙酰胺；ACar (7∶0)：丁酰肼(7∶0)；D-Serine：D-絲氨酸；Pipecolic acid：哌咯酸；23-nordeoxycholic acid：23-脫氧膽酸；Temazepam：替馬西泮；Thiazolidine-4-carboxylic acid：噻唑烷-4-羧酸；5-oxoproline：5-氧代脯氨酸；Trehalose：海藻糖；Adipamide：己二胺；Ellagic acid：鞣花酸；O-phosphocolamine：O-磷膽胺；Tetrahydrocorticosterone：四氫皮質(zhì)酮；ACar (22∶5)：丁酰肼(22∶5)；Acetylcysteine：乙酰半胱氨酸；ACar (18∶2)：丁酰肼(18∶2)；Gamma-glutamylcysteine：γ-谷氨酰半胱氨酸；D-(+)-proline：D-(+)-脯氨酸；N2-tetrahydrofuran-2-ylmethyl-4-(4-fluorophenyl)-1,3-thiazol-2-amine：N2-四氫呋喃-2-基甲基-4-(4-氟苯基)-1,3-噻唑-2-胺；Pyridoxamine：吡哆胺；MJN110；2-oxa-4-azatetracyclo[6.3.1.1～6,10～.0～1,5～]tridecan-3-one：2-氧雜-4-氮雜四環(huán)[6.3.1.1～6,10～.0～1,5～]十三烷-3-酮；5′-S-methyl-5′-thioadenosine：5-甲基-5-硫代腺苷；Gamma-glutamylleucine：γ-谷氨酰-亮氨酸；Asparagine：天冬酰胺；(+/-)5(6)-EET：5(6)-環(huán)氧乙烷；6-methylquinoline：6-甲基喹啉；DL-tryptophan：DL-色氨酸；Indole-3-acrylic acid：吲哚-3-丙烯酸；L-phenylalanine：L-苯丙氨酸；2-hydroxycinnamic acid：2-羥基肉桂酸；2-phenylacetamide：2-苯乙酰胺；Tropolone：托普隆；2-acetamido-3-(4-methoxyphenyl)propanoic acid：2-乙酰氨基-3-(4-甲氧基苯基)丙酸；O-acetyl-L-carnitine：O-乙?；?L-肉堿；Uric acid：尿酸；Thymine：胸腺嘧啶；Phosphatidylcholine (16∶0e/4∶0)：磷脂酰膽堿(16∶0e/4∶0)；Phosphatidylcholine (18∶4e/6∶0)：磷脂酰膽堿(18∶4e/6∶0)；Phosphatidylcholine (20∶5e/4∶0)：磷脂酰膽堿(20∶5e/4∶0)；Phosphatidylethanolamine (18∶1/20∶5)：磷脂酰乙醇胺(18∶1/20∶5)；Phosphatidylethanolamine (18∶5e/6∶0)：磷脂酰乙醇胺(18∶5e/6∶0)；Phosphatidylcholine (17∶0/17∶1)：磷脂酰膽堿 (17∶0/17∶1)；Dopaquinone：多巴醌；Phenylpyruvic acid：苯丙酮酸。

圖中l(wèi)og2(fold change)代表代謝物的差異倍數(shù)變化；-log10(P-value)代表差異顯著性水平；VIP代表變量投影重要度；UP代表上調(diào)；DW代表下調(diào)；NoDiff代表無顯著差異性。圖9同。

3.2 補(bǔ)飼精料對早期斷奶牦牛犢牛胰腺代謝組學(xué)的影響

早期補(bǔ)飼精料對牦牛犢牛的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成和苯丙氨酸代謝途徑有著明顯的作用機(jī)制。在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成中，牦牛犢牛補(bǔ)飼精料后L-苯丙氨酸含量顯著上升，苯丙酮酸含量顯著下降。Aubi等[19]發(fā)現(xiàn)L-苯丙氨酸是機(jī)體的必需氨基酸，在牦牛犢牛體內(nèi)經(jīng)過苯丙氨酸羥化酶氧化后形成酪氨酸，對機(jī)體的糖代謝和脂肪代謝有促進(jìn)和推動(dòng)作用。L-苯丙氨酸也是一種營養(yǎng)增補(bǔ)劑，可以提高飼糧的適口性和營養(yǎng)水平。Zhu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加適量的L-苯丙氨酸，可以提高斷奶仔豬采食適口性，進(jìn)而也提高了飼料利用率。王志鵬等[21]發(fā)現(xiàn)，苯丙酮酸可以降低苯丙氨酸代謝催化酶的活性，導(dǎo)致苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)化形成酪氨酸，從而使得苯丙氨酸及其酮酸大量堆積在體內(nèi)，造成牦牛犢牛早期營養(yǎng)不良并對其生長發(fā)育、行為運(yùn)動(dòng)都有破壞作用。

pos：正離子模式 positive ion mode；Metabolic pathways：代謝途徑；Purine metabolism：嘌呤代謝；Phenylalanine metabolism：苯丙氨酸代謝；Pyrimidine metabolism：嘧啶代謝；Phenylalanine：苯丙氨酸；Tyrosine and tryptophan biosynthesis：酪氨酸和色氨酸的生物合成；Biosynthesis of amino acids：氨基酸生物合成；ABC transporters：ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；2-oxocarboxylic acid metabolism ：2-氧代羧酸代謝；Vitamin B6 metabolism：維生素B6代謝；Tyrosine metabolism：酪氨酸代謝；Starch and sucrose metabolism：淀粉和蔗糖代謝；Protein digestion and absorption：蛋白質(zhì)消化吸收；Nicotinate and nicotinamide metabolism：煙酸鹽和煙酰胺代謝；Mineral absorption：礦物質(zhì)吸收；Lysine degradation：賴氨酸降解；Longevity regulating pathway-worm：長壽調(diào)控途徑-蠕蟲；Insulin resistance：胰島素抵抗；Glycine：甘氨酸；Serine and threonine metabolism：絲氨酸和蘇氨酸代謝；Caffeine metabolism；咖啡因代謝；Aminoacyl-tRNA biosynthesis：氨基?；?tRNA生物合成。

表4 正離子模式下的代謝通路以及相關(guān)差異代謝物

圖6 負(fù)離子模式下的PCA得分散點(diǎn)圖

而Lopez等[22]提到過苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成不能在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行，必須通過采食植物飼料才能夠完成。這說明了早期補(bǔ)飼精料，可以提高牦牛犢牛的營養(yǎng)水平和生長發(fā)育，也降低了阻礙和限制其良好生長的風(fēng)險(xiǎn)。同樣的，在苯丙氨酸代謝途徑中，補(bǔ)飼精料后L-苯丙氨酸和2-苯乙酰胺含量顯著上升，苯丙酮酸含量顯著下降。Su等[23]研究發(fā)現(xiàn)，2-苯乙酰胺是苯丙氨酸代謝的一個(gè)中間物。而2-苯乙酰胺可以通過基團(tuán)取代的方式形成其他衍生物，可以刺激機(jī)體中樞神經(jīng)興奮和推動(dòng)調(diào)節(jié)行為活動(dòng)。苯丙氨酸代謝通過L-苯丙氨酸、2-苯乙酰胺、苯丙酮酸促進(jìn)機(jī)體的營養(yǎng)水平和行為運(yùn)動(dòng)?？梢钥闯觯缙谘a(bǔ)飼精料可以提高牦牛犢牛的營養(yǎng)水平及其生長質(zhì)量，對牦牛犢牛后期的生長發(fā)育有重要的意義。

圖7 負(fù)離子模式下的PLS-DA得分圖及模型排列驗(yàn)證圖

圖中neg代表負(fù)離子模式 neg in the figure represents the negative ion mode；3-(methylsulfanyl)-5H-[1,2,4]triazino[5,6-b]indole：3-(甲硫基)-5H-[1,2,4]三嗪[5,6-b]吲哚；FAHFA (18∶1/20∶3)：羥基脂肪酸(18∶1/20∶3)；FAHFA (18∶2/20∶4)：羥基脂肪酸(18∶2/20∶4)；Cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid：順式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸；Lyso-phosphatidylserine (22∶4)：溶血磷脂酰絲氨酸(22∶4)；Docosapentaenoic acid：二十二碳五烯酸；Docosahexaenoic acid：二十二碳六烯酸；Phosphatidylcholine(16∶1e/18∶2)：磷脂酰膽堿(16∶1e/18∶2)；Lyso-phosphatidylglycerol(22∶4)：溶血磷脂酰甘油(22∶4)；Phosphatidylcholine (14∶0/18∶2)：磷脂酰膽堿(14∶0/18∶2)；Phosphatidylethanolamine (18∶3e/18∶2)：磷脂酰乙醇胺(18∶3e/18∶2)；Phosphatidylethanolamine (18∶2/18∶3)：磷脂酰乙醇胺(18∶2/18∶3)；Adrenic acid：腎上腺酸；Lyso-phosphatidylglycerol (22∶5)：溶血磷脂酰甘油(22∶5)；D-proline：D-脯氨酸；Xanthosine：黃嘌呤核苷；Lyso-phosphatidylethanolamine (20∶5)：溶血磷脂酰乙醇胺(20∶5)；Octanedioic acid：辛二酸；Gamma-glutamylcysteine：γ-谷氨酰半胱氨酸；Oxycodone phosphatidylcholine (18∶1-18∶2+2O)：氧雜磷脂酰膽堿 (18∶1-18∶2+2O)。

早期補(bǔ)飼精料對牦牛犢牛的不飽和脂肪酸生物合成和鐵凋亡代謝途徑有著積極的推動(dòng)作用。在不飽和脂肪酸生物合成代謝途徑中，牦牛犢牛補(bǔ)飼精料后二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、腎上腺酸含量顯著上升。其中二十二碳五烯酸可以提高牦牛犢牛機(jī)體免疫力，對牦牛犢牛早期疾病有預(yù)防和治療作用。Hafez等[24]研究發(fā)現(xiàn)，二十二碳六烯酸也提高了畜禽的生長性能和免疫力，在保證機(jī)體健康的同時(shí)也降低了患病死亡的風(fēng)險(xiǎn)。Isolation[25]研究發(fā)現(xiàn)，二十二碳六烯酸可以提高牦牛犢牛哺乳期神經(jīng)發(fā)育及其功能的發(fā)揮，對其腦力開發(fā)有著積極的促進(jìn)作用。Bruce等[26]研究發(fā)現(xiàn)，腎上腺酸對機(jī)體炎癥和脂肪酸代謝具有重要的調(diào)控作用，改善了胰島素抵抗和脂質(zhì)代謝，降低了炎癥水平。二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、腎上腺酸共同合成了對牦牛犢牛機(jī)體非常重要的不飽和脂肪酸，可以看出，補(bǔ)飼精料對哺乳期牦牛犢牛的營養(yǎng)水平、生長發(fā)育和體質(zhì)健康有極大的推動(dòng)作用。在鐵凋亡代謝途徑中，補(bǔ)飼精料后γ-谷氨酰半胱氨酸、腎上腺酸含量顯著上升。γ-谷氨酰半胱氨酸可以幫助機(jī)體維持正常的免疫功能，還具有抗氧化、加強(qiáng)機(jī)體健康的作用。γ-谷氨酰半胱氨酸和腎上腺酸形成的脂肪酸代謝，為鐵凋亡提供所需的特定脂質(zhì)前體。而Xie等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在癌癥等疾病中基于鐵凋亡的干預(yù)治療非常重要，鐵凋亡在無菌炎癥性疾病中起重要作用。Marie等[28]通過鐵在糖尿病中胰島β細(xì)胞功能障礙作用，減少鐵含量，從而改善胰島素抵抗。這說明了早期補(bǔ)飼精料，可以提高牦牛犢牛機(jī)體的免疫能力，在相關(guān)疾病預(yù)防中發(fā)揮重要作用，也為診斷和治療干預(yù)創(chuàng)造良好的機(jī)會和條件。

圖9 負(fù)離子模式下的火山圖

4 結(jié) 論

綜上所述，補(bǔ)飼精料提高了早期斷奶牦牛犢牛的胰腺發(fā)育水平，對其胰腺的各項(xiàng)代謝機(jī)能有著積極的調(diào)控作用，有利于改善早期斷奶牦牛犢牛的生長發(fā)育，為牦牛幼畜早期健康培育的營養(yǎng)調(diào)控提供了重要理論依據(jù)。

neg：負(fù)離子模式 negative ion mode；Biosynthesis of unsaturated fatty acids：不飽和脂肪酸生物合；Ferroptosis：鐵凋亡；Purine metabolism：嘌呤代謝；Glutathione metabolism：谷胱甘肽代謝；Caffeine metabolism：咖啡因代謝；Arginine and proline metabolism精氨酸和脯氨酸代謝。

表5 負(fù)離子模式下的代謝通路以及相關(guān)差異代謝物