潘磊，肖麗麗

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；2.江西省皮膚病?？漆t(yī)院，江西省皮膚病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，國家皮膚與免疫疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，江西省皮膚病研究所，南昌大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院，江西 南昌 330001

十味參蛇洗劑為江西省皮膚病?？漆t(yī)院的醫(yī)院外用制劑，處方由苦參、蛇床子、地膚子、黃柏、金銀花、連翹、百部、烏梢蛇、蜂房、千里光等十味藥材組成。具有清熱除濕，祛風(fēng)止癢，解毒殺蟲的作用。其中處方中大部分藥材中含有抑菌成分［1-8］，如君藥苦參中的苦參總堿、苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿等成分對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌及白色念珠菌均具有一定程度的抑制效果［1］。此外中藥制劑處方中的飲片大多來源于植物及動(dòng)物等，極易受到微生物的污染，是中藥制劑微生物污染的重要來源之一。本文根據(jù)《中國藥典》2015 版四部通則［9］中關(guān)于微生物檢查的規(guī)定和方法，對(duì)十味參蛇洗劑的微生物限度檢查方法進(jìn)行研究，并對(duì)建立的方法進(jìn)行了驗(yàn)證，確保該醫(yī)院制劑的微生物限度檢查方法符合規(guī)定，能有效地反映該制劑中所含微生物的真實(shí)情況，確保用藥安全。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備

BT125D 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；LMQ.C-50E 立式滅菌器，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；ZW-2008 智能集菌儀，琪摩（上海）電子科技有限公司；SJ-CJ-1D 超凈工作臺(tái)，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；BHC-1300 ⅡA2生物安全柜，阿爾泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PYXDHS-55-40 細(xì)菌培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠；MJ-250BSH-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］，批號(hào)：9a2-2；枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］，批號(hào)：2a27-2；白色念珠菌［CMCC（F）98001］，批號(hào)：2a21-2；銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］，批號(hào)：2a28-2；黑曲霉［CMCC（F）98003］，批號(hào)：0A1004；以上菌種皆購自中國食品藥品檢定研究院。各試驗(yàn)菌株均為第三代工作菌。

1.3 培養(yǎng)基與稀釋液

沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20190808）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20190907）；甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20190322）；溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20190228）；以上培養(yǎng)基均由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)：190708，上海博微生物科技有限公司）；0.9%無菌氯化鈉溶液（自制，氯化鈉，批號(hào)：190911，西隴科學(xué)股份有限公司）。

1.4 供試品

十味參蛇洗劑（批號(hào)：200901、200902、200903，規(guī)格：每1 mL 相當(dāng)于飲片0.425 g），均由江西省皮膚病?？漆t(yī)院提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)用菌液的制備

根據(jù)2015 版《中國藥典》四部通則1105及1006 要求，將各試驗(yàn)菌制成菌懸液，濃度在50～100 cfu/mL 左右。

2.2 供試品的制備

十味參蛇洗劑為水溶性液體制劑，按規(guī)定可使用原液作為供試品。另取10 mL 供試品，用稀釋液（0.9%無菌氯化鈉溶液）稀釋制成1∶10 供試液；

2.3 微生物限度檢查方法研究

2.3.1 預(yù)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)2015 版《中國藥典》四部1105要求，選擇對(duì)培養(yǎng)環(huán)境要求較高的枯草芽孢桿菌進(jìn)行需氧菌檢查，同時(shí)選擇生長曲線較快進(jìn)入穩(wěn)定期的白色念珠菌［10］進(jìn)行霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)檢查，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示采用平皿法時(shí)十味參蛇洗劑會(huì)抑制枯草芽孢桿菌的生長，而對(duì)白色念珠菌抑制效果不明顯。當(dāng)以薄膜過濾法（原液、1∶10 供試液）檢查需氧菌總數(shù)，沖洗量為300 mL 時(shí)，枯草芽孢桿菌的回收比值均為0.3，不在規(guī)定的范圍內(nèi)。沖洗量為500 mL 時(shí)，原液和1∶10 供試液回收比值均為0.9，所以進(jìn)行需氧菌總數(shù)檢查時(shí)采用薄膜過濾法（原液、1∶10 供試液，500 mL 沖洗，每次100 mL）；進(jìn)行霉菌及酵母菌總數(shù)檢查時(shí)采用平皿法（原液、1∶10 供試液）。

2.3.2 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)試驗(yàn) 分別取供試品原液及1∶10 供試液各1 mL，按照薄膜過濾法，用500 mL稀釋液（0.9%無菌氯化鈉溶液）進(jìn)行沖洗，將100 cfu 左右的試驗(yàn)菌加入最后進(jìn)行沖洗的稀釋液中，待水分濾干后，取出濾膜，立即貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，在30 ℃～35 ℃進(jìn)行1 d～3 d 的培養(yǎng)，每日進(jìn)行觀察。以稀釋液替代菌液，按相同方法制備供試品對(duì)照組樣品。另用稀釋液替代供試液，按相同方法制備菌液對(duì)照樣品。重復(fù)3 次上述試驗(yàn)。具體結(jié)果如表2 所示。表2 結(jié)果表明使用薄膜過濾法（原液、1∶10供試液，500 mL 沖洗，每次100 mL）進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)檢測，所有試驗(yàn)菌的回收率都在藥典要求的0.5～2.0 的范圍內(nèi)。

表2 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.3.3 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù) 分別取供試品原液及1∶10 供試液各9.9 mL，加入0.1 mL 適宜濃度的試驗(yàn)菌，使得每1 mL 供試液中試驗(yàn)菌含量不超過100 cfu，混勻。將1 mL 供試液注入平皿中，然后立即將適量的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基倒入平皿；在20 ℃～25 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行1 d～5 d 的培養(yǎng)，每日進(jìn)行觀察。以稀釋液替代菌液，按相同方法制備供試品對(duì)照組樣品。另以稀釋液替代供試液，按同樣方法制備菌液對(duì)照組樣品。重復(fù)3 次上述試驗(yàn)。結(jié)果如表3 所示。

表3 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

表3 結(jié)果顯示白色念珠菌和黑曲霉的菌數(shù)回收比值均在藥典規(guī)定范圍內(nèi)，所以可以使用平皿法進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)檢查。

2.3.4 控制菌檢查 十味參蛇洗劑為皮膚給藥制劑，根據(jù)《中國藥典》2015 版四部中規(guī)定以銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌作為試驗(yàn)菌進(jìn)行控制菌檢查的研究。

按照藥典規(guī)定的金黃色葡萄球菌檢查方法操作，制備供試品樣品，按要求進(jìn)行培養(yǎng)觀察。同時(shí)以稀釋液替代供試液，按相同的方法操作，制備陰性對(duì)照樣品，以消除稀釋液及培養(yǎng)基的干擾。觀察其菌落的生長情況。試驗(yàn)結(jié)果見表4。

按照藥典規(guī)定的銅綠假單胞菌檢查方法操作，制備供試品樣品，并按要求進(jìn)行培養(yǎng)觀察。同時(shí)以稀釋液替代供試液，按相同的方法操作，制備陰性對(duì)照樣品，以消除稀釋液及培養(yǎng)基的干擾。觀察其菌落的生長情況。試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 銅綠假單胞菌檢查結(jié)果

根據(jù)表4、5 的結(jié)果可以看出，十味參蛇洗劑對(duì)金黃色葡萄球菌以及銅綠假單胞菌的抑菌效果不顯著，控制菌檢查可采用常規(guī)方法進(jìn)行。

2.4 三批樣品的微生物限度檢查

為驗(yàn)證所建的微生物限度檢查方法的是否適用，對(duì)三個(gè)不同批次的十味參蛇洗劑進(jìn)行微生物限度檢查，結(jié)果顯示建立的微生物限度檢查方法適用于十味參蛇洗劑。結(jié)果見表6。

表6 三批樣品微生物限度檢查結(jié)果

3 討論

供試品原液及1∶10 供試液采用薄膜過濾法檢測需氧菌計(jì)數(shù)總數(shù)時(shí)，菌數(shù)回收比值均在規(guī)定范圍內(nèi)，但由于十味參蛇洗劑中有輕搖易散的沉淀，供試品原液過濾時(shí)，速度緩慢，且在薄膜上保留顏色較深，在觀察菌落生長情況時(shí)存在一定的干擾，故在最終確定十味參蛇洗劑需氧菌計(jì)數(shù)總數(shù)檢測方法中選用1∶10 供試液采用薄膜過濾法進(jìn)行檢測。使用平皿法（原液）進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)進(jìn)行檢測，控制菌檢查方法為常規(guī)法。此外本研究建立的微生物限度檢查方法同樣適用于2020 版《中國藥典》的相關(guān)規(guī)定［11］。