李文建,韓宵林,李芳菲,李蕾蕾,武振江,劉瑞芳,謝朝暉

(河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467036)

建蘭的繁殖方式主要有3種，分別為種子繁殖、分株繁殖和組織培養(yǎng)。種子繁殖常敗育，繁殖系數(shù)和培養(yǎng)效率均較低。分株繁殖需母株長至一定程度及大量前期芽體培育方可實(shí)現(xiàn)，不易實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。傳統(tǒng)雜交育種周期長，且成功率較低，不利于實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。而組織培養(yǎng)能夠有效應(yīng)對以上難題，在園藝植物生產(chǎn)中應(yīng)用越來越廣泛[1-2]。

近年來，關(guān)于國蘭組織培養(yǎng)再生快繁的研究報(bào)道很多。許申平等[3]以成熟墨蘭種子誘導(dǎo)根狀莖為材料，研究其根狀莖增殖、芽分化及生根等不同階段的誘導(dǎo)情況。付秀芹等[4]以蕙蘭種子、根狀莖及無菌苗為試材，對種子萌發(fā)、根狀莖增殖及其分化等階段的適宜培養(yǎng)基進(jìn)行研究，并探討了無菌苗的移栽基質(zhì)，初步優(yōu)化建立了蕙蘭組培的快繁體系。孫玉芬等[5]以春蘭與大花蕙蘭雜交后代根狀莖為材料進(jìn)行培養(yǎng)，篩選適合根狀莖增殖與分化的條件，研究比較不同基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和有機(jī)添加物等對根狀莖增殖與分化的影響。李玉萍等[6]以春蘭與大花蕙蘭雜交種原球莖和無根幼苗為材料，研究激素對原球莖分化的影響以及激素與香蕉泥對誘導(dǎo)生根狀況的影響。

而關(guān)于建蘭組織培養(yǎng)再生快繁的研究報(bào)道較少。賈勇炯等[7]以建蘭腋芽為外植體，用B5和MS為基本培養(yǎng)基，優(yōu)化激素條件，成功地誘導(dǎo)了簇生原球莖、假根莖及其分化的營養(yǎng)芽和花芽；通過連續(xù)光照，花芽可在試管內(nèi)開花；并探討了椰乳對原球莖誘導(dǎo)的正向作用以及活性炭對防止褐化、促進(jìn)根系生長等方面的影響。賈勇炯等[8]以彩心建蘭花芽為材料，選取幼嫩花枝上部莖節(jié)切段，用MS為基本培養(yǎng)基，通過器官發(fā)生直接分化出了花芽和營養(yǎng)芽。葉秀仙等[9]以素心建蘭種子為外植體，研究不同的培養(yǎng)基(1/2MS、花寶1號、改良MS)和激素(6-BA、TDZ、NAA)等關(guān)鍵因子對種子萌發(fā)、根狀莖增殖、分化等階段的影響，研探了素心建蘭無菌播種快繁關(guān)鍵技術(shù)。李承秀等[10]用正交試驗(yàn)研究基本培養(yǎng)基、激素用量以及不同附加物對瓶苗誘導(dǎo)根分化生長的影響，通過無菌播種培養(yǎng)獲得了原球莖，優(yōu)化生根培養(yǎng)基，并以水苔為基質(zhì)完成了煉苗試驗(yàn)。

本文從基本培養(yǎng)基和植物激素組合處理等方面，查閱相關(guān)研究文獻(xiàn)，開展建蘭再生體系培養(yǎng)基激素條件優(yōu)化，篩選建蘭不同培養(yǎng)階段所需的最佳培養(yǎng)基配方，為建蘭組織培養(yǎng)快繁技術(shù)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

建蘭植株品種為“龍福星蝶”，取材時正值盛花期，研究所需花芽、莖尖組織較為充足。本研究所用建蘭植株均源于同一植株及其芽分化子代，減少生理活性差異引起的組織脫分化與再分化速率不同步效應(yīng)。

基本培養(yǎng)基組成：MS培養(yǎng)基+蔗糖(30 g/L)+瓊脂粉(6 g/L)。

1.2 外植體獲取、預(yù)處理及消毒

本研究用建蘭花莖和莖尖作為試驗(yàn)材料。

(1)花莖：取建蘭幼嫩花莖，長度約為3～7 cm，用自來水沖洗，通過無菌操作剝?nèi)ネ鈱影~，將所取花莖切成多個小段，長度約1～3 cm，每個切段帶一莖節(jié)。

(2)莖尖：取葉片未展開的健壯新芽，自來水下沖洗，通過無菌操作剝?nèi)ネ鈱尤~片，切除莖尖基部傷口褐變部分，切取頂端新芽，長度約2～5 mm。

(3)材料消毒：以上2種材料經(jīng)預(yù)處理，再依照設(shè)計(jì)用量放入無菌小燒杯，在超凈工作臺上進(jìn)行如下操作：75 %酒精浸泡15 s，再用0.05%的升汞消毒7 min，最后用無菌水沖洗4～5次。

1.3 接種培養(yǎng)

(1)原球莖誘導(dǎo)：用2種材料進(jìn)行起始培養(yǎng)，每處理外植體接種個數(shù)120個，每瓶接種6個，共接種20瓶，分別于30 d、40 d及50 d觀察其誘導(dǎo)分化情況。

(2)不定芽誘導(dǎo)：上步獲得的培養(yǎng)材料，每處理接種個數(shù)為12個，每瓶接種4個，共接種3瓶，分別于20 d、30 d及40 d觀察其不定芽誘導(dǎo)情況。

(3)生根誘導(dǎo)：每處理接種12個，每瓶接種4個，共接種3瓶，分別于10 d、15 d及20 d觀察其生根誘導(dǎo)情況。

1.4 不同培養(yǎng)基對建蘭不同再生階段誘導(dǎo)效果的影響

針對建蘭組織培養(yǎng)不同再生階段，并結(jié)合不同培養(yǎng)階段處理數(shù)，進(jìn)行培養(yǎng)基及激素條件的配比組合設(shè)計(jì)[1,2,7-10](表1)。

表1 建蘭再生不同培養(yǎng)階段不同激素濃度培養(yǎng)基組成

1.5 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件主要是溫度和光照控制。其中溫度：白天(25±2) ℃，夜間(20±2) ℃；而光照條件為14 h/d。

2 結(jié)果與分析

2.1 原球莖誘導(dǎo)

分別將建蘭莖尖和花莖(帶節(jié))外植體材料接種于1～6號培養(yǎng)基，篩選原球莖最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 建蘭原球莖誘導(dǎo)

從表2可知，在6種培養(yǎng)基中，莖尖組織原球莖誘導(dǎo)率從高到低依次為1號、2號、3號、5號、4號、6號，而花莖組織誘導(dǎo)率從高到低依次為2號、1號、5號、3號、4號、6號。故1、2號培養(yǎng)基誘導(dǎo)2種組織的原球莖更為適宜，其中1號培養(yǎng)基來培養(yǎng)建蘭莖尖組織獲得了最高誘導(dǎo)率(85%)，即1號培養(yǎng)基可作為建蘭原球莖最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

在6種培養(yǎng)基中，莖尖組織原球莖誘導(dǎo)率平均為61%，而花莖組織誘導(dǎo)率平均為51%，故建蘭莖尖比花莖更適合作為原球莖誘導(dǎo)的試驗(yàn)材料。

2.2 不定芽誘導(dǎo)

用1號培養(yǎng)基莖尖組織誘導(dǎo)獲得的原球莖材料，開展不定芽誘導(dǎo)試驗(yàn)，篩選不定芽最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 建蘭不定芽誘導(dǎo)

由表3可知：隨著培養(yǎng)時間的延長，4種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)出較多的莖芽，并展現(xiàn)出較好的生長誘導(dǎo)效果；40 d時，9號培養(yǎng)基增殖倍數(shù)(3.67)最低，不定芽誘導(dǎo)效率較低，而8號培養(yǎng)基增殖倍數(shù)為4.67，獲得了最高的不定芽誘導(dǎo)效率；故8號培養(yǎng)基可作為建蘭不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。

2.3 生根誘導(dǎo)

用8號培養(yǎng)基獲得的建蘭不定芽，進(jìn)行建蘭生根培養(yǎng)，篩選適宜的生根培養(yǎng)基，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 建蘭生根誘導(dǎo)

由表4可知：4種培養(yǎng)基生根誘導(dǎo)率均高于90%，表明4種培養(yǎng)基均具有很好的出根誘導(dǎo)效率，其中11～13號3種培養(yǎng)基出根率均達(dá)到100%；在11～14號培養(yǎng)基中，12號培養(yǎng)基于第15 d即達(dá)100%誘導(dǎo)率，可作為最適宜用于建蘭生根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

(1)與花莖組織材料相比，建蘭莖尖組織更適宜作為原球莖誘導(dǎo)的試驗(yàn)材料；

(2)針對不同培養(yǎng)階段培養(yǎng)物誘導(dǎo)效果方面，原球莖誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基是1號培養(yǎng)基，不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為8號培養(yǎng)基，而生根誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為12號培養(yǎng)基。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于建蘭花莖，莖尖更具發(fā)育活性，在提供的不同培養(yǎng)基上，原球莖誘導(dǎo)率及增殖效率均有相應(yīng)提高[7-8]。不同激素種類及濃度的培養(yǎng)基對組織培養(yǎng)再生有重要的影響，適宜的激素種類組合及濃度比例能夠有效地促進(jìn)原球莖、不定芽與根的分化發(fā)育[9-11]。

3.2 討論

建蘭組培相關(guān)文獻(xiàn)鮮有報(bào)道，精摘幾篇結(jié)合本研究結(jié)果展開討論。

劉翠華等[12]以建蘭小桃紅品種根狀莖為外植體，研究激素對根狀莖增殖、分化和生根的影響，結(jié)果表明：根狀莖增殖最佳培養(yǎng)基是MS+6-BA 0.5 mg/L，根狀莖分化最佳培養(yǎng)基MS+NAA 0.6 mg/L+TDA 1.0 mg/L，分化率為93.1%；生根最佳培養(yǎng)基1/2MS+NAA 1.0 mg/L+AC 0.05%。其根狀莖分化率與本研究原球莖分化率均較高，顯示兩者雖然來源于不同品種及不同器官部位的外植體材料，均有很好的再分化能力，再生較為容易。其生根率為96.3%，表明生根容易，與本研究結(jié)果一致。

葉秀仙等[9]關(guān)于建蘭無菌苗的快繁技術(shù)研究，王濟(jì)紅等[13]關(guān)于建蘭新品種黃金小神童組培育苗的集成技術(shù)優(yōu)化研究，均突顯了TDZ激素在根狀莖增殖等階段的重要作用。而本研究結(jié)果顯示，建蘭組培再生過程各階段的優(yōu)化培養(yǎng)基可不必添加TDZ激素，僅使用6-BA和NAA 2個激素組合并優(yōu)化其配比濃度即可達(dá)到較好的誘導(dǎo)效果。

李麗等[14]以線藝建蘭莖尖、腋芽為外植體，研究得出原球莖誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3 mg/L，并長成根狀莖。根狀莖分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0mg/L+PP333 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L，分化率達(dá)46.3%。生根培養(yǎng)基為MS+IBA 1.0mg/L+GA 0.5mg/L+香蕉泥100 g/L，生根率達(dá)100%。其以上幾個階段優(yōu)選培養(yǎng)基激素濃度與本研究結(jié)果較為接近，其中再分化效果不如本研究結(jié)果，而生根效果與本研究十分吻合。本研究未涉及植物生長調(diào)節(jié)劑PP333與GA的使用，也未設(shè)計(jì)添加香蕉泥、椰汁等天然的有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)，各階段培養(yǎng)物誘導(dǎo)與生長狀態(tài)均較為良好，可作為以后進(jìn)一步深化探索研究的參考內(nèi)容。