程 鵬 張靜博 趙龍妹 丁 軻 曹平華 馬彥博 李 旺

(河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，洛陽471023)

益生菌作為綠色飼料添加劑在家禽生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)作為益生菌主要菌種，是動物腸道的常駐菌，與其他細(xì)菌相比具有獨特的生理特性及益生功能[1]，產(chǎn)生的酶能將飼糧中的粗蛋白質(zhì)降解為小肽、游離氨基酸等小分子物質(zhì)，增強(qiáng)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高生長性能，促進(jìn)免疫器官和免疫系統(tǒng)發(fā)育，提高抗病力[2-3]。乳酸菌可產(chǎn)生細(xì)菌素、乳酸、抑制蛋白等，抑制有害菌的生長[4]；維持消化道微生態(tài)平衡，保持畜禽腸道健康，提高養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益[5-6]。飼糧中添加乳酸菌可促進(jìn)雛雞腸絨毛發(fā)育，改變腸黏膜結(jié)構(gòu)，提高營養(yǎng)物質(zhì)吸收和利用[7]；促進(jìn)短鏈脂肪酸的形成，降低動物腸道pH，從而提高蛋白質(zhì)溶解度，促進(jìn)蛋白酶對蛋白質(zhì)分解[8]。鄧慶慶等[9]研究還發(fā)現(xiàn)，肉雞飼喂乳酸菌制劑可以改善由黃曲霉毒素導(dǎo)致的生長性能下降，提高肉雞營養(yǎng)物質(zhì)表觀代謝率，從而提高肉雞生長性能。

乳酸菌菌種不耐高溫，其固態(tài)制劑的干燥工藝多為真空冷凍干燥，成本過高，限制了其在動物養(yǎng)殖上使用。將乳酸菌菌液直接飼喂動物，則避免了干燥的環(huán)節(jié)，降低了使用成本。目前，乳酸菌菌液飼喂動物有多種方式，不同飼喂方式的效果缺乏比較?；诖耍驹囼炌ㄟ^飲水、灌服和拌料3種飼喂方式飼喂肉雞乳酸菌菌液，研究其對肉雞生長性能、粗蛋白質(zhì)表觀代謝率及腸道健康的影響，以期為乳酸菌菌液在肉雞生產(chǎn)中科學(xué)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物：192只1日齡愛拔益加(AA)肉雞。

試驗菌種：植物乳桿菌(L.plantarum)，本實驗室前期篩選、鑒定并保存，試驗前活化培養(yǎng)，活菌數(shù)為4×109CFU/mL。

基礎(chǔ)飼糧：購自洛陽某飼料廠，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 試驗設(shè)計和飼養(yǎng)管理

將192只1日齡肉雞隨機(jī)分為4個組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)8只雞。對照組(CON組)飼喂基礎(chǔ)飼糧；拌料組(MIX組)在基礎(chǔ)飼糧中添加乳酸菌菌液；灌服組(OI組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，并口腔灌服乳酸菌菌液；飲水組(DW組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，并在飲水中添加乳酸菌菌液。飼養(yǎng)試驗在河南科技大學(xué)牧場進(jìn)行，采用2階段籠養(yǎng)。試驗期42 d。肉雞自由采食、飲水，正?？販毓庹眨虩o免疫。

為保證各組肉雞每日采食乳酸菌活菌數(shù)基本相等(約8×108CFU)[10]。根據(jù)肉雞在飼養(yǎng)過程中水料比3∶1原則、國家飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)及類似試驗參考值，確定AA肉雞平均日采食量(1～21日齡平均采食量48 g，22～42日齡平均采食量156 g)，通過計算確定不同飼喂方式下1～21日齡和22～42日齡的乳酸菌菌液添加量，如表2所示。MIX組每周及時進(jìn)行拌料，OI組每日進(jìn)行1次口腔灌服，DW組根據(jù)肉雞飲水情況及時向水箱中補(bǔ)充混有乳酸菌菌液的飲用水。

表2 試驗設(shè)計

乳酸菌實際攝入量是根據(jù)本試驗肉雞平均日采食量及飲水量得到的肉雞實際每日攝入乳酸菌量。

Actual daily intake of lactic acid bacteria was the actual daily intake of lactic acid bacteria of broilers according to the average daily feed intake and drinking water of broilers in this experiment.

1.3 指標(biāo)及測定方法

1.3.1 生長性能測定

每周記錄每個重復(fù)投料量、剩料量和飲水量，在21、42日齡禁食12 h后，對每個重復(fù)的肉雞稱重，計算平均日飲水量、平均日采食量、平均日增重和料重比。

1.3.2 粗蛋白質(zhì)表觀代謝率測定

在21、42日齡時，每個重復(fù)取1只雞，按照Steenfeldt等[11]的試驗方法進(jìn)行代謝試驗，收集3 d的糞樣及飼糧樣品，依據(jù)《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》[12]利用半自動凱氏定氮儀測定粗蛋白質(zhì)含量，粗蛋白質(zhì)表觀代謝率計算公式如下：

粗蛋白質(zhì)表觀代謝率(%)=100×(飼糧中粗蛋白質(zhì)含量-糞中粗蛋白質(zhì)含量)/
飼糧中粗蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 腸道組織形態(tài)測定

在21、42日齡時，每個重復(fù)隨機(jī)抓取1只肉雞進(jìn)行屠宰，分離出空腸、回腸，各取2 cm腸段，生理鹽水沖洗后放入4%多聚甲醛中固定保存，進(jìn)行石蠟切片制作，蘇木精-伊紅(HE)染色后在光學(xué)顯微鏡下對組織形態(tài)進(jìn)行觀察。利用CaseViewer 2.4圖像處理系統(tǒng)對腸道絨毛高度、絨毛寬度、隱窩深度進(jìn)行測量，利用絨毛高度和絨毛寬度計算絨毛表面積，并計算絨毛高度與隱窩深度的比值(絨隱比，CD/VH)。

1.3.4 盲腸內(nèi)容物菌群的Illumina高通量測序及盲腸活菌培養(yǎng)計數(shù)

在21、42日齡時，每個重復(fù)隨機(jī)取1只肉雞屠宰，無菌采取左側(cè)盲腸內(nèi)容物，液氮保存，送上海元華生物科技有限公司，利用Illumina測序系統(tǒng)對盲腸內(nèi)容物菌群基因組DNA的16S rRNA V3～V4區(qū)進(jìn)行高通量測序和生物信息學(xué)分析[13]。

同時，取0.5 g腸道內(nèi)容物于1 mL無菌生理鹽水中，37 ℃搖床中培養(yǎng)30 min，稀釋到10-7～10-2，用平板計數(shù)法計算大腸桿菌、志賀氏菌、乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量。大腸桿菌采用EMB培養(yǎng)基，志賀氏菌采用SS培養(yǎng)基，好氧培養(yǎng)24 h；乳酸菌采用LBS培養(yǎng)基，雙歧桿菌采用TPY培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)48 h。

1.4 統(tǒng)計分析

利用SPSS 20.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，利用一般線性模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比較，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 乳酸菌不同飼喂方式對肉雞生長性能的影響

由表3可知，在1～21日齡，DW組平均日采食量和平均日飲水量顯著低于CON組(P<0.05)，MIX組、OI組和DW組料重比顯著低于CON組(P<0.05)。MIX組、OI組和DW組之間平均日采食量、平均日飲水量、平均日增重?zé)o顯著差異(P>0.05)，MIX組、DW組料重比顯著低于OI組(P<0.05)。

在22～42日齡，MIX組、OI組和DW組平均日增重顯著高于CON組(P<0.05)，料重比顯著低于CON組(P<0.05)。MIX組、OI組和DW組之間平均日采食量、平均日飲水量、平均日增重和料重比無顯著差異(P>0.05)。

在1～42日齡，DW組和MIX組平均日增重顯著高于CON組(P<0.05)，MIX組、OI組和DW組料重比顯著低于CON組(P<0.05)。MIX組、OI組和DW組之間平均日采食量、平均日飲水量、平均日增重和料重比無顯著差異(P>0.05)。

2.2 乳酸菌不同飼喂方式對肉雞粗蛋白質(zhì)表觀代謝率的影響

由表4可知，21和42日齡時，MIX組、OI組和DW組粗蛋白質(zhì)表觀代謝率均顯著高于CON組(P<0.05)。21日齡時，MIX組、OI組和DW組之間粗蛋白質(zhì)表觀代謝率差異不顯著(P>0.05)；42日齡時，DW組粗蛋白質(zhì)表觀代謝率顯著高于OI組(P<0.05)，與MIX組差異不顯著(P>0.05)。

表4 乳酸菌不同飼喂方式對肉雞粗蛋白質(zhì)表觀代謝率的影響

2.3 乳酸菌不同飼喂方式對肉雞腸道形態(tài)的影響

由表5可知，21日齡時，在空腸中，MIX組、OI組和DW組絨毛高度、絨毛表面積和絨隱比均顯著高于CON組(P<0.05)，隱窩深度顯著低于CON組(P<0.05)。MIX組、OI組和DW組絨毛高度、絨毛表面積差異不顯著(P>0.05)；DW組隱窩深度顯著低于MIX組(P<0.05)，與OI組差異不顯著(P>0.05)；DW組絨隱比顯著高于OI組(P<0.05)，與MIX組差異不顯著(P>0.05)。在回腸中，MIX組絨毛高度、絨毛表面積、絨隱比顯著高于CON組(P<0.05)，隱窩深度顯著低于CON組(P<0.05)；DW組絨毛表面積、絨隱比顯著高于CON組(P<0.05)，隱窩深度顯著低于CON組(P<0.05)。MIX組、OI組和DW組之間絨毛表面積、隱窩深度、絨隱比差異不顯著(P>0.05)；DW組絨毛高度顯著低于MIX組(P<0.05)，與OI組差異不顯著(P>0.05)。

42日齡時，在空腸中，OI組和DW組絨毛高度、絨毛表面積顯著高于CON組(P<0.05)；MIX組、OI組和DW組隱窩深度顯著低于CON組(P<0.05)，絨隱比顯著高于CON組(P<0.05)。DW組絨毛高度、絨隱比顯著高于MIX組和OI組(P<0.05)，絨毛表面積顯著高于MIX組(P<0.05)。在回腸中，MIX組、OI組和DW組絨毛高度和絨隱比顯著高于CON組(P<0.05)，MIX組和DW組絨毛表面積顯著高于CON組(P<0.05)，DW組隱窩深度顯著低于CON組(P<0.05)。DW組絨毛高度、絨毛表面積、絨隱比顯著高于MIX組和OI組(P<0.05)，MIX組、OI組和DW組之間隱窩深度差異不顯著(P>0.05)。

表5 乳酸菌不同飼喂方式對肉雞腸道形態(tài)的影響

2.4 乳酸菌不同飼喂方式對盲腸菌群的影響

由表6可知，21日齡時，各組操作分類單元(OTU)數(shù)量在465～692個，MIX組、OI組和DW組Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)與CON組相比有所提高；42日齡時，各組OTU數(shù)量在557～650個，MIX組、OI組和DW組Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)與CON組相比均有所提高，表明添加乳酸菌可提高菌落多樣性和豐富度。各組樣品的覆蓋度(coverage)均在0.99以上，說明樣品中序列已基本全部檢測出。

在門水平上，各組優(yōu)勢菌群如圖1所示。21日齡時，各組核心菌門為厚壁菌門、擬桿菌門；CON組厚壁菌門相對豐度最高，為88.37%，DW組擬桿菌門相對豐度最高，為25.50%。42日齡時，各組核心菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、無壁菌門等；CON組厚壁菌門、變形菌門、無壁菌門相對豐度較高，分別為88.37%、2.75%、2.68%，DW組擬桿菌門相對豐度最高，為25.50%。

表6 盲腸內(nèi)容物16S rRNA測序結(jié)果

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidete：擬桿菌門；Tenericutes：無壁菌門；Proteobacteria：變形菌門；Cyanobacteria：藍(lán)細(xì)菌；Others：其他。

在屬水平上，各組優(yōu)勢菌群如圖2所示。21日齡時，各組盲腸菌群主要菌屬為糞球菌屬；CON組糞球菌屬相對豐度為36.77%，MIX組為18.75%，OI組為18.91%，DW組為33.67%。毛螺菌科未分類屬也為優(yōu)勢菌屬，MIX組毛螺菌科未分類屬相對豐度為12.34%，OI組為9.86%，DW組為12.76%。CON組糞球菌屬、梭菌屬相對豐度較高，分別為36.77%、6.08%。MIX組克里斯滕森菌科R-7群相對豐度最高，為16.12%。OI組令枝菌屬、乳桿菌屬相對豐度較高，分別為8.58%、4.58%。DW組毛螺菌科未分類屬、瘤胃球菌科UCG-014相對豐度較高，分別為12.76%、9.07%。

42日齡時，CON組布勞特氏菌屬、梭菌屬、埃希氏菌屬相對豐度較高，分別為11.20%、8.63%、8.10%。MIX組毛螺菌科未分類屬、糞球菌屬相對豐度較高，分別為15.49%、9.24%。OI組乳桿菌屬、克里斯滕森菌科R-7群相對豐度較高，分別為8.34%、4.60%。DW組梭菌屬、擬桿菌屬、令枝菌屬相對豐度較高，分別為28.65%、17.17%、6.90%。

Faecalibacterium：糞球菌屬；Lachnospiraceae_unclassified：毛螺菌科未分類屬；[Ruminococcus]_torques_group：鏈瘤胃球菌群；Clostridiales_vadinBB60_group_norank：梭菌屬；Ruminococcaceae_UCG-014：瘤胃球菌科UCG-014；Bacteroides：擬桿菌屬；Ruminococcaceae_unclassified：瘤胃球科未分類屬；Anaerotrunous：厭氧棍狀菌屬；Christensenellaceae_R-7_group：克里斯滕森菌科R-7群；Alistpes：令枝菌屬；Ruminococcaceae_uncultured：瘤胃球科未分類屬；Blautia：布勞特氏菌；Eisenbergiella：艾森伯格氏菌屬；Ruminococcaceae_UCG-005：瘤胃球菌科UCG-005；[Eubacterium]_coprostanoligenes_group：真桿菌屬；Lactobacillus：乳桿菌屬；Clostridiales_unclassified：梭狀芽胞桿菌未分類屬；Lachnoclostridum：藍(lán)綠藻菌屬；Ruminiclostridium_9：瘤胃梭菌-9屬；Butyricicoccus：丁酸球菌屬；Tyzzerella：泰澤拉菌屬；Erysipelatoclostridium：丹毒莢膜菌屬；Anaerofilum：細(xì)桿菌屬；Mollicutes_RF9_norank：柔膜細(xì)菌RF9屬；Erysipelotrichaceae_unclassified：丹毒菌科未分類屬；Flavonifractor：黃腐菌屬；Lachnospiraceae_NK4A136_group：毛螺菌科NK4A136群；Escherichia-Shigella：埃希氏菌屬；Odoribacter：內(nèi)臟臭氣桿菌；Subdoligranulum：罕見小球菌屬；Sellimonas：腸道糞便單胞菌屬；Ruminiclostridium：瘤胃梭菌屬；Ruminococcaceae_UCG-010：瘤胃球菌科屬UCG-010；Ruminococcus_1：鏈瘤胃球菌1屬；Gastranaerophilates_norank：胃嗜氣菌屬。

由表7可知，21、42日齡時，MIX組、OI組和DW組盲腸雙歧桿菌數(shù)量均顯著高于CON組(P<0.05)，大腸桿菌數(shù)量顯著低于CON組(P<0.05)。21日齡時，DW組盲腸乳酸菌、雙歧桿菌數(shù)量顯著高于MIX組和OI組(P<0.05)，志賀氏菌數(shù)量顯著低于CON組、MIX組和OI組(P<0.05)，大腸桿菌數(shù)量顯著低于MIX組(P<0.05)。42日齡時，DW組、OI組盲腸雙歧桿菌數(shù)量顯著高于MIX組(P<0.05)，大腸桿菌數(shù)量顯著低于MIX組(P<0.05)。

表7 盲腸活菌計數(shù)結(jié)果

7Items GroupsCONMIXOIDWPP-value42 42 days of age Bifidobacterium7.98±0.02c8.43±0.02b9.27±0.02a9.30±0.01a0.026 Lactic acid bacteria7.84±0.04b9.14±0.01a9.08±0.02a9.01±0.02a0.043 Escherichia coli9.42±0.02a9.26±0.10b8.18±0.05c8.23±0.06c0.031 Shigellosis9.42±0.01a8.94±0.04b8.21±0.01c8.20±0.02c0.036

3 討 論

3.1 乳酸菌不同飼喂方式對肉雞生長性能和粗蛋白質(zhì)表觀代謝率的影響

很多研究認(rèn)為，乳酸菌可附著于動物腸黏膜表面，改善腸道結(jié)構(gòu)，提高消化酶活性，促進(jìn)蛋白質(zhì)等有機(jī)物的消化吸收，從而提高對飼糧的代謝及利用率，在腸道中可以起到良好的益生作用[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可通過提高采食量而提高肉雞生長性能[17-18]。本試驗在1～21日齡時，DW組平均日采食量顯著低于CON組，與OI組和MIX組差異不顯著。產(chǎn)生差異的原因可能是乳酸菌可提高營養(yǎng)物質(zhì)代謝率，進(jìn)而降低采食量。因為有研究發(fā)現(xiàn)，飼喂肉雞嗜酸乳桿菌可顯著提高粗蛋白質(zhì)表觀代謝率[19]。本試驗42日齡時，MIX組、OI組和DW組粗蛋白質(zhì)表觀代謝率和平均日增重均高于CON組，也證實了這種可能性。此外，菌株的繁殖能力、能否代謝活性物質(zhì)及產(chǎn)生有機(jī)酸的不同，也可能對結(jié)果產(chǎn)生影響[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，DW組和MIX組生長性能和粗蛋白質(zhì)表觀代謝率無顯著差異，且均優(yōu)于OI組，可能是在飼喂過程中口腔灌服會導(dǎo)致肉雞應(yīng)激，使其精神萎靡，采食量減少，飼料利用率降低[21]。

3.2 乳酸菌不同飼喂方式對肉雞腸道健康的影響

腸道絨毛高度、隱窩深度和絨隱比是評價腸道功能的重要指標(biāo)[22-23]。谷巍等[24]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌通過增加腸道絨隱比以增強(qiáng)小鼠免疫力，降低小鼠腹瀉率。肉雞飼糧中添加乳酸菌，也可提高絨隱比，降低嘔吐毒素污染飼糧對肉雞的不良影響[25]。本研究中，以飲水方式飼喂乳酸菌菌液，肉雞小腸絨毛表面積、絨隱比顯著高于其他飼喂方式。分析其原因可能為：雖然本試驗設(shè)計初為各組提供了等量乳酸菌，但受肉雞采食習(xí)性影響(漏料、滴水等)，加之拌料后菌種活菌數(shù)與菌液直接保存也存在細(xì)微差異，導(dǎo)致各組肉雞每日實際攝入活菌數(shù)量存在一定差異，影響飼喂效果。其中，以飲水方式飼喂乳酸菌菌液可保證菌液混合均勻，減少誤差，避免肉雞應(yīng)激，提高乳酸菌飼喂效果。

乳酸菌在腸道內(nèi)增殖，代謝出乳酸，抑制致病菌的增殖，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，肉雞盲腸菌群在門水平上主要有厚壁菌門、擬桿菌門、無壁菌門、變形菌門，在屬水平上主要有糞球菌屬、擬桿菌屬，與前人研究結(jié)果[27-28]一致。研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門和擬桿菌門存在著共生關(guān)系，可共同促進(jìn)宿主吸收或儲存能量，若比例過高會導(dǎo)致宿主產(chǎn)生代謝綜合征[29]。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼喂乳酸菌能降低厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度，促進(jìn)肉雞健康。

本試驗發(fā)現(xiàn)，在屬水平上，MIX組、OI組和DW組大腸桿菌、志賀氏菌等致病菌屬相對豐度均低于CON組，與劉鳳美等[30]研究結(jié)果一致。其中，以飲水方式飼喂乳酸菌菌液能顯著降低有害菌數(shù)量。DW組瘤胃球菌科UCG-014相對豐度最高，其主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙酸、甲酸，可以降低腸道pH，減少有害菌的增殖[31]。有報道表明，小鼠腸道菌群在乳酸菌干預(yù)后，乳桿菌屬豐富度顯著增加[32]。本試驗中，不同方式飼喂乳酸菌均可增加盲腸乳桿菌屬相對豐度，其中OI組、DW組盲腸乳桿菌屬相對豐度較高，與活菌計數(shù)結(jié)果相一致。

4 結(jié) 論

本試驗條件下，3種乳酸菌飼喂方式均可不同程度提高肉雞生長性能和粗蛋白質(zhì)表觀代謝率，改善腸道形態(tài)和腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加有益菌數(shù)量，降低有害菌數(shù)量，其中以飲水方式飼喂效果更佳。