蔡瑜婷 楊小禎 陳春梅 王焌翔 余思宸 黃恩炯 張靈玲, 關(guān) 雄**

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；3.福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，福州 350122，4. 福州國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心，福州 350001)

埃及伊蚊Aedesaegypti屬雙翅目昆蟲，主要在白天與傍晚活動(dòng)，棲息于避風(fēng)幽暗處，如水缸底、床底、墻角等(謝暉等, 2011)。該蚊在叮咬騷擾人類的同時(shí)也傳播登革熱、寨卡病毒病、基孔肯雅熱、黃熱病等重要傳染病(丁魯民, 1999)。目前利用生防微生物對(duì)埃及伊蚊進(jìn)行消殺是阻斷蚊媒傳染病進(jìn)一步傳播的重要途徑之一。而埃及伊蚊自身的免疫能力在其抵御病原入侵方面發(fā)揮了一定作用。

昆蟲免疫為非專一性的天然免疫，由細(xì)胞免疫和體液免疫組成。體液免疫主要包括凝結(jié)反應(yīng)、黑化反應(yīng)、Toll途徑(由真菌和大部分革蘭氏陽性菌激活)和Imd途徑(由革蘭氏陰性菌激活)，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽并將其釋放到血淋巴中，同時(shí)包括溶菌酶作用及酚氧化酶原(PPO)級(jí)聯(lián)反應(yīng)等(寧媛媛等, 2009)。當(dāng)受到外來病原侵染時(shí)，昆蟲天然免疫會(huì)識(shí)別外來異物，隨后引發(fā)、激活細(xì)胞外級(jí)聯(lián)反應(yīng)，啟動(dòng)Toll或Imd信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而誘導(dǎo)不同抗菌肽的產(chǎn)生。通過模式生物黑腹果蠅(Hoffman, 2003)的免疫研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)異己物的識(shí)別主要是由不同模式識(shí)別受體(PRPs)來實(shí)現(xiàn)的。其中肽聚糖識(shí)別蛋白(peptidoglycan recognition proteins，PGRPs)是昆蟲免疫中重要的識(shí)別受體，能識(shí)別出細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖(peptidoglycan，PGN)，從而激活體液免疫中的 Toll 途徑和 Imd 途徑，誘導(dǎo)抗菌肽產(chǎn)生。PGRPs具有一個(gè)能與PGN結(jié)合的保守結(jié)構(gòu)域，大約由165個(gè)氨基酸組成，稱為PGRP結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與T7的溶菌酶高度同源。T7溶菌酶具有酰胺酶活性，能夠裂解 PGN，因此，PGRPs根據(jù)其是否具有酰胺酶活性被劃分為兩類。另外，根據(jù)PGRPs的分子量大小可分為PGRP-L和PGRP-S兩種類型。PGRP-L為長(zhǎng)型(分子量>90 kDa)，是跨膜蛋白、胞內(nèi)蛋白或胞外蛋白，基因較復(fù)雜；PGRP-S為短型(分子量約20 ～ 25 kDa)，是小分子的分泌型蛋白，基因較簡(jiǎn)單(Werneretal., 2000；呂成偉等, 2002)。

目前已對(duì)5種重要入侵昆蟲(紅棕象甲R(shí)hynchophorusferrugineus、煙粉虱Bemisiatabac、意大利蜜蜂Apismelliferalingustica、日本龜蠟蚧Ceroplastesjaponicus和舞毒蛾Lymantriadispar)的免疫機(jī)制展開研究(曾令瑜等，2019)。有關(guān)紅棕象甲免疫機(jī)制的研究主要定位于RfRelish編碼基因和RfPGRP-LB蛋白(肖蓉等，2021)；以黑腹果蠅(Basbousetal.，2011)為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)其PGRP具有激活Toll和Imd信號(hào)途徑、誘導(dǎo)抗菌肽產(chǎn)生和促進(jìn)吞噬作用的功能；以煙草天蛾為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)其PGRP具有激活酚氧化酶原產(chǎn)生黑化反應(yīng)的功能(徐亞玲等，2010)。此外，在黑腹果蠅等其他昆蟲中也有PGRP對(duì)其免疫應(yīng)答功能的相關(guān)報(bào)道，但是對(duì)埃及伊蚊中不同種類PGRP功能的了解還相對(duì)較少(楊青泰，2018；姜欣伶，2020)。因此，本實(shí)驗(yàn)以埃及伊蚊為研究對(duì)象，通過克隆與測(cè)序分析其肽聚糖識(shí)別蛋白基因，了解其序列特征，并通過表達(dá)、純化，為進(jìn)一步開展埃及伊蚊的免疫機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 埃及伊蚊

埃及伊蚊由軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所惠贈(zèng)，?？谄废?Ae.aegypti，Haikou strain)在本實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定傳代40代以上。

1.2 菌株、質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109菌株、BL21表達(dá)菌株和pCold-GST載體均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 主要試劑和儀器

質(zhì)粒小提試劑盒、IN-Fusion HD Cloning Kit、預(yù)染分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)、Protein Marker、一抗GST-tag monochonal antibiody和二抗AP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)均購(gòu)于日本Takara公司，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購(gòu)于碧云天公司，LB(Tyrptone、Yeast Extract、NaCl、瓊脂條)，IPTG，PBS，GST洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，谷胱甘肽，5 mmol/L NaOH)，LSB，30%丙烯酰胺，1.5 mol/L Tris-HCl，1.0 mol/L Tris-HCl，TEMED，考馬斯亮藍(lán)R250，脫色液(乙酸，甲醇)，BSA，Bradford溶液，PVDF膜，轉(zhuǎn)膜buffer(Gly、Tris，SDS，甲醇)，封閉液(脫脂奶粉，PBS)，PBST(PBS，吐溫20)。超微量分光光度計(jì)Q5000(Quawell，美國(guó))，Glutathione Sepharose 4B填料(GE，美國(guó))，層析柱(碧云天，中國(guó))。

1.4 RNA提取和cDNA合成

收集5只埃及伊蚊成蟲，按TRIzolTMReagent RNA提取試劑盒提取埃及伊蚊RNA。利用超微量分光光度計(jì)Q5000和凝膠電泳檢測(cè)RNA。以提取的RNA作為模版，參照ImProm-IITMReverse Transcription System試劑盒合成cDNA，放至-20 ℃保存。

1.5 埃及伊蚊PGRP-S2基因的克隆與測(cè)序

根據(jù)埃及伊蚊PGRP-S2(AAEL007039)的CDS序列設(shè)計(jì)特異性引物(PGRP-S2-F: G G T A C C C T C G A G G G A T C C A T G C A G T G C C C A C G T A T C G T C AC，PGRP-S2-R: C TG C A G G T C G A C A A G C T T T T A A G G A T T T G G G T T G A A AC)。以提取的埃及伊蚊cDNA為模板，擴(kuò)增PGRP-S2全長(zhǎng)基因，PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：98 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)(98 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s/kb)，72 ℃ 2 min，4 ℃終止。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢驗(yàn)后，回收純化，并委托鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 埃及伊蚊PGRP-S2蛋白生物信息學(xué)分析

利用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析埃及伊蚊PGRP-S2的閱讀框。利用 CDD(https: / /www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/docs/cdd_search. html)預(yù)測(cè)埃及伊蚊PGRP-S2 的保守結(jié)構(gòu)域。并選用部分昆蟲，包括白紋伊蚊Aedesalbopictus、岡比亞按蚊Anophelesgambiae、阿拉伯按蚊Anophelesarabiensis、淡色庫(kù)蚊Culexpipienspallens、致倦庫(kù)蚊Culexquinquefasciatus、地中海實(shí)蠅Ceratitiscapitata、意大利蜂Apismellifera、家蠶Bombyxmori、果蠅Drosophilamelanogaster、家蠅Muscadomestica、斜紋夜蛾Spodopteralitura、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella、蚱蠶Anthereapernyi、桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、粘蟲Mythimnaseparata等，根據(jù)供試?yán)ハx的PGRP基因序列信息(Yoshidaetal.，1996；Yang，2015；任美佳，2019；郝志霞，2020；杜少萱等，2020)，利用 MEGA7.0進(jìn)行序列比對(duì)分析并構(gòu)建埃及伊蚊PGRP-S2和其他昆蟲 PGRPs 的系統(tǒng)發(fā)育樹(貝葉斯法，1 000次重復(fù))。

1.7 表達(dá)載體pCold-GST-PGRP-S2的構(gòu)建

根據(jù)IN-Fusion HD Cloning Kit說明書，將埃及伊蚊PGRP-S2的回收產(chǎn)物與BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切的線性化pColdTMGST載體進(jìn)行無縫克隆連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109，篩選具有氨芐青霉素抗性的單克隆菌落，陽性克隆子用PCR以及BamH Ⅰ和Hind Ⅲ單雙酶切驗(yàn)證，并送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序驗(yàn)證正確后，將質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞。

1.8 誘導(dǎo)表達(dá)

將單克隆菌株接種至含100 μg/mL Amp的5 mL LB試管中，37 ℃、200 r/min過夜活化。吸取1 mL菌液轉(zhuǎn)接于含100 μg/mL Amp的100 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至菌體OD600為0.6～0.8，在冰上放置30 min后，加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，15 ℃，200 r/min低溫誘導(dǎo)24 h。誘導(dǎo)結(jié)束離心收集菌體，用20 mL GST結(jié)合緩沖液(10 mmol/L PBS，pH7.5)重懸沉淀后再次離心，洗去菌體中的培養(yǎng)基。放置在冰上進(jìn)行超聲波破碎，破碎后離心，用0.22 μmol/L濾膜將上清液過濾到新的離心管，即為可溶蛋白。

1.9 可溶蛋白PGRP-S2純化

取1 mL Glutathione Sepharose 4B填料加入親和層析柱。對(duì)目的可溶蛋白進(jìn)行相應(yīng)親和層析純化。利用2 mL GST洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris HCI, 300 mmol/L KCl,1 mmol/L DTT, 10 mmol/L Glutathione, pH7.5)洗脫蛋白，4 ℃靜置30 min,收集流出液。

1.10 重組蛋白的Western Blot檢測(cè)

取純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，在恒壓100 V、200 mA的條件下進(jìn)行凝膠轉(zhuǎn)膜，大約1.5 h；結(jié)束后用含5%脫脂奶粉的封閉液，37 ℃ 下將膜封閉2 h，用含吐溫-20的磷酸緩沖液(PBST)洗膜3次；將膜放于封閉液稀釋過的一抗(GST-tag monochonal antibody)中，室溫?fù)u床孵育2 h，PBST洗滌3次，再放于封閉液稀釋過的二抗(AP標(biāo)記山羊抗小鼠lgG)中，室溫?fù)u床孵育2 h，PBST洗滌4次；將膜轉(zhuǎn)移到暗盒中，加入AP顯色液，進(jìn)行顯色反應(yīng)，直至膜上出現(xiàn)清晰的條帶。

2 結(jié)果

2.1 埃及伊蚊PGRP-S2基因克隆及序列分析

設(shè)計(jì)埃及伊蚊PGRP-S2特異性引物，通過RT-PCR擴(kuò)增，獲得一條500 bp的條帶，與預(yù)期大小一致(圖1-A)。將PCR產(chǎn)物回收并與連接線性化pColdTMGST載體連接后成功轉(zhuǎn)化于E.coliBL21表達(dá)菌株，用BamHⅠ單酶切獲得1條5 500 bp的條帶，用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切則分別獲得1條5 000 bp的載體大小以及500 bp大小的目的基因條帶(圖1-B)。后經(jīng)sanger測(cè)序確定質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 PGRP-S2基因克隆電泳圖

2.2 埃及伊蚊PGRP-S2基因序列分析

提取并測(cè)定PCR及單雙酶切驗(yàn)證正確的陽性克隆子質(zhì)粒，獲得埃及伊蚊PGRP-S2基因全長(zhǎng)序列。通過測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)該序列的開放閱讀框長(zhǎng)510 bp，可編碼170個(gè)氨基酸。CDD結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示該序列具有典型的PGRP超家族保守結(jié)構(gòu)域與酰胺酶結(jié)構(gòu)域(圖2)。選取埃及伊蚊PGRP-S2氨基酸序列及其他昆蟲PGRPs,使用 MEGA7.0軟件的鄰比對(duì)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊AePGRP-S2與其他兩種埃及伊蚊的PGRPs聚類在同一分支上，說明二者親緣關(guān)系最近(圖3)。

圖2 埃及伊蚊PGRP-S2保守區(qū)域分析

圖3 埃及伊蚊PGRP-S2與其他昆蟲肽聚糖識(shí)別蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 重組蛋白的表達(dá)與純化

將PGRP-S2基因重組到pCold-GST載體上，并轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)。提取并通過SDS-PAGE檢測(cè)總蛋白，發(fā)現(xiàn)IPTG誘導(dǎo)后在46 kDa處有一條特異蛋白，與預(yù)期一致(圖4-A)。為進(jìn)一步確證該蛋白的表達(dá)，根據(jù)表達(dá)載體的GST標(biāo)簽選用GST抗體通過Western blot進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)GST標(biāo)簽26 kDa和PGRP-S2蛋白46 kDa可被特異性檢出(圖4-B)，說明該蛋白已成功表達(dá)，且表達(dá)PGRP-S2蛋白可溶(圖4-A，B)。

圖4 SDS-PAGE 檢測(cè)純化的重組PGRP-S2蛋白

3 討論

先天免疫是昆蟲抵抗寄生蟲入侵和外界微生物感染的重要途徑。昆蟲先天免疫主要依靠病原菌的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)與宿主的模式識(shí)別受體(PRRs)，這些病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)包括脂多糖、肽聚糖、脂磷壁等(任美佳，2019)，而PGRPs能夠識(shí)別微生物細(xì)胞壁上的肽聚糖，在昆蟲免疫中具有重要作用。第一個(gè)關(guān)于PGRP的報(bào)道來自于家蠶血淋巴的純化，分子量為19 kDa(Yoshidaetal.，1996)。后來陸續(xù)有多個(gè)PGRP家族成員被鑒定，根據(jù)5’端非翻譯區(qū)和轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度，被分為長(zhǎng)型與短型。研究發(fā)現(xiàn)，家蠶中的BmPGRP蛋白具有激活抗菌肽基因表達(dá)的作用(Yang，2015)，家蠅中的MdPGRP-LE受到干擾會(huì)降低幼蟲體內(nèi)分氧化物酶活性(郝志霞，2020)，小菜蛾的PGRP-S2蛋白具有與細(xì)菌結(jié)合識(shí)別功能(杜少萱等，2020)。埃及伊蚊也可通過自身的肽聚糖識(shí)別蛋白來識(shí)別入侵微生物的PGN，從而啟動(dòng)免疫機(jī)制，提高蟲體抵御這些微生物的能力。

為進(jìn)一步了解埃及伊蚊PGRP基因序列特征，本研究克隆得到埃及伊蚊AePGRP-S2基因，通過基因序列分析(圖2)發(fā)現(xiàn)該基因具有典型的PGRP超家族保守結(jié)構(gòu)域與酰胺酶結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域與Ⅱ型N-乙酰-L丙氨酸酰胺酶活性位點(diǎn)高度相似，AePGRP-S2蛋白極有可能具有殺菌活性。但有些具有酰胺酶結(jié)構(gòu)域的PGRP蛋白沒有直接的抗菌活性，但是在與細(xì)菌結(jié)合后，進(jìn)一步激活Toll通路，從而引起抗菌肽的表達(dá)(Mellrothetal.，2006，羅嫚等，2016)。因此，AePGRP-S2蛋白的酰胺酶活性及作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入探討。為進(jìn)一步了解埃及伊蚊的與其他昆蟲的親緣關(guān)系，將埃及伊蚊AePGRP-S2基因與其他昆蟲的S型PGRPs基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖3)，結(jié)果顯示AePGRP-S2與埃及伊蚊的其他兩種PGRPs親緣關(guān)系較高，說明二者在功能上具有一定的保守性。為進(jìn)一步了解該基因的功能，本研究還體外異源表達(dá)了PGRP-S2，通過SDS-PAGE及Western Blot分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白大小46 kDa。然而，PGRP-S2如何精細(xì)調(diào)控埃及伊蚊的免疫反應(yīng)機(jī)制還不確定，本研究對(duì)于該蛋白的序列特性的了解及表達(dá)蛋白產(chǎn)物的獲得為下一步工作開展該蛋白在埃及伊蚊體內(nèi)的免疫機(jī)能研究提供了重要理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)材料。