龍雨躍，李國樹、2* ，徐成東、2，趙仁升，李文榮

(1.楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，云南 楚雄 675000;2.滇中高原生物資源開發(fā)與利用研究所，云南 楚雄 675000)

大花蕙蘭 (Cymbidium hybridum)是蘭科蘭屬的多年生草本植物，其花葶長、花序大、花色豐富、花期長，花期多集中在春節(jié)前后［1］，已經(jīng)成為我國主要的年宵花之一。

大花蕙蘭的繁育有種子繁殖、分株繁殖和組織培養(yǎng)三種。由于大花蕙蘭多為雜交品種，種子繁殖無法保持其品種特性，結(jié)實(shí)率低，很難進(jìn)行種子繁殖;大花蕙蘭的分株能力弱、繁殖速度慢、系數(shù)低;因此多采用組織培養(yǎng)加快繁殖速度。而在大花蕙蘭的組培快繁中最為關(guān)鍵的就是原球莖(Protocorm－Like body簡稱PLB)的誘導(dǎo)過程，大多數(shù)研究者主要是通過莖尖和側(cè)芽來誘導(dǎo)大花蕙蘭的原球莖［2—6］但其操作過程復(fù)雜、污染率高、褐化死亡嚴(yán)重。因此該研究采用大花蕙蘭無菌苗莖段切塊來誘導(dǎo)原球莖，并對(duì)原球莖增殖進(jìn)行研究，為大花蕙蘭無菌快繁提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大花蕙蘭無菌苗由楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系植物組織培養(yǎng)室提供，供試品種為HERO。

1.2 原球莖誘導(dǎo)方法優(yōu)化

1.2.1 原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制

以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加瓊脂10g/L，蔗糖15g/L，活性炭1.5g/L(pH=5.8)，通過調(diào)節(jié)不同濃度的6－BA和2，4－D來篩選誘導(dǎo)培養(yǎng)基。6－BA和2，4－D濃度配比見表1－1。

表1 —1 原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素配比

1.2.2 外植體的選擇與處理

取生長約7月、株高約7cm，生長健壯的大花蕙蘭無菌苗，品種為HERO。在無菌條件下剪除根、葉、芽，只保留長約0.8cm的莖段，并將莖段切成長約0.4cm的小段后接種于各組培養(yǎng)基中。每瓶接種3段，每組接10瓶。培養(yǎng)觀察，40天后對(duì)誘導(dǎo)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)條件

接種后黑暗誘導(dǎo)30d后放于光照強(qiáng)度2500LX，光照時(shí)間12h/d;培養(yǎng)溫度:27±2℃;相對(duì)濕度60%～80%的培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 原球莖增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.3.1 原球莖的處理

將桑椹狀的原球莖隨即切割成約8mm3的切塊接種在不同的培養(yǎng)基上，每組10瓶，每瓶5－6塊，每組重復(fù)3次試驗(yàn)。培養(yǎng)觀察，40天后對(duì)增殖情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.2 原球莖增殖培養(yǎng)基的配制

以1/2MS和MS兩種培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加瓊脂10g/L，蔗糖10g/L，活性炭1.5g/L，香蕉泥100g/L(PH=5.8)，通過調(diào)節(jié)不同濃度6－BA和NAA來篩選增殖培養(yǎng)基。具體組合見表1－2。

表1 —2 原球莖增殖培養(yǎng)基

1.3.3 原球莖增殖培養(yǎng)條件

接種后放于光照強(qiáng)度2500LX，光照時(shí)間12h/d;培養(yǎng)溫度:27±2℃;相對(duì)濕度:60%～80%下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 原球莖增殖最佳切割方式研究

以增殖最優(yōu)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。將原球莖采用隨機(jī)切割、縱切，橫切、碾壓四種方法進(jìn)行處理。每瓶5－6塊，每組10瓶，每組重復(fù)3次試驗(yàn)。接種后放于光照強(qiáng)度2500LX，光照時(shí)間12h/d，溫度27±2℃;相對(duì)濕度60% ～80%下繼續(xù)培養(yǎng)。40天后對(duì)增殖情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 數(shù)據(jù)計(jì)算方法［7，8］

PLB誘導(dǎo)率FOI(frequency ofinducement)=每組發(fā)生PLB的外植體數(shù)總數(shù)/每組接種外植體數(shù)總數(shù)×100%

原球莖增殖倍數(shù) =每組新長出的原球莖總數(shù)/每組所消耗的原球莖總數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 原球莖誘導(dǎo)優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 外植體傷口處是原球莖的形成和增殖的主要部位

外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上10d后在切口邊緣開始長出直徑約1mm乳白色的球狀顆粒，有的形成單個(gè)球體，有的多個(gè)球體構(gòu)成桑狀體，即原球莖，用鑷子輕輕撥動(dòng)即可使其與莖段切塊分離。15d后，外植體莖段的切口處就陸續(xù)長出原球莖，且每組均能長出原球莖，原球莖有單體原球莖和桑狀原球莖兩種。30d后將誘導(dǎo)出的原球莖放在照強(qiáng)度2500LX、光照時(shí)間12h/d，培養(yǎng)溫度27±2℃，相對(duì)濕度60% ～80%的培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)，原球莖陸續(xù)有白色轉(zhuǎn)為淺綠。40d以后單體原球莖開始分化成苗，而桑狀原球莖繼續(xù)增殖略有分化。在進(jìn)行原球莖增殖過程中發(fā)現(xiàn):原球莖的形成主要是從外植體的傷口處開始生長，并實(shí)現(xiàn)增殖，因此，外植體傷口處是原球莖的形成和增殖的主要部位。其原球莖的形成和增殖過程見圖2—1。

圖2 —1 莖段外植體誘導(dǎo)出原球莖的過程圖

2.1.2 不同激素組合對(duì)外植體莖段誘導(dǎo)原球莖的結(jié)果

外植體接種后放于暗培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)，10d后在切口邊緣開始長出乳白色的球狀顆粒，有的形成單個(gè)球體，有的多個(gè)球體構(gòu)成桑狀體，即原球莖;30d后將暗培養(yǎng)的材料放入光照強(qiáng)度2500LX、光照時(shí)間12h/d，培養(yǎng)溫度27±2℃，相對(duì)濕度60% ～80%的培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)。40d后對(duì)誘導(dǎo)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見下表:

表2 —1 不同激素組合對(duì)外植體莖段誘導(dǎo)原球莖的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

從表2－1可知:反映了6－BA和2，4－D不同組合之間的平均誘導(dǎo)率。從原球莖平均誘導(dǎo)率來看第5組的誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率高達(dá)77.78%(即:1/2MS+6－BA 8.0 mg/L+2，4－D 0.2 mg/L+蔗糖15g/L+活性炭1.5g/L);第2組的誘導(dǎo)效果最差，誘導(dǎo)率僅為11.11%。從誘導(dǎo)的原球莖生長狀況上看:外植體誘導(dǎo)出原球莖的數(shù)量和質(zhì)量與6－BA，2，4－D比值關(guān)系較大，6－BA和2，4－D比值越大，原球莖就趨向于淺綠色且原球莖小而多、成塊狀;6－BA和2，4－D比值越小，原球莖就趨向于濃綠色且原球莖大而少，分化生根。總體上看6－BA為8.0mg和2，4－D為0.2mg時(shí)的誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率高達(dá)77.78%，且誘導(dǎo)出的原球莖為深綠色、小而多、質(zhì)地疏松、誘導(dǎo)和生長最好。

2.2 原球莖增殖優(yōu)化結(jié)果

將桑椹狀的原球莖隨即切割成綠豆大小的切塊后接種于原球莖增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，40天后統(tǒng)計(jì)、分析增殖結(jié)果。結(jié)果見表2—2。

表2 —2 不同培養(yǎng)基和激素配比對(duì)原球莖增殖結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

從表2－2可知:不同培養(yǎng)基及不同激素配比對(duì)原球莖的增殖影響不同，從平均增殖倍數(shù)上看，第2組的增殖倍數(shù)最低為2.03，第7組的增殖倍數(shù)最高為5.46，即在MS+BA(6.0mg/L)+NAA(0.2mg/L)增殖倍數(shù)最高。從原球莖的生長情況來看，生長最差的是第2組，生長最好的是第7組和第5組。從原球莖的增殖倍數(shù)和生長效果來說:MS+6－BA6.0mg/L+NAA0.2mg/L+瓊脂10g/L+蔗糖10g/L+活性炭1.5g/L+香蕉泥100g/L(PH=5.8)培養(yǎng)基上原球莖增殖效果最佳，平均增殖倍數(shù)為5.46，增殖后生長情況最好。

3 討論

大花蕙蘭無菌莖段是誘導(dǎo)原球莖的較好材料，與常規(guī)的利用莖尖和側(cè)芽誘導(dǎo)相比，它具有操作簡單、褐變率低、誘導(dǎo)率高、增殖速度快等優(yōu)點(diǎn)。本次試驗(yàn)以株高約7cm的生長健壯的無菌苗莖段進(jìn)行原球莖誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):外植體傷口處是原球莖的形成和增殖的主要部位;在1/2MS+6－BA8.0mg/L+2，4－D0.2mg/L+蔗糖10g/L+活性炭1.5g的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)原球莖效果最佳，誘導(dǎo)率高達(dá)77.78%，且誘導(dǎo)出的原球莖為深綠色、大小均勻、質(zhì)地疏松，誘導(dǎo)和生長效果最好。

在一定范圍內(nèi)，6－BA，2，4－D比值影響著外植體誘導(dǎo)原球莖的誘導(dǎo)率、增殖倍數(shù)。在試驗(yàn)研究中，外植體誘導(dǎo)出原球莖的數(shù)量和質(zhì)量與6－BA，2，4－D比值關(guān)系較大，6－BA和2，4－D比值越大，原球莖就趨向于淺綠色且原球莖小而多、成塊狀;6－BA和2，4－D比值越小，原球莖就趨向于濃綠色且原球莖大而少，分化生根。較高的6－BA有利于原球莖誘導(dǎo)，但是當(dāng)6－BA高到10mg時(shí)，原球莖的誘導(dǎo)率開始下降;而較低2，4－D利于無菌苗莖段誘導(dǎo)原球莖。從總體上看:6－BA為8.0mg和2，4－D為0.2mg時(shí)的誘導(dǎo)效果最好，原球莖為深綠色、大小均勻、質(zhì)地疏松、生長最好;但從增殖效果看:6－BA為6.0 mg時(shí)，增殖倍數(shù)為5.46倍，增殖效果最佳，原球莖生長最好。

［1］謝為龍，譚群英，王愛萍.影響大花蕙蘭試管苗培育因素的研究 ［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，12(02):231—234.

［2］吳開云，黃敏仁，王明庥.大花蕙蘭幼苗葉片誘導(dǎo)類原球莖 ［J］.分子植物育種學(xué)，2007，5(03):341—346.

［3］楊玉珍，孫天洲，孫廷，等.大花蕙蘭組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)研究 ［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，24(02):86—88.

［4］常美花.大花蕙蘭組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展及應(yīng)用 ［J］.北方園藝，2011， (07):41—46.

［5］魏琴，曾頓洪，王麗，等.大花蕙蘭原球莖一步成苗快速繁殖研究 ［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(35):11392—11393.

［6］馬華升，王偉科，王佳，等.培養(yǎng)基、激素和添加物對(duì)大花蕙蘭原球莖誘導(dǎo)增殖的影響 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，(06):452—456.

［7］胡恒康，高永根，張啟香.大花蕙蘭原球莖的誘導(dǎo)、增殖及其解剖結(jié)構(gòu)研究 ［J］，金陵科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，21(04):85—87.

［8］李杰，黃敏仁，王明庥，等.植物外源激素對(duì)大花蕙蘭體胚發(fā)生影響的研究［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27(04):65—68.