駱 琳，蔡 杰，鄧蒙蒙，劉建新，王迪銘*

（1.浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310058；2.浙江大學奶業(yè)科學研究所，浙江杭州 310058）

氧化應激是乳腺炎、酸中毒、酮癥和關節(jié)病等代謝性疾病的重要致病因素。因此，準確評估奶牛氧化應激狀態(tài)在生產中尤為重要。由氧化應激引起的奶牛代謝穩(wěn)態(tài)變化可通過血液、尿液、唾液和牛奶等體液中相關指標來表征。從動物生理和動物福利方面考慮，分析奶牛血液循環(huán)中的相關指標以及牛奶成分以評估奶牛健康狀況，是判斷奶牛潛在代謝疾病的簡易有效方法。因此，尋找體內具有代表性的抗氧化劑和氧化劑作為生物標志物來反映機體氧化應激狀態(tài)尤為重要。篩選氧化應激的合適生物標志物應是生化代謝過程中穩(wěn)定的產物且在樣品處理、加工、分析和儲存過程中不容易損失，具有標準化的定量方法并可有效反映機體氧化程度，易于獲取。本文主要闡述了全血、血漿/血清、牛奶樣品中可反映奶牛氧化應激狀態(tài)的主要標志物，以期為后續(xù)研究氧化應激相關疾病提供一定參考。

1 氧化應激的成因及其與奶牛健康的關系

在正常情況下，生物體內的自由基總是處于不斷產生和不斷消除的動態(tài)平衡中。氧化應激是機體自由基（活性氧、活性氮）生成/消除的穩(wěn)態(tài)失衡所導致的機體代謝紊亂的一種現象，其本質是自由基產生過度和內源性/外源性抗氧化系統對自由基消除能力減弱的障礙。機體細胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)由其復雜的內源性/外源性抗氧化防御系統來保證（圖1），該系統包括內源性抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶），以及外源性非酶化合物[如谷胱甘肽、蛋白質（鐵蛋白、轉鐵蛋白、銅藍蛋白、白蛋白）]和低分子量清除劑（如尿酸、輔酶Q）。當機體細胞抗氧化能力不足以抵消自由基的生成時，機體極易處于氧化應激狀態(tài)。因此，氧化應激是自由基發(fā)生增加和保護性抗氧化防御系統活性降低的綜合結果。

圖1 生物機體活性氧代謝物的防護系統[5]

在實際生產過程中，氧化應激與奶牛疾病發(fā)生之間存在著緊密聯系。Laliotis 等在研究圍產期奶牛氧化應激生物標志物與臨床乳腺炎發(fā)病率的關系時發(fā)現，患有乳腺炎組的奶牛體內自由基含量極顯著高于對照健康組奶牛，同時體內抗氧化能力極顯著低于對照組。Tsuchiya 等在研究圍產期健康荷斯坦奶牛和產后患有酮病、皺胃移位奶牛氧化應激標志物的變化時發(fā)現，患有疾病的奶牛體內氧化應激水平較健康對照組顯著升高。此外，有研究表明，產犢前高體況評分的奶牛在產后體重會損失較多，血液循環(huán)中的抗氧化能力較低，自由基含量較高。綜上，當奶牛機體自由基發(fā)生增加和保護性抗氧化防御系統活性降低時，會發(fā)生氧化應激，從而更易患有乳房炎、酮病等多種代謝性疾病。

由氧化應激引起的奶牛疾病會降低奶牛產奶量，增加代謝疾病發(fā)生率，并會導致損失難以量化的間接成本（如發(fā)情延遲、配種延遲以及重復配種）。因此，通過檢測奶牛體內的抗氧化能力和自由基含量，來評判奶牛機體氧化應激水平，對圍產期、高產等特定群體奶牛的健康評估具有重要意義。

2 奶牛不同體液中的氧化應激生物標志物

2.1 奶牛血清/血漿中的氧化應激生物標志物

2.1.1 活性氧代謝物 生物系統中最豐富的自由基是以氧為中心的自由基及其代謝產物，通常稱為活性氧?；钚匝踝鳛榧毎x的正常副產物連續(xù)形成。低濃度活性氧對于蛋白質磷酸化、轉錄因子激活、細胞分化、凋亡、卵母細胞成熟、類固醇生成、細胞免疫和微生物防御等生理過程必不可少。然而，當活性氧過量產生時，它們會損害細胞脂質、蛋白質和脫氧核糖核酸，從而損害細胞功能?；钚匝醮x物是一個集合術語，不僅包括氧中心自由基（如超氧陰離子和羥基自由基），還包括一些氧的非自由基衍生物（如過氧化氫和次氯酸）。活性氧代謝物試劑盒可評估血漿和其他生物液體中的氧化水平，其測試已經使用電子自旋共振進行了驗證。電子自旋共振被認為是測量總氧化狀態(tài)的“金標準”，但其方法復雜且大多數實驗室缺少特定的技術支持，不適合常規(guī)分析。血漿中活性氧代謝物含量已被認為是自由基產生的指示物，且活性氧代謝物試劑盒檢測已用于監(jiān)測奶牛的氧化應激狀態(tài)。Fiore 等研究發(fā)現，產后皺胃左方變位奶牛體內用來表征氧化能力的活性氧代謝物含量較對照組顯著升高，表明患病奶牛經歷了氧化劑與抗氧化劑之間的不平衡。因此，可通過檢測體內活性氧代謝物含量來預測奶牛機體的氧化應激狀態(tài)。

2.1.2 丙二醛和硫代巴比妥酸活性物質 不飽和脂肪酸是對自由基損傷最敏感的底物之一，很容易受到羥基的過氧化作用。丙二醛是多不飽和脂肪酸自由基誘導分解過程中形成的幾種低分子量終產物之一，被認為是脂質氧化衰變的公認標志，也是表征機體氧化應激的最佳指標。Milne 等研究已經發(fā)現，體內丙二醛含量與其他標記物（如F2-異前列腺素）有極顯著相關性；Tsuchiya 等也發(fā)現，圍產期奶牛的丙二醛與游離脂肪酸（FFA）和-羥丁酸等體脂動員相關指標也存在顯著相關性。因此，丙二醛可作為一種預測機體氧化損傷的較好指標。值得注意的是，由于測量的丙二醛特異性低，只能在體內檢測到一小部分，但丙二醛很容易與硫代巴比妥酸活性物質反應生成紅色素，這種紅色素可以通過分光光度法以硫代巴比妥酸活性物質形式輕松測得。因此，也可通過檢測硫代巴比妥酸活性物質含量表征機體氧化應激狀態(tài)，這種檢測方法經濟、簡便、快捷，已經被廣泛用于評估奶牛機體的氧化應激狀態(tài)。

2.1.3 F2-異前列腺素 氧化應激的嚴重程度可以通過測量任何大分子損傷來確定，但脂質過氧化程度通常被用來評估奶牛的氧化狀態(tài)。過氧化脂質通常是由酶促反應產生，但也可以通過活性氧直接氧化脂質而非酶促形成。脂質是對氧化損傷最敏感的大分子，由非酶生成產生可量化的氧化脂質（如異前列腺素）是人類醫(yī)學中量化氧化應激的生物標志物，它們可用作氧化應激的特異性和敏感性標記。最近，異前列腺素（一種基于酶聯免疫吸附試驗的測定指標）被認為是最可靠的脂質氧化標記物，該標志物的應用可更好地揭示反芻動物圍產期脂質過氧化狀態(tài)。此外，Kuhn 等發(fā)現，泌乳奶牛血漿15-F2t-異前列腺素濃度的增加與較高的血漿氧化應激指數相一致，進一步表明血漿15-F2t-異前列腺素是評估奶牛不同泌乳階段氧化應激的一種更全面有效的氧化平衡測量指標。

2.1.4 谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶 谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶是細胞內抗氧化防御的主要形式。超氧陰離子自由基是生物體內正常的代謝產物，但是自由基的積累會使細胞膜的脂質發(fā)生過氧化作用而引起膜裂變，導致細胞損傷甚至死亡。超氧化物歧化酶的主要功能是催化超氧陰離子自由基歧化為過氧化氫和氧，是生物體內最重要且最佳的自由基清除劑，維持著機體的代謝平衡；谷胱甘肽過氧化物酶通過催化氫和脂質過氧化物的還原，可直接清除自由基歧化過程中產生的過氧化氫，從而有助于動物組織的氧化防御。Yu 等發(fā)現，在熱應激條件下，奶牛體內超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶含量顯著降低，且超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶含量與奶產量呈顯著正相關。因此，在熱應激條件下可通過檢測超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶含量來評估奶牛體內的抗氧化狀態(tài)，并可及時預防氧化應激對奶牛造成的危害。

2.1.5 總抗氧化能力 由于很難單獨測量每種抗氧化成分及其在血漿中的相互作用，可通過檢測當量抗氧化能力來評估機體總抗氧化能力，這種檢測結果可表征樣品中存在的所有抗氧化劑（如白蛋白、硫醇、膽紅素和超氧化物歧化酶）在機體內的綜合作用?？偪寡趸芰Φ臏y定考慮了血漿和體液中所有抗氧化劑的累積作用，提供了一個綜合參數，而不是簡單地測量抗氧化劑的活力總和。Habiballah 等發(fā)現，測量反芻動物的總抗氧化能力可能比單一參數更具有代表性。Omidi 等發(fā)現，經產奶牛體內血漿總抗氧化能力較初產奶牛顯著升高，并高于泌乳早期/盛期奶牛、干奶期奶牛體內總抗氧化能力，首次表明臨床上明顯健康的奶牛可能具有較低的總抗氧化能力（尤其是初產奶牛），這種情況可能使奶牛對壓力、疾病或健康問題更敏感。

2.1.6 生物抗氧化潛能 生物抗氧化潛能主要是衡量外源性抗氧化劑（如尿酸、抗壞血酸、蛋白質、-生育酚和膽紅素等）水平。在奶牛泌乳早期和泌乳中期的測定發(fā)現，生物抗氧化潛能可作為評估奶牛機體抗氧化能力的有效指標。有研究表明，在日糧中添加精料可以減少牧草的攝入量并增加一些抗氧化劑在瘤胃中的降解；當奶牛飼喂玉米青貯飼料和精料補充料時，生物抗氧化潛能顯著降低，表明補充的精料顯著降低了體內的抗氧化劑水平。牧草的可變性以及在反芻動物飼糧中最大化利用牧草的方式會改變其營養(yǎng)成分，從而可能會影響奶牛機體的氧化應激狀態(tài)。事實上，抗氧化劑系統成分的變化通常不是原因，而是由更高的自由基活性誘導的氧化應激的結果。以上研究提示，血漿生物抗氧化潛能含量的降低也可能是活性氧代謝物含量升高的原因。

2.1.7 氧化應激指數 在生理條件下，機體通常有足夠的抗氧化儲備來應對自由基的產生，但當自由基的生成超過機體的抗氧化能力時，即體內氧化劑和抗氧化劑含量失衡時，就會產生氧化應激。第一個使用氧化劑/抗氧化劑比例作為評估機體氧化狀態(tài)的有效指標是在《人類醫(yī)學》雜志上發(fā)表的，該比例增加表明由于活性氧產生或防御性抗氧化劑消耗的增加而導致氧化應激的風險增加。同時Pietro在綜述中提出，氧化劑/抗氧化劑比例也可作為指示奶?；疾★L險的指標。

Abuelo 等研究發(fā)現，當對奶牛整個過渡時期血清中活性氧自由基和血清抗氧化能力的結果進行單獨評估時，沒有發(fā)現氧化和抗氧化這兩種指標之間有顯著差異；當用兩者的比例對氧化劑和抗氧化劑進行綜合評估時，發(fā)現奶牛產前和產后階段存在統計學差異，提示奶牛在分娩前后經歷了氧化應激。Laliotis 等研究發(fā)現，患有乳腺炎的奶牛其氧化應激指數值極顯著高于對照健康組奶牛，表明患有乳腺炎的奶牛體內氧化應激水平較高。在人類醫(yī)學中的研究也發(fā)現，當將體內氧化劑和抗氧化劑含量以比例結合時，氧化應激水平和病理之間的相關性更高。

2.2 奶牛全血中表征的氧化應激生物標志物 紅細胞是血液中數量最多的一種血細胞，也是維持生命活動最重要的細胞之一。因紅細胞具有運輸氧氣的特殊生理功能，紅細胞必須始終暴露在每個血管環(huán)路以及其他各種不同的外源性物質中。氧化應激在很多生理和病理現象中扮演重要的角色，在一些病理（如免疫紊亂、感染、理化因素等）條件下，紅細胞會處在不斷變化的氧化應激環(huán)境中。紅細胞自身就有一個抗氧化系統來抵抗紅細胞的氧化反應。但當機體處于氧化應激狀態(tài)時，紅細胞的抗氧化系統不能有效地清除血紅蛋白自我氧化生成的過氧陰離子自由基，導致紅細胞中氧自由基大量蓄積，進一步氧化細胞中的主要蛋白質和脂質，使紅細胞的功能結構遭到破環(huán)，導致紅細胞損傷。故氧化應激是紅細胞損傷最常見的原因，因為紅細胞對氧化應激具有高度的易損性，已經被作為模型來研究生物膜的氧化損傷。

Gaál 等測定犢牛出生時全血自由基穩(wěn)態(tài)濃度、紅細胞脂質過氧化物（丙二醛）和抗氧化酶活性（谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶）、血漿總抗氧化能力以及產犢母牛的血漿抗氧化能力發(fā)現，犢牛出生時體內已存在氧化應激；同時產犢當天奶牛體內總抗氧化能力顯著低于非產犢奶牛，表明產犢作為一種應激原會導致奶牛機體短期氧化還原失衡。Lakritz 等研究發(fā)現，熱應激顯著降低了奶牛全血中紅細胞谷胱甘肽濃度并增加了氧化型谷胱甘肽濃度，表明熱應激能夠在健康的泌乳奶牛中誘導氧化應激。綜上，可通過檢測全血紅細胞中丙二醛、谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽含量以及抗氧化酶的活性來評估奶牛的氧化應激狀態(tài)。

2.3 奶牛乳中表征的氧化應激生物標志物 牛奶的質量與乳腺的健康密切相關。牛奶中能檢測到的抗氧化活性物質主要可分為蛋白質和非蛋白質兩大類。蛋白質類抗氧化劑包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶以及乳成分中的酪蛋白和多肽等；非蛋白質類抗氧化劑包括維生素C 和維生素E 和類胡蘿卜素。事實上，不同的牛奶成分已被證明具有特定的抗氧化能力。Cristina 等研究發(fā)現，牛奶中含有大量活性物質，在抑制脂質過氧化和加快超氧化物自由基清除速率方面具有重要價值（如酪蛋白和乳清在抑制細胞過氧化物形成中發(fā)揮著重要作用）。Talukder 等通過檢測全脂牛奶樣品（生物抗氧化潛能）、脫脂奶樣品（脂質過氧化物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶和銅藍蛋白）、乳清樣品（高級氧化蛋白產物）相關指標含量變化評估處于發(fā)情周期的奶牛有無排卵，發(fā)現排卵奶牛的超氧化物歧化酶水平升高，而脂質過氧化物、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽水平降低，提示乳中抗氧化相關指標在奶牛發(fā)情鑒定中可作為重要表征指標。

另外，Kuhn 等研究首次表明乳中15-F2t-異前列腺素含量可有效指示乳腺脂質過氧化程度，作為乳腺炎和哺乳早期奶牛氧化應激的評估標準。牛奶活性物質的組成是乳腺代謝特征的直接表征，作為一種非侵入性樣品，獲取并分析牛奶中一些關鍵活性物質，在監(jiān)測奶牛個體健康狀態(tài)和應激程度等方面具有巨大應用潛力。

3 小結與展望

奶牛不同體液中潛在的生物標志物可反映機體氧化應激狀況。因此，可通過評估全血中紅細胞、血清/血漿以及牛奶中氧化和抗氧化水平來表征奶牛機體的氧化平衡狀態(tài)。根據不同試驗需求，檢測不同體液中的氧化應激生物標志物，并對已采用的不同方法進行結果比較，可以更好地綜合評估奶牛的健康和代謝狀況，確定適合反芻動物氧化應激的檢測方法，從而為不同生物標志物建立正常生理范圍，確定奶牛氧化應激閾值，以期推動反芻動物氧化應激研究和應用領域更快、更好地發(fā)展。