王燕,劉緒平,章紅,段和祥,劉衛(wèi)德,霍曉菲
1.江西中醫(yī)藥大學(xué),江西 南昌 330004;2.江西省藥品檢驗檢測研究院,國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點(diǎn)實(shí)驗室,江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心,江西 南昌 330029
黃曲霉毒素(aflatoxins,AFT)為一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的真菌次級代謝產(chǎn)物,其中黃曲霉毒素B1(AFB1)毒性最強(qiáng)、污染普遍,被列為Ⅰ級致癌物。研究表明,AFT 具有嚴(yán)重的肝毒性,甚至產(chǎn)生致畸、致癌和致突變等危害[1]。然而,中藥在種植、采收、炮制加工、貯藏等各個環(huán)節(jié)都有可能出現(xiàn)AFT 污染,影響中藥質(zhì)量和臨床用藥安全[2]。近年來,中藥的質(zhì)量安全特別是中藥中AFT 污染問題已經(jīng)嚴(yán)重制約了我國中藥現(xiàn)代化發(fā)展進(jìn)程。因此,中藥中AFT 檢測及降解脫毒技術(shù)的研究迫在眉睫。本文在簡要介紹中藥中AFT 污染狀況基礎(chǔ)上,對AFT 國內(nèi)外限量標(biāo)準(zhǔn)、AFT 檢測技術(shù)及降解脫毒技術(shù)進(jìn)行了歸納總結(jié),以期為解決AFT 污染問題,保障中藥質(zhì)量提供思路。
中藥污染AFT 與其自身基質(zhì)和外部環(huán)境之間有著密切的關(guān)系。污染的方式復(fù)雜多樣,可能發(fā)生在整個鏈條上,從鮮品到最終產(chǎn)品。從內(nèi)部因素來看,某些中藥基質(zhì)為霉菌生長代謝提供充足營養(yǎng),從而加劇AFT 污染程度,如脂肪油、糖類、蛋白質(zhì)等基質(zhì)成分。其中脂肪油含量高的中藥最易受AFT 污染,其次則是富含糖類和蛋白質(zhì)的中藥[3]。然而富含揮發(fā)油的藥材被證實(shí)具有抑制霉菌生長的作用,與其他中藥材混合儲存,可以提高其他中藥的防霉能力,為中藥防霉技術(shù)提供了新思路。從外部因素來看,光照、溫度、水活度、營養(yǎng)物質(zhì)、pH 值、氧化脅迫等環(huán)境因子都會對AFT 的合成產(chǎn)生影響[4]。
近年來,隨著人們對AFT 的不斷深入研究,為維護(hù)公眾健康,保障用藥安全,各國對中藥中AFT進(jìn)行了限量規(guī)定(表1)。
表1 各國藥典對中藥中的黃曲霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn) μg/kg
目前,儀器分析法和免疫學(xué)分析法是常用的AFT 檢測技術(shù)。儀器分析法包含高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法和表面增強(qiáng)拉曼散射法等,免疫學(xué)分析法有酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析技術(shù)和熒光免疫法等。然而,儀器分析法的樣品前處理繁瑣,儀器成本昂貴,且需要專業(yè)技術(shù)人員操作,難以滿足即時檢測要求;免疫分析法耗時耗財,且操作過程難以自動化。近年來,隨著科技的不斷創(chuàng)新和發(fā)展,膠體金免疫層析法、免疫芯片、免疫傳感器等大批新檢測技術(shù)層出不窮,這些新技術(shù)極大彌補(bǔ)了傳統(tǒng)技術(shù)在即時檢測和現(xiàn)場可視化等方面的短板,為中藥中AFT 現(xiàn)場快速可視化等檢測技術(shù)提供了有力支持。
薄層色譜法(TLC)是一種傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法,為最早應(yīng)用于測定AFT 的經(jīng)典方法之一。其原理是基于AFT 在紫外燈照射下具有熒光性,從而進(jìn)行定性定量分析。此技術(shù)操作簡便,成本低廉,但其前處理復(fù)雜,特異性差,靈敏度低,檢測耗時,不能滿足當(dāng)下檢測分析要求。
高效液相色譜法(HPLC)具有較高的檢測分離多種真菌毒素效能,成為檢測AFT 常用的方法之一。該技術(shù)原理是采用色譜柱分離技術(shù),根據(jù)待測物分離的不同實(shí)際情況,通過測量色譜峰面積進(jìn)行AFT 定量分析[6]。HPLC 法有多種衍生化方法,如柱前衍生、柱后光化學(xué)衍生及柱后碘衍生等。其中,柱后光化學(xué)衍生法的應(yīng)用較為廣泛。由于其不需添加衍生化試劑,可通過在線紫外線照射將無熒光性的AFB1和AFG1羥基化,使其具有熒光性,提高靈敏度,且不影響其他組分,進(jìn)而可通過熒光檢測器同時檢測4 種AFT 成分。例如,王云霞等[7]采用HPLC-柱后光化學(xué)衍生法檢測清火片(膠囊)中黃曲霉素G2、G1、B2、B1。該衍生化法還廣泛應(yīng)用于眾多的動植物藥材中,如蓮子、柏子仁等[8-9]。HPLC-柱后碘衍生法在檢測中藥材中AFT 也有應(yīng)用,如陳皮、三七粉等[10-11]。
液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)將液相色譜與質(zhì)譜有效結(jié)合,實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢互補(bǔ)[12],能快速、準(zhǔn)確地定性定量分析藥材中痕量的AFT。羅朝權(quán)等[13]建立了一種即時檢測動物類藥材污染AFB1和AFG1的液質(zhì)聯(lián)用法,應(yīng)用該法檢測分析發(fā)現(xiàn),土鱉蟲等動物類藥材受到黃曲霉菌嚴(yán)重污染。此外,隨著技術(shù)的不斷改進(jìn),研究者們從凈化方式和聯(lián)用儀器等方面入手,提出了更多優(yōu)化方案,如劉震營等[14]采用IAC-HPLC-ESI-MS/MS 法測定柏子仁中的AFT。
免疫檢測技術(shù)是抗原與抗體高度特異性識別的檢測方法[15],綠色無污染,在AFT 檢測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。以下歸納總結(jié)了中藥常用的AFT 免疫檢測技術(shù)。
2.4.1 酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)應(yīng)用抗原抗體的特異性反應(yīng)和酶的高度專一性、高效催化作用,進(jìn)而測定AFT 含量。該法可批量即時檢測樣本中的AFT,但在實(shí)際檢測中,很容易受到重金屬離子、脂肪及pH 等因素的干擾,可能會出現(xiàn)假陰/陽性結(jié)果,樣品中的氧化酶、蛋白酶自身具有不穩(wěn)定性,試劑保質(zhì)期短,這也可能會對檢測結(jié)果造成影響。劉蕊等[16]建立間接競爭ELISA 法快速檢測酸棗仁、柏子仁等6 味中藥材的AFs,并采用HPLC 法進(jìn)行結(jié)果確證,兩者的檢測結(jié)果一致,可用于快速檢測AFs。
2.4.2 膠體金免疫層析技術(shù) 膠體金免疫層析技術(shù)(GICT)是一種固相膜免疫分析方法,它將膠體金免疫技術(shù)與色譜層析技術(shù)相結(jié)合,具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn),結(jié)果判斷直觀可靠,無需大型儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員,適用于抽樣現(xiàn)場快速篩查[17]。但GICT 制備抗體成本昂貴,樣品提取效率較低,檢測結(jié)果重復(fù)性差,易出現(xiàn)假陽性結(jié)果,需要進(jìn)一步優(yōu)化。李細(xì)芬等[18]采用GICT 檢測酸棗仁等6 味中藥材中AFB1含量,其結(jié)果與ELISA 法測定結(jié)果一致,所檢測中藥飲片中AFB1含量均符合要求。
2.4.3 熒光免疫分析法 熒光免疫分析(FIA)結(jié)合了高靈敏度的熒光技術(shù)和高特異性的免疫學(xué)反應(yīng)。其原理是利用待測物在反應(yīng)體系中特定結(jié)合位點(diǎn)的熒光強(qiáng)度,通過定性或定量分析獲得檢測結(jié)果。根據(jù)熒光標(biāo)記材料的不同,可分為時間分辨熒光免疫分析法、熒光偏振免疫分析法和熒光激發(fā)共振能量轉(zhuǎn)移免疫分析法等[19]。該技術(shù)易實(shí)現(xiàn)高通量、自動化檢測,但抗體成本昂貴,儀器不便攜,不適合現(xiàn)場篩查。余宇燕等[20]建立了一種快速靈敏的直接競爭FIA 用于檢測陳皮、胖大海等5 味中藥中AFB1含量。結(jié)果表明,AFB1-FITC 標(biāo)記抗體的結(jié)合比率為4.19,可用于中藥中AFB1的分析測定。
2.4.4 化學(xué)發(fā)光免疫法 化學(xué)發(fā)光免疫法(CLIA)采用化學(xué)發(fā)光試劑標(biāo)記抗原或抗體,根據(jù)化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測待測物的信號強(qiáng)弱來確定其含量。根據(jù)標(biāo)記物的不同,可分為化學(xué)發(fā)光免疫分析法、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法和電化學(xué)發(fā)光免疫分析法。該技術(shù)無輻射、靈敏度高、線性范圍寬、方法快速穩(wěn)定、自動化程度高,標(biāo)記物有效期長且穩(wěn)定性好,但成本相對昂貴。吳震等[21]利用生物素親和及抗原與抗體免疫反應(yīng),建立了一種基于光激化學(xué)發(fā)光均相免疫檢測技術(shù)的AFB1檢測方法。
2.4.5 免疫傳感器 免疫傳感器由生物識別元件和信號轉(zhuǎn)換元件組成,結(jié)合了免疫檢測技術(shù)和生物傳感器技術(shù)。根據(jù)傳導(dǎo)信號的不同,可分為光學(xué)免疫傳感器、電化學(xué)免疫傳感器和壓電晶體免疫傳感器等[22]。該技術(shù)是一種具有廣泛發(fā)展前景的新型檢測技術(shù),其自動化程度高,不受樣品顏色、濁度的影響,可同時檢測多種真菌毒素[23]。Wu 等[24]采用以T7 核酸外切酶、脫氧核糖核酸為模板的銀納米簇,建立了用于檢測AFB1的銀納米簇?zé)晒馍飩鞲衅?,該方法檢測限可達(dá)0.89 pg/mL。
2.4.6 免疫芯片 免疫芯片是生命科學(xué)與微電子學(xué)等學(xué)科交叉發(fā)展而形成的新興前沿技術(shù)?;炯夹g(shù)環(huán)節(jié)包括芯片微陣列制備、樣品制備、生物分子反應(yīng)和信號的檢測與分析。根據(jù)其探針的不同,可分為基因芯片和蛋白芯片。該技術(shù)可進(jìn)行多參數(shù)同步分析,但其還處于開發(fā)初期,點(diǎn)樣器成本昂貴,且樣品極易發(fā)生交叉反應(yīng),因此免疫芯片的應(yīng)用范圍受限,還需深入研究[25]。
表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)法是一種新型的快速檢測技術(shù),其原理是樣品吸附在貴金屬粗糙表面時,拉曼光譜信號受表面等離子共振而增強(qiáng)。在對樣品進(jìn)行分析時,具有樣品非接觸、不破壞的特點(diǎn)[26],同時可增強(qiáng)拉曼信號來實(shí)現(xiàn)檢測極限的提高。該技術(shù)分辨率高、快速無損、設(shè)備攜帶方便,廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥[27]、食品安全[28]等諸多領(lǐng)域。然而,具有較強(qiáng)SERS 效應(yīng)的貴金屬種類極少,很難制備出重現(xiàn)性好、靈敏度高的基底,并且貴金屬增加了檢測成本,難以商業(yè)化?;诿庖叻ǖ腟ERS 傳感器可以在芯片上獨(dú)立檢測3 種真菌毒素[29]。在納米溶膠由濕態(tài)向干態(tài)轉(zhuǎn)化的過程中進(jìn)行實(shí)時SERS采集的技術(shù)稱為動態(tài)SERS(D-SERS),相較于常規(guī)SERS 信號,增加了2~3 個數(shù)量級?;诖?,任菲等[30]采用D-SERS 對薏苡仁中的AFG1進(jìn)行檢測。該方法采用擦拭法提取樣品表面的AFG1,以AuNP作為SERS 的增強(qiáng)基底進(jìn)行D-SERS 分析,其檢測限達(dá)到5.5 μg/kg。
目前,降解AFT 常用的脫毒技術(shù)有物理法、化學(xué)法和生物技術(shù)法。
物理降解脫毒技術(shù)是利用光、熱、輻射等方式破壞AFT 的毒性,主要有高溫加熱法、吸附法、輻射法和溶劑萃取法等。
3.1.1 高溫加熱法 高溫加熱可破壞大部分毒素,但AFT 的降解溫度高(280 ℃左右),并且高溫加熱同時也可能會破壞中藥材基質(zhì)結(jié)構(gòu),如蛋白質(zhì)、氨基酸等。因此高溫降解AFT 實(shí)際操作過程中存在較大困難,且能源消耗大,一般不宜采用。
3.1.2 吸附劑吸附法 吸附劑一般有活性炭、蒙脫石、沸石粉等。Martinez 等[31]研究表明活性炭能夠有效吸附赭曲霉素和AFT,真菌濃度在所有實(shí)驗對象中均下降。此法可吸附大部分毒素,成本低廉,但目前沒有最高效的吸附劑,有待進(jìn)一步研究。
3.1.3 輻射法 常用的輻射有γ 射線、紫外線、紅外線、電子束等。其中,γ 射線照射和紫外線技術(shù)的降毒效果顯著[32]。Nurtjahja 等[33]研究表明,肉豆蔻中黃曲霉菌種群總數(shù)及菌株活力隨 γ 輻射劑量增加而下降。此外,Patras 等[34]研究發(fā)現(xiàn),紫外線照射可顯著降低純水中的AFT(P<0.05),并且增加紫外線劑量可降低細(xì)胞中AFT 引起的細(xì)胞毒性。但輻照耗能高,會對操作人員帶來潛在身體傷害,因此實(shí)際應(yīng)用中受阻。
3.1.4 溶劑萃取法 萃取溶劑有乙醇、乙腈-水、水溶性丙酮等溶液。陳建茹等[35]研究對比了75%乙醇與水對柏子仁中AFT 的脫毒效果,結(jié)果表明,75%乙醇更佳,但仍無法達(dá)到完全脫毒,且脫毒后的樣品可能仍不符合法定限量標(biāo)準(zhǔn)。該法既無副產(chǎn)物產(chǎn)生,也不會破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),但要求精確的樣品和溶劑的比例,萃取溶劑成本高且廢液處理繁瑣,因此在一定程度上限制了其應(yīng)用。
化學(xué)法是指采用化學(xué)試劑處理與生物毒素發(fā)生化學(xué)反應(yīng),破壞其化學(xué)結(jié)構(gòu),從而降低或消除其毒性。傳統(tǒng)化學(xué)試劑雖然能有效降解AFT,但同時可能存在化學(xué)殘留會污染環(huán)境或影響藥材化學(xué)成分。
3.2.1 堿處理法 羅小榮等[36]研究表明,1%碳酸氫銨溶液+2%~5%氨水清洗蓮子,AFT 下降趨勢明顯,去除率可達(dá)90%以上。此法操作難度低,成本低廉,是一種適合于工業(yè)化大生產(chǎn)的清洗方法。
3.2.2 氧化處理法 氧化劑通過氧化分解AFB1末端的呋喃環(huán),從而降低毒性,常用的氧化試劑有ClO2、H2O2、O3、Cl2等。Yu 等[37]研究發(fā)現(xiàn),ClO2氣體可以抑制黃曲霉菌菌絲生長、孢子萌發(fā)和產(chǎn)生AFB1。AFB1的降解率隨著ClO2濃度的增加而提高,而且AFB1的降解速度明顯加快。但該法同樣面臨化學(xué)殘留問題而限制了其應(yīng)用。
3.2.3 天然精油法 天然精油可有效抑制黃曲霉菌生長和其毒素合成[38]。李紅玲,高微微[39]將揮發(fā)油直接混合于種子中、涂于表面、填充于包裝中,發(fā)現(xiàn)一定劑量的何首烏揮發(fā)油具有抑菌效果。天然精油提取自中藥,綠色無污染,且能夠充分利用藥材有效成分。這為藥對養(yǎng)護(hù)提供了新思路,將易霉變中藥與富含抗菌抑菌成分的藥材按照合理的比例混合貯藏,在一定程度上可以避免藥材霉變。但揮發(fā)油含量較低,成分復(fù)雜,使用難度大,成本昂貴。
生物脫毒法主要是利用微生物或其代謝產(chǎn)物進(jìn)行脫毒,具有效率高、特異性強(qiáng)、綠色無污染的優(yōu)勢,且處理條件相對溫和,不會破壞藥材品質(zhì),因此成為最近研究熱點(diǎn)之一。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌、真菌及酵母菌等都具有降解AFT 能力[40],該法包括生物酶解法、生物吸附法等[41]。
3.3.1 生物酶解法 生物酶解法是利用專一性和高效性的某些酶分解毒素分子的功能性基團(tuán),將AFT 降解為低毒或無毒化合物。目前,酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌等微生物已經(jīng)被證實(shí)對黃曲霉菌具有顯著的抑制效果[42]。黃曲霉毒素解毒酶和葡萄糖氧化酶等酶制劑也逐漸被用于AFT 的脫毒[41]。
3.3.2 生物吸附法 生物吸附法是利用微生物與AFT結(jié)合,形成菌體-AFT 復(fù)合體,達(dá)到脫毒目的。研究發(fā)現(xiàn),酵母菌、乳酸菌和雙歧桿菌可通過細(xì)胞壁吸附作用去除AFT,其吸附能力與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)[43]。該法綠色環(huán)保,但吸附過程低效且可逆,并不能從本質(zhì)上脫去毒性,因此高效可行的生物吸附劑有待進(jìn)一步研究。
中藥中AFT 污染問題成為制約中藥國際化的關(guān)鍵因素之一。國內(nèi)在這一領(lǐng)域的研究從未停止過,但AFT 含量超標(biāo)事件仍經(jīng)常發(fā)生。因此,中藥中AFT 檢測及脫毒技術(shù)將成為當(dāng)前及今后的一個研究熱點(diǎn)。目前應(yīng)用的AFT 檢測技術(shù)中,儀器分析法具有靈敏度高、檢測結(jié)果精確的優(yōu)點(diǎn),但仍有待解決的問題,如:樣本前處理復(fù)雜、對儀器及專業(yè)技術(shù)人員要求高、難以滿足即時檢測等;免疫學(xué)檢測方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、方便快捷的特點(diǎn),適用于現(xiàn)場快速檢測。在未來研究中,開發(fā)出更靈敏、更快速、更經(jīng)濟(jì)的檢測技術(shù)成為新的趨勢和挑戰(zhàn)。在AFT 降解脫毒技術(shù)研究領(lǐng)域,與傳統(tǒng)的物理或化學(xué)降解方法相比,生物降解技術(shù)去除AFT 具有安全、高效、環(huán)保、無毒無害等優(yōu)點(diǎn),是未來研究AFT 防治的發(fā)展方向。因此,只有確?,F(xiàn)有中藥中AFT 檢測和解毒技術(shù)與時俱進(jìn),才能保障用藥安全有效,推動中藥現(xiàn)代化、國際化進(jìn)程。