路梅， 劉建峰， 鄭熊飛， 劉永立， 胡海濤*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004； 2.武義縣俞源鄉(xiāng)人民政府，浙江 金華 321200；3.浙江大學(xué) 新農(nóng)村發(fā)展研究院，浙江 杭州 310058)

金線蓮(Anoectochilusroxburghii)系蘭科開唇蘭屬名貴草本藥材，又名金線蘭、金絲草、金不換等。金線蓮具有很高的藥用價值，在民間素有“藥王”“烏人參”“金草”“神藥”等美稱[1]。金線蓮種子自然萌發(fā)率很低，對生長環(huán)境要求高，加之人類過度采挖，致使野生資源瀕臨滅絕，導(dǎo)致金線蓮藥源供需矛盾非常突出[2]。人工栽培是解決金線蓮供需緊張的唯一途徑，但是金線蓮人工栽培過程中易感染病蟲害，影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。金線蓮莖腐病是金線蓮人工栽培中一種主要病害，該病原菌可以從金線蓮的根莖、根毛和表皮入侵到其莖基部，對不同生長時期的金線蓮皆可造成不同程度的病害，發(fā)病時植株莖部先出現(xiàn)黃褐色水漬狀的病斑，擴大到能繞著莖部一圈，發(fā)病部分腐爛成線狀[3]。

金線蓮莖腐病對金線蓮危害極大，且發(fā)生普遍，嚴(yán)重制約了金線蓮產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。目前，金線蓮莖腐病主要采用化學(xué)農(nóng)藥防控，但該病原菌在金線蓮不同生長期皆可造成病害，噴施農(nóng)藥時間點很難把控，防治效果不理想，而且也易導(dǎo)致農(nóng)藥殘留和中藥的食用安全[4-5]。有益微生物介導(dǎo)的生物防治具有安全、持久、有效和對人畜無害等特點，已成為植物病害防治的重要方向[6-7]。篩選有益菌防治植物病害報道已有很多[8-10]，而關(guān)于金線蓮莖腐病病原拮抗菌篩選鑒定的研究鮮見報道。本研究采用平板對峙法對3種商業(yè)化的生防菌和1株從百合鱗片中分離得到的非致病性尖孢鐮刀菌進行篩選，以期獲得具有高效拮抗金線蓮莖腐病病原菌的生防菌株，為金線蓮莖腐病的生物防治提供菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

金線蓮正常植株為本實驗室快繁栽培的尖葉金線蓮品種，患莖腐病植株取自金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)院種植基地發(fā)病的尖葉金線蓮。拮抗實驗的供試菌株為從哈茨木霉、放線菌、綠色木霉等商品化的生防菌中分離純化獲得的菌株，所有真菌菌種均接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)試管斜面上于4 ℃冰箱保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，瓊脂15～20 g·L-1。

1.2 金線蓮莖腐病致病菌的分離與純化

本實驗采用組織分離法進行金線蓮莖腐病致病菌的分離。取金線蓮莖腐病患病植株，先用清水洗凈表面雜質(zhì)，再放入75%乙醇溶液對組織表面消毒1 min，然后用0.1% HgCl2消毒5 min，最后無菌水清洗3遍，用無菌濾紙吸干表面水分。切取莖部的病健交界處組織，置于PDA上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基上出現(xiàn)菌落時，用無菌接種環(huán)挑取菌落邊緣的菌絲轉(zhuǎn)新于新的PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，獲得初步純化培養(yǎng)的菌落。將純培養(yǎng)后的菌株，接種于PDA試管斜面培養(yǎng)好后，在4 ℃冰箱中保存。

1.3 金線蓮莖腐病致病菌的形態(tài)學(xué)鑒定及致病性檢測

將純化的致病菌接種于PDA培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后，觀察菌落形態(tài)以及用無菌接種環(huán)挑取菌落鏡檢，觀察菌絲、孢子形態(tài)。

致病性的檢測采用針刺接種法。選取健康金線蓮的同一莖位莖段，用微量加樣槍的針頭刺破表皮，于針刺點上接種直徑為2 mm的疑似病原菌的菌絲塊，同時接種同樣直徑的空白培養(yǎng)基為對照。每個處理各接種20株植株，接種處理完后共同置于28 ℃環(huán)境中，控制好溫濕度，保證發(fā)病條件，3 d后觀察且記錄發(fā)病情況。

1.4 金線蓮莖腐病致病菌的分子鑒定

采用真菌全基因組DNA提取試劑盒提取分離致病菌的DNA，以真菌ITS序列通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對菌株的DNA進行擴增。PCR反應(yīng)體系41 μL，其組分如下：4 μL模板DNA，20 μL 10×KOD Buffer，8 μL dNTP，1 μL KOD聚合酶，引物ITS1和ITS4各4 μL。擴增條件：94 ℃，4 min預(yù)變性；98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，35次循環(huán)；68 ℃延伸10 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL擴增的產(chǎn)物，進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物送到杭州尚亞生物技術(shù)服務(wù)有限公司進行基因測序。獲得基因序列后，對菌株的rDNA-ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中與已知序列進行對比，并進行同源性分析。結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)觀察以及致病性檢測，最后確定致病菌的種類。

1.5 金線蓮莖腐病致病菌拮抗菌的篩選

采用對峙實驗法篩選對金線蓮莖腐病的致病菌有抑制作用的拮抗菌株，即在距離平板中央30 mm處接種致病菌菌絲塊，同樣在距離平板中央30 mm的致病菌對側(cè)處接種供試菌株(哈茨木霉、放線菌和綠色木霉，對照組接種無菌的PDA培養(yǎng)基)，每個實驗分別設(shè)置3個平行組，觀察是否有抑菌作用以及強弱。在PDA平板上分別測量空白對照組的致病菌菌落直徑和實驗組的致病菌菌落直徑。測量到的菌落直徑大小，參照以下公式計算抑菌率。抑菌率=(對照菌落直徑-實驗菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀的調(diào)查

調(diào)查發(fā)現(xiàn)金線蓮莖腐病是一種易在夏季高溫高濕的環(huán)境中發(fā)生的金線蓮病害。金線蓮莖腐病癥狀為莖稈基部或中部呈水漬狀的病斑，后變黃干枯縊縮成褐腐爛線狀(圖1箭頭)，基部葉片變黃化、萎蔫下垂、變褐等癥狀，嚴(yán)重的開始脫落、皺縮，最后整株黃化枯萎。此病是土壤傳染性的病害，其程度和土壤中可侵染的病原菌量密切相關(guān)，致病菌也可通過肥料、澆水等途徑傳播。

圖1 金線蓮患病植株和健康植株

2.2 金線蓮莖腐病致病菌的鑒定

2.2.1 致病菌形態(tài)學(xué)觀察

在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察其菌落外貌，致病菌在平板上長出很多棉絮狀的菌絲，且能在培養(yǎng)基中分泌出紫色的物質(zhì)(圖2中A)。鏡檢顯示，菌絲具有隔膜及分枝；小型分生孢子數(shù)量較多，呈卵形、長圓形或腎形，無色透明，大小為(4.5～10.6)μm×(2.2～3.3)μm；大型分生孢子數(shù)量較少，呈鐮刀狀(圖2中C)，大小為(20.5～42.3)μm×(3.0～4.8)μm，多具3個隔膜，頂細胞漸尖或呈鈍型；厚垣孢子部分由大孢子部分細胞膨大形成，部分在菌絲側(cè)枝長出，壁光滑或有突起，多呈球形，絕大多數(shù)無色，少數(shù)為褐色，初步鑒定實驗分離出的內(nèi)生菌符合尖孢鐮刀菌的特征。

A—致病菌的菌落特征；B—致病菌的菌絲；C—致病菌的鐮刀狀分生孢子和厚垣孢子。

2.2.2 致病菌致病性檢測

在人工回歸接種致病菌第5 d后，金線蓮健康的植株開始發(fā)病，表現(xiàn)出明顯的莖腐病癥狀。取致病菌侵染的金線蓮植株進行致病菌的再分離，得到與接種菌株具有相同形態(tài)學(xué)特征的致病菌(圖3)。

圖3 致病性檢測

2.2.3 致病菌分子學(xué)鑒定

用真菌共用引物進行莖腐病致病菌的rDNA-ITS片段PCR，擴增出的特異性單一條帶在523 bp左右(圖4)，產(chǎn)物測序后獲得該致病菌的基因序列。用GenBank已知的DNA序列與致病菌的rDNA-ITS序列進行同源性比較，數(shù)據(jù)表明，與致病菌同源性較高的菌株是尖孢鐮刀菌(F.oxysporumSchl.)，同源性高達98%。據(jù)此，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定引起金線蓮莖腐病的致病菌為尖孢鐮刀菌。

圖4 金線蓮莖腐病致病菌的rDNA-ITS序列

2.3 拮抗菌的篩選

通過對峙實驗法篩選到3種有良好抑菌作用的拮抗菌，分別是哈茨木霉、綠色木霉、放線菌。實驗結(jié)果如下圖所示(圖5～7)，可以看出3種拮抗菌對金線蓮莖腐病致病菌尖孢鐮刀菌的萌發(fā)和生長具有抑制作用，且3種拮抗菌的生長速率顯著快于致病菌。實驗5 d后，哈茨木霉的抑菌率最高，為66.7%；綠色木霉次之，為63.9%；放線菌的抑菌率為62.5%(表1)。

表1 3種拮抗菌對金線蓮莖腐病致病菌的抑菌實驗結(jié)果

A、B—哈茨木霉與致病菌的對峙實驗菌落形態(tài)；C—對照，未接種哈茨木霉菌。

3 討論

尖孢鐮刀菌是一種世界性的毀滅性病原真菌，可侵染100多種具有重要價值的作物，引發(fā)作物枯萎導(dǎo)致根腐病[11-12]。由鐮刀菌枯萎病引起的土傳病害正威脅我國香蕉[13]、西瓜[14]、鐵皮石斛[15]、百合[16]等多種重要經(jīng)濟作物的生產(chǎn)。本研究從患莖腐病的金線蓮莖段中分離得到一株疑似致病菌菌株，通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和致病性檢測等方法進行了鑒定。依據(jù)鐮刀菌分類標(biāo)準(zhǔn)，確定該金線蓮莖腐病的致病菌為尖孢鐮刀菌(F.oxysporumSchl.)，與趙云青等[3]的結(jié)果一致。金線蓮整個生長周期均有可能感染莖腐病，且該病病勢迅猛，極易在短期內(nèi)出現(xiàn)大面積倒伏，嚴(yán)重制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展，生產(chǎn)上防治金線蓮莖腐病主要用百菌通、多菌靈等化學(xué)農(nóng)藥進行防治，而化學(xué)防治必定會帶來諸多的問題，例如藥劑殘留危害人類的健康。因此，尋找到一種綠色環(huán)保的防治方法尤為重要，是符合當(dāng)前人們追求健康生活的理念，而生物防治無疑是最好的選擇。

A、B—綠色木霉菌與致病菌的對峙實驗菌落形態(tài)；C—對照，未接種綠色木霉菌。

A、B—放線菌與致病菌的對峙實驗菌落形態(tài)；C—對照，未接種放線菌。

抑菌實驗結(jié)果表明，哈茨木霉、綠色木霉、放線菌都對金線蓮莖腐病致病菌都有良好的抑制效果。3種拮抗菌表現(xiàn)出的抑制作用可能與拮抗菌爭奪致病菌營養(yǎng)物質(zhì)或分泌拮抗物質(zhì)等因素有關(guān)，具體原因有待進一步深入研究。生防菌在寄主中穩(wěn)定定殖是其發(fā)揮防病作用的重要前提，也是決定其防病效果的關(guān)鍵因素。由于本文采用的是平板對峙培養(yǎng)法，生防菌在離體條件下的拮抗實驗和自然情況下的抑制作用未必存在必然的關(guān)系，往往實驗室中拮抗菌有明顯的抑制效果，但接種到植株的根際土壤后卻沒有生防作用。本研究是在實驗室中開展的，缺乏必要的實際生產(chǎn)防效實驗。若經(jīng)過進一步的實際生產(chǎn)實驗驗證，3種拮抗菌將有望成為防治金線蓮莖腐病第一選擇的綠色藥劑。這樣不僅可以減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量和使用頻率，進一步減低農(nóng)殘，還可以減少種植戶的生產(chǎn)成本，在金線蓮的實際生產(chǎn)中有巨大的市場前景價值。