陳碧蘭 黎 夢(mèng) 張永亮 陳 婷*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，國家生豬種業(yè)工程技術(shù)中心，廣東省動(dòng)物營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510642；2.嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，嘉興314001)

外泌體(exosomes，EVs)是釋放到細(xì)胞外環(huán)境的納米級(jí)磷脂雙層囊泡，直徑在30～150 nm，可由各種組織或細(xì)胞產(chǎn)生。外泌體由多泡核內(nèi)體與質(zhì)膜融合并通過胞吐釋放到腔內(nèi)[1-2]，多種類型的細(xì)胞、組織和生物液體可釋放外泌體，包括血液、乳汁、尿液、唾液、眼淚和腦脊液等[3]。

母乳富含嬰兒時(shí)期生長發(fā)育所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，包括脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物、礦物質(zhì)和維生素；還富含乳鐵蛋白、免疫球蛋白、生長因子、寡糖、多不飽和脂肪酸等生物活性成分[4]。2007年，Admyre等[5]首次報(bào)道了人類母乳中還富含外泌體，但這些外泌體的來源仍不確定，自此，乳外泌體(milk-derived exosomes，MEVs)的研究成為學(xué)術(shù)上的一大研究熱點(diǎn)。此外，乳外泌體可以作為細(xì)胞之間的信使，人們對(duì)乳外泌體的研究興趣日益濃厚[6]。大量研究表明，乳外泌體可發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體代謝[7]、生長發(fā)育[6,8]、傳遞藥物[9-11]以及免疫[8,12-13]等功能。本文綜述了乳外泌體生物學(xué)特性及分離方法，并探討了乳外泌體在免疫調(diào)節(jié)中的作用與機(jī)制，為豐富乳外泌體生物學(xué)功能提供了參考依據(jù)。

1 乳外泌體的生物學(xué)特性及分離

乳外泌體主要由乳腺上皮細(xì)胞釋放的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸(包括mRNA、miRNAs、lncRNA和DNA)組成[14]。乳外泌體具有生物活性，并能攜帶特定的生物信息分子[15-16]，其生物活性主要由其攜帶的生物活性分子來體現(xiàn)[17-19]；如各種乳外泌體脂質(zhì)(主要是乳脂球膜)[18]、核酸[20-21]和蛋白質(zhì)[22-23]等是乳外泌體傳遞的關(guān)鍵信號(hào)成分，能夠進(jìn)入體內(nèi)并發(fā)揮特定的功能。此外，乳外泌體中的miRNAs具有高度的序列同源性[24-25]，特別是miRNA-let-7家族成員(let-7a、let-7b和let-7f)以及miR-148a等，這些miRNAs在所有物種中的保守性都非常高[25]。除了序列同源性，乳外泌體還表現(xiàn)出跨物種的耐受性，如牛乳外泌體可以被人腸道吸收并表現(xiàn)生物活性，且不會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)[26]。將人乳外泌體中高表達(dá)的let-7家族和miR-148a轉(zhuǎn)移到新生兒體內(nèi)，可以參與靶mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控實(shí)現(xiàn)跨物種交流[25,27]。

1.1 乳外泌體穩(wěn)定性的影響因素

乳外泌體除了具有生物活性、miRNAs序列同源性和耐受性還表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性，這些特征均為乳外泌體在跨物種的調(diào)控作用提供了前提條件。其中，乳外泌體的穩(wěn)定性是研究各類乳外泌體及其成分功能的基礎(chǔ)，但其穩(wěn)定性可受以下因素影響。

1)酸性：乳外泌體的雙層膜結(jié)構(gòu)可以保護(hù)其在胃、胰液中不被消化，使其內(nèi)容物不被核糖核苷酸酶和消化酶降解，從而進(jìn)一步被腸道細(xì)胞吸收并發(fā)揮生物活性[28-29]。在體外消化模型中，乳外泌體中的miRNA可以抵抗酸性環(huán)境(pH=2和pH=4)及消化道酶的水解作用，而且可以被嬰兒腸道細(xì)胞吸收并發(fā)揮生理功能；除此以外，乳外泌體對(duì)蛋白酶的水解作用具有高度抵抗性[17]。值得一提的是，腸道的酸性環(huán)境和高滲條件還可以進(jìn)一步促進(jìn)乳外泌體的穩(wěn)定性和吸收[17]。

2)溫度：溫度可以影響乳外泌體的結(jié)構(gòu)和miRNAs的表達(dá)量，是影響乳外泌體生物活性的重要環(huán)境因素。在冷藏或冷凍環(huán)境下，會(huì)導(dǎo)致母乳中的細(xì)胞大量迅速死亡[30]。將母乳放置在4 ℃環(huán)境中儲(chǔ)存4周時(shí)，乳外泌體會(huì)減少到新鮮母乳的(49±13)%[30]，但將乳外泌體保存在-80 ℃數(shù)月后仍具有生物活性[9]。這表明乳外泌體在超低溫環(huán)境下可以長期保存且不引起其物理和生物學(xué)特性的顯著變化。此外，天然的乳外泌體miRNAs更能抵抗嚴(yán)酷的條件，包括反復(fù)凍融和高溫。與外源合成的miRNAs相比，乳外泌體中的miRNAs可耐受更長時(shí)間的冷儲(chǔ)存，miRNAs在4 ℃下儲(chǔ)存15 d或者微波爐加熱后仍具有生物活性，但會(huì)損失乳外泌體miRNAs的含量[31-32]。但值得注意的是，與巴氏殺菌(78 ℃)相比，牛奶的煮沸(100 ℃)和超熱處理(130 ℃)可降低牛奶miRNAs水平[24,33-34]，這表明超高溫可能會(huì)破壞乳外泌體的雙層脂膜結(jié)構(gòu)，引起其內(nèi)部miRNAs的釋放，進(jìn)而降低乳外泌體中miRNAs的表達(dá)量。

3)發(fā)酵：牛奶發(fā)酵生產(chǎn)變成酸奶時(shí)，會(huì)在體外破壞乳源外泌體的完整性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量和miRNAs濃度降低[31]。因?yàn)榘l(fā)酵過程中可能使乳外泌體的膜結(jié)構(gòu)裂解，而且微生物產(chǎn)生的大量核糖核酸酶(RNases)也會(huì)導(dǎo)致核酸降解[32]。

4)巴氏殺菌、均質(zhì)化和其他乳產(chǎn)品加工方式：巴氏殺菌、均質(zhì)化(miRNAs濃度平均降低50%)和乳產(chǎn)品加工均會(huì)導(dǎo)致乳外泌體及其內(nèi)容物不同程度的損失，主要是通過破壞乳外泌體膜的完整性造成的[32-33]。其中，乳外泌體膜在均質(zhì)化過程中會(huì)受到剪切力的作用，導(dǎo)致乳外泌體膜破壞和miRNAs降解[32]。

5)其他：母乳樣本來源的樹突狀細(xì)胞死亡后會(huì)產(chǎn)生凋亡小體和細(xì)胞碎片，加速乳外泌體的污染[30]。

1.2 乳外泌體的分離方法

研究顯示，在試驗(yàn)中很難根據(jù)蛋白質(zhì)譜區(qū)分乳外泌體與凋亡小體和細(xì)胞碎片，這增加了乳外泌體分離和純化的難度[30]。目前，用于乳外泌體分離的方法有超速離心法、密度分離法、沉淀法、超濾法和免疫親和法等[35]，但不同的方法在純度、得率和成本等方面差異較大[36-37]。研究表明，用沉淀法獲得乳外泌體非常直接快速，但獲得的乳外泌體中可能殘留其他細(xì)胞碎片，缺乏對(duì)乳外泌體的特異性識(shí)別[35,38]；超速離心法操作簡單，提取的乳外泌體數(shù)量較多，但存在耗時(shí)較長、單次處理數(shù)量有限以及回收率不穩(wěn)定等特點(diǎn)，不適合大規(guī)模提取[39-40]；超濾法提取乳外泌體操作簡單，但由于濾膜的黏附，可能會(huì)損失乳外泌體，并且由于過濾時(shí)的壓力和剪切力，可能會(huì)使乳外泌體變形[41-42]。

上述研究表明，乳外泌體對(duì)各類環(huán)境條件的耐受能力較強(qiáng)，這為乳外泌體分離方法及其功能的研究和提供了重要依據(jù)。同時(shí)，現(xiàn)有乳外泌體的分離方法顯示出的利弊，也為獲得高純度、高得率的乳外泌體提出了巨大挑戰(zhàn)。但乳外泌體可以抵抗胃腸道的消化進(jìn)而被動(dòng)物體進(jìn)一步吸收利用，為乳外泌體進(jìn)入生物機(jī)體并發(fā)揮功能提供了重要保障。

2 乳外泌體作用方式

乳外泌體能參與免疫反應(yīng)、細(xì)胞黏附、廢物處理、應(yīng)激保護(hù)和炎癥等生物學(xué)過程，其主要通過傳遞各種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間通訊[1,7]。據(jù)報(bào)道，目前乳外泌體與其他細(xì)胞或組織間的信號(hào)傳遞主要通過以下幾種方式。

1)胞吞作用：許多體外研究表明，乳外泌體可以通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后通過基底外側(cè)膜釋放其miRNAs載體[43-45]。

2)配體-受體方式作用：乳外泌體還可以通過配體-受體方式進(jìn)入機(jī)體，捕獲配體從而發(fā)揮作用。研究顯示，牛乳鐵蛋白與聚L-賴氨酸的分子偶聯(lián)物靜電后能與帶負(fù)電荷的siRNA相互作用，其中乳鐵蛋白作為配體被存在于外泌體中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)捕獲，有研究將siRNA裝載到乳外泌體中，發(fā)現(xiàn)裝載siRNA的載體蛋白乳外泌體不僅能安全運(yùn)輸治療性siRNA，還能提高靶細(xì)胞內(nèi)具有多種保護(hù)作用的乳鐵蛋白的生物利用度[46]。

3)內(nèi)吞作用：有研究表明，腸上皮細(xì)胞可以直接吞噬牛奶外泌體[17]。Wolf等[26]研究表明，牛乳外泌體在腸道的運(yùn)輸可以通過人血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)吞作用來完成，是一種成本低、效益高的藥物遞送替代物。在生物制藥行業(yè)中，乳外泌體被證明是有效的藥物和小分子的運(yùn)載體。牛乳外泌體作為藥物傳遞載體的靶向機(jī)制可能是通過其表面糖蛋白和靶細(xì)胞的特異性識(shí)別[26]，涉及頂級(jí)網(wǎng)絡(luò)通路與代謝、內(nèi)吞作用、緊密連接和Ras信號(hào)通路等，且蛋白質(zhì)的糖基化特性極大地影響乳外泌體與受體細(xì)胞的相互作用[14，47]。

3 乳外泌體的免疫增強(qiáng)作用

乳外泌體作為天然穩(wěn)定的生物活性物質(zhì)，其作用方式在動(dòng)物攝取乳外泌體并發(fā)揮其特定生物學(xué)功能方面具有重要地位。據(jù)報(bào)道，乳外泌體在許多方面都發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，如參與調(diào)節(jié)機(jī)體代謝[7]、維持骨骼健康[48]、調(diào)節(jié)腸道健康[49-51]以及免疫功能等。其中，Badawy等[52]首次證明駱駝乳外泌體可通過誘導(dǎo)凋亡、抑制炎癥、抑制氧化應(yīng)激、抑制血管生成來誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞死亡，從而抑制乳腺腫瘤的生長；Gao等[49]發(fā)現(xiàn)乳外泌體能有效緩解缺氧造成的腸道損傷；牛乳外泌體和不同時(shí)期來源的人乳外泌體均可治療由脂多糖誘導(dǎo)的壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)[53-54]；人類和牛的乳外泌體可以減少葡聚糖硫酸酯鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸縮短，促進(jìn)腸細(xì)胞增殖緩解結(jié)腸炎[19]。

值得注意的是，還有大量研究表明，乳外泌體在細(xì)胞炎癥、癌癥和細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程中能通過直接或間接方式發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用[6,8,12-13]。

3.1 乳外泌體與炎癥

炎癥反應(yīng)是自身免疫反應(yīng)的一種表現(xiàn)，是機(jī)體為去除有害刺激以及修復(fù)受損組織愈合的一種保護(hù)性反應(yīng)，涉及多種類型的免疫細(xì)胞的參與[55-56]。其中，先天免疫細(xì)胞可以通過感知和定位損傷以及感染相關(guān)的危險(xiǎn)信號(hào)后，激活先天免疫細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，進(jìn)一步增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，同時(shí)發(fā)揮阻斷病原體傳播的作用[57]。乳外泌體作為信息傳遞分子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，緩解炎癥損傷，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，保護(hù)動(dòng)物健康。最新研究發(fā)現(xiàn)，在白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)誘導(dǎo)的體外軟骨外植體關(guān)節(jié)炎模型中，牛乳外泌體可以減少軟骨外植體釋放硫酸鹽黏多糖，抑制軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和分解代謝過程[58]。在潰瘍性結(jié)腸炎的遺傳小鼠模型中，牛乳外泌體可降低宏觀結(jié)腸炎評(píng)分，阻止?jié)儽硇偷某霈F(xiàn)，具有抗炎作用，但其背后的免疫機(jī)制還需進(jìn)一步研究[51]。Good等[59]研究發(fā)現(xiàn)，人乳外泌體能夠通過表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號(hào)通路抑制Toll樣受體4(TLR4)，從而防止脂多糖誘導(dǎo)的NEC。在小鼠腸道類器官模型證明，人乳外泌體可以抑制炎癥標(biāo)志物腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和TLR4的表達(dá)，減少小鼠腸道類器官的大小，抑制由脂多糖誘導(dǎo)引起的促炎反應(yīng)[49,60]，這也符合之前的報(bào)道。

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種慢性復(fù)發(fā)的胃腸道炎癥性疾病，其中壞死性結(jié)腸炎是動(dòng)物中最常見的胃腸道疾病，死亡率較高，迄今為止還沒有找到治愈該病的方法[61]。目前，新興治療IBD的方法主要集中在免疫調(diào)節(jié)[19]。在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中，乳外泌體可以降低白細(xì)胞介素-6(IL-6)和TNF-α的mRNA表達(dá)量，緩解DSS引起的結(jié)腸炎，其作用機(jī)制可能涉及多種互補(bǔ)途徑[19]。另有研究發(fā)現(xiàn)，駱駝乳外泌體同樣可以通過T細(xì)胞介導(dǎo)下調(diào)大鼠乳腺腫瘤組織中炎癥相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)抗炎作用[52]。

以上結(jié)果表明，乳外泌體可以調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)抵抗炎癥的能力，從而達(dá)到緩解動(dòng)物炎癥的目的，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫的作用。推測(cè)利用乳外泌體給藥可能是未來有希望預(yù)防動(dòng)物機(jī)體炎癥、提高機(jī)體免疫力的有效方法之一。

3.2 乳外泌體與癌癥

慢性炎癥是癌變的刺激因素[62]。研究證明，乳外泌體不僅可以調(diào)控細(xì)胞炎癥因子達(dá)到緩解炎癥的作用，還能夠?qū)拱┌Y，其發(fā)揮的免疫增強(qiáng)作用可用于臨床輔助治療癌癥的手段[57]。乳外泌體可以通過控制癌細(xì)胞的表達(dá)和轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到抗癌的效果。研究證明，駱駝乳外泌體通過抑制腫瘤組織中血管生成相關(guān)基因血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤組織營養(yǎng)和氧氣供給減少來削弱腫瘤細(xì)胞的生存和轉(zhuǎn)移能力，從而控制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，在抗癌方面發(fā)揮明顯作用[52]。同樣的，Reif等[63]報(bào)道，牛乳外泌體miR-148a可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。隨后研究發(fā)現(xiàn)，乳外泌體miR-155和miR-148可以調(diào)節(jié)腸道細(xì)胞因子和T細(xì)胞免疫反應(yīng)，預(yù)防結(jié)直腸癌癌變[57,64-65]。在免疫學(xué)上，檢查點(diǎn)抑制劑是癌癥免疫療法中常用的制劑，其原理是阻斷抑制信號(hào)，通過消除腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞的抑制作用，進(jìn)而激活T細(xì)胞攻擊腫瘤發(fā)揮作用[57]。目前，免疫療法被視為癌癥治療的第四大支柱，它通過重新激活抗癌免疫反應(yīng)，從而顯著提高許多類型癌癥的存活率[57]。因此，乳外泌體可作為檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)用于癌癥治療中。

乳外泌體在抗癌方面除了通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的表達(dá)和轉(zhuǎn)移，在實(shí)際應(yīng)用中，更多的是作為載體運(yùn)輸藥物，起到輔助免疫治療的作用。由于乳外泌體的脂質(zhì)膜和水核結(jié)構(gòu)，天然和工程的乳外泌體已經(jīng)證明可以作為小分子和大分子物質(zhì)的運(yùn)送載體運(yùn)用于癌癥治療過程[35，66-67]。研究顯示，乳外泌體可以有效地裝載小分子藥物，并可長期保存而不失去藥物效力，將化療藥物裝載到乳外泌體中，按照蛋白質(zhì)濃度<6 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)存于-80 ℃，6個(gè)月后依然保持良好的藥性[9]。在體外細(xì)胞試驗(yàn)和含腫瘤小鼠試驗(yàn)中，載藥乳外泌體抑制腫瘤的效率明顯高于游離藥物，其原因可能是乳外泌體中的藥物負(fù)載增加了穩(wěn)定性、細(xì)胞攝取率和藥物的緩釋作用[9-10]。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)載siKRAS的牛乳外泌體可以抑制肺腫瘤異種移植物的腫瘤活性，并且能提高siRNA的負(fù)載能力及其穩(wěn)定性[66]。乳外泌體作為藥物運(yùn)送載體重要的依據(jù)是其具有生物相容性，可以實(shí)現(xiàn)跨生物交流，并表現(xiàn)出一定的生物活性[25,27]。這為乳外泌體作為藥物運(yùn)送載體而不引起不良免疫反應(yīng)提供了支持。同時(shí)，乳外泌體還可以與腫瘤配體靶向結(jié)合，進(jìn)一步提高特異性并消除藥物在健康細(xì)胞中的脫靶副作用[9]。

3.3 乳外泌體與上皮屏障

乳外泌體中的生物活性成分被吸收進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，可以通過修復(fù)細(xì)胞屏障功能，達(dá)到調(diào)節(jié)免疫的作用。皮膚和黏膜屏障是先天免疫的組成部分，其上皮細(xì)胞的緊密連接是機(jī)體抵御病原體的第1道屏障，當(dāng)其被感染或損傷破壞時(shí)，先天免疫機(jī)制幾乎立即開始激活[57]。研究表明，屏障功能的改變可能會(huì)導(dǎo)致或增加疾病的發(fā)生，而靶向恢復(fù)屏障功能的治療是一種替代或補(bǔ)充免疫治療的方式[12]。

許多研究表明，乳外泌體具有促進(jìn)細(xì)胞增殖，達(dá)到恢復(fù)屏障功能的作用，其免疫作用的發(fā)揮主要通過運(yùn)輸生物活性物質(zhì)，如miRNA、mRNA、DNA和蛋白質(zhì)，在細(xì)胞-細(xì)胞通信中實(shí)現(xiàn)的[1,14]。乳外泌體中的蛋白質(zhì)可以形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)相互作用，通過蛋白質(zhì)運(yùn)載物在蛋白質(zhì)水平上調(diào)節(jié)細(xì)胞過程，如Zonneveld等[38]首次證明，乳外泌體中的蛋白質(zhì)可以作用于p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)或絲裂原細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(mitogen extracellular signal-regulated kinase，MEK)-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信號(hào)通路中的相關(guān)蛋白，通過增加上皮細(xì)胞的再上皮化率，來共同維持完整的口腔上皮屏障。除口腔上皮外，腸道是乳外泌體吸收和作用的重要場(chǎng)所。腸上皮細(xì)胞分泌的抗菌肽、黏蛋白和溶菌酶等先天免疫分子，是腸道先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分[68]。腸上皮細(xì)胞的固有層中存在多種免疫細(xì)胞，這些細(xì)胞群為機(jī)體提供免疫保護(hù)、監(jiān)測(cè)及殺死病原的作用[69]。因此，維持腸道屏障的完整性是增強(qiáng)機(jī)體免疫的重要內(nèi)容。Reif等[19]在小鼠結(jié)腸炎模型中發(fā)現(xiàn)，乳外泌體可以有效降低DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸縮短，促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖，維持腸道屏障健康，從而緩解小鼠結(jié)腸炎的癥狀。Li等[54]發(fā)現(xiàn)，用嚙齒動(dòng)物的乳外泌體處理可以增加杯狀細(xì)胞的數(shù)量和相關(guān)基因表達(dá)，如幫助葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(glucose regulatory protein 94，GRP94)、黏蛋白2(mucin 2，MUC2)蛋白質(zhì)合成，通過促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞增殖，維持腸道屏障健康。另有研究表明，乳外泌體能激活腸道增殖相關(guān)通路，促進(jìn)腸道增殖和發(fā)育，維持腸道健康[6,70-71]，但對(duì)乳外泌體中促進(jìn)細(xì)胞增殖具體的功能分子仍需進(jìn)一步研究。Gao等[53]發(fā)現(xiàn)牦牛乳外泌體能有效地激活缺氧誘導(dǎo)因子信號(hào)通路，通過顯著促進(jìn)腸上皮細(xì)胞中氧敏感脯氨酸羥化酶-1(prolylhydroxylase-1，PHD-1)的表達(dá)，降低低氧誘導(dǎo)因子-α(hypoxia-inducible factors-α，HIFs-α)及其下游靶基因VEGF的表達(dá)，以及誘導(dǎo)p53表達(dá)降低，促進(jìn)腸道再生。其中，p53蛋白被稱為抑癌基因，是細(xì)胞周期的主要負(fù)調(diào)控因子。p53水平的快速上升會(huì)抑制細(xì)胞的生長，可以阻滯細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)程，對(duì)細(xì)胞的正常生長和發(fā)育至關(guān)重要[72-73]。

關(guān)于乳外泌體增強(qiáng)屏障完整性的機(jī)制研究，報(bào)道顯示miRNAs在細(xì)胞增殖和分化、組織發(fā)育以及免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用[74]，如在牛乳和人乳外泌體中已證明有部分miRNAs(如let-7家族成員包括let-7a、let-7b、let-7f以及miR-148a等)可參與調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長或維持細(xì)胞活力等相關(guān)的靶基因[25]。同時(shí)，口服從牛乳和人乳中分離的乳外泌體可上調(diào)miRNA的表達(dá)量，如miRNA-320、miRNA-148、miRNA-375和let-7a，下調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(recombinant DNA methyltransferase，DNMT)中DNMT1和DNMT3的表達(dá)，誘導(dǎo)結(jié)腸細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和細(xì)胞增殖，增加免疫相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)[25,63]。上述研究提示，乳外泌體可通過miRNAs發(fā)揮調(diào)控作用，如miR-200b通過轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖[72]。在小鼠結(jié)腸炎模型中，miR-146b可通過核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)途徑，減輕腸道炎癥并改善腸道上皮屏障，在預(yù)防結(jié)腸炎方面發(fā)揮有益作用[43]。之后的研究發(fā)現(xiàn)，乳外泌體miRNAs(如miR-30c、miR-181a、miR-365-5p)能靶向抑制p53信號(hào)通路中靶向基因的表達(dá)，最終通過促進(jìn)豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)增殖和緊密連接以及抑制細(xì)胞凋亡，緩解由脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)引起的腸道屏障損傷[35,75]。

乳外泌體具有促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖和生長的作用，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫，且乳外泌體發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖作用的功能物質(zhì)可能與其所含的miRNA密切相關(guān)[76]。但關(guān)于乳外泌體中的其他活性成分(如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、lncRNA和DNA等)在這方面的功能報(bào)道相對(duì)較少。

4 小結(jié)與展望

近年來，乳外泌體作為天然的生物活性物質(zhì)，由于其生物相容性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、安全性高等特點(diǎn)成為學(xué)術(shù)研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。此外，乳外泌體可以被機(jī)體吸收保持生物活性，并進(jìn)一步向靶細(xì)胞傳遞生物信息，在炎癥、癌癥及細(xì)胞增殖方面發(fā)揮直接或間接的免疫調(diào)節(jié)作用。但當(dāng)前對(duì)乳外泌體的研究也面臨著一些問題：1)乳外泌體的分離和純化在純度、得率和成本等方面差異較大。對(duì)如何高純度及高效地分離提純?nèi)橥饷隗w的方法需要進(jìn)一步完善，這直接限制了對(duì)乳外泌體研究的嚴(yán)謹(jǐn)性和準(zhǔn)確性，故尋找新的分離提純方法仍是現(xiàn)階段研究的一大重點(diǎn)。2)對(duì)乳外泌體在免疫調(diào)節(jié)作用的研究中，主要針對(duì)的是乳外泌體群體，對(duì)其所含特異功能組分的研究相對(duì)較少，且主要集中在miRNAs。可能由于miRNAs較其他物質(zhì)(如lncRNA、circRNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等)具有更高的序列同源性，因此，對(duì)乳外泌體中其他功能成分的研究可能會(huì)成為乳外泌體研究的一大突破點(diǎn)。3)乳外泌體已被作為藥物和小分子的運(yùn)送載體應(yīng)用于靶向治療癌癥中，獲得了較高的效益，但需要注意的是乳外泌體作為大分子藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體不僅能轉(zhuǎn)移新的化合物，而且也轉(zhuǎn)移內(nèi)在的乳外泌體內(nèi)容物，重要的是可能轉(zhuǎn)移病毒RNA或DNA[4]。因此，乳外泌體作為輔助免疫調(diào)節(jié)治療手段的同時(shí)，需要注意其潛在風(fēng)險(xiǎn)。