施明杰 劉智通 孫 毅

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，媒介生物危害和自然疫源性疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071)

蜱，隸屬于無(wú)脊椎動(dòng)物門蛛形綱蜱目，是一類專職吸血的非永久性體外寄生節(jié)肢動(dòng)物，下分軟蜱科(Argasidae)、硬蜱科(Ixodidae)、納蜱科(Nuttalliellidae)以及新提出成立的恐蜱科(Deomocrotonidae) (Anderson, 2002, 2008; 周錦萍etal., 2011)。蜱是人和動(dòng)物多種疾病的傳播媒介，包括各種細(xì)菌、病毒、立克次體、螺旋體等病原微生物。近年來(lái)蜱媒疾病的不斷發(fā)生引起了廣泛的關(guān)注，許多經(jīng)典蜱媒疾病，如森林腦炎、出血熱、Q熱等，以及各種新發(fā)蜱媒傳染病，如萊姆病、無(wú)形體病和2010年發(fā)現(xiàn)的發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome disease, SFTS)也在不斷威脅著公共衛(wèi)生安全和人類的健康(Yuetal., 2011)。蜱在叮咬吸血的過(guò)程中，病原體隨著血餐進(jìn)入到蜱類中腸，之后通過(guò)中腸圍食膜屏障進(jìn)入血淋巴，再由血淋巴輸送至唾液腺，利用胞吞作用突破屏障進(jìn)入蜱類唾液腺，在唾液腺中經(jīng)過(guò)增殖和/或發(fā)育后再胞吐隨著唾液進(jìn)入宿主動(dòng)物(人)體內(nèi)完成病原體傳播循環(huán)(Reuben Kaufman, 2010)。不同的蜱媒病原體具有不同的表征，如肽聚糖、脂多糖、葡聚糖等，可以被媒介蜱種唾液腺細(xì)胞表面模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor, PRR)特異性的識(shí)別，通過(guò)形成特定的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)而與唾液腺細(xì)胞相互作用(Schwan, 1996; Bugryshevaetal., 2001; Lemaitreetal., 2007; Lindsayetal., 2014)。蜱內(nèi)唾液腺細(xì)胞接收到模式識(shí)別受體PRR傳遞的病原入侵信號(hào)后對(duì)信號(hào)進(jìn)行進(jìn)一步的加工整合，以非線性級(jí)聯(lián)反應(yīng)的方式激活細(xì)胞內(nèi)各種調(diào)控通路，如Janus激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子通路(janus kinase-signal transducer and activator of transcription pathways, JAK-STAT)、免疫缺陷途徑通路(immune deficiency pathway, IMD)和核因子-κB信號(hào)通路(nuclear factor-kappa B signaling pathways, NF-κB)等調(diào)控通路，產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)(Costaetal., 2009; Robertsonetal., 2009)。與此同時(shí)，病原體能夠利用各種信號(hào)調(diào)控通路去調(diào)節(jié)唾液腺細(xì)胞分泌的多種效應(yīng)分子，如C3、C5補(bǔ)體抑制劑系列和宿主免疫調(diào)節(jié)因子 Salp系列等，通過(guò)分子互作進(jìn)一步誘導(dǎo)病原體表型或效應(yīng)分子的改變，從而發(fā)揮補(bǔ)體抑制、免疫調(diào)節(jié)和免疫逃逸等作用，造成病原體在媒介蜱種中的持續(xù)性感染，影響著蜱媒病原的傳播效能(Bowmanetal., 1997; Valenzuelaetal., 2000; Dasetal., 2001; Gillespieetal., 2001; Couvreuretal., 2008; Shoemakeretal., 2008)。因此，明確蜱媒病原體與唾液腺細(xì)胞相互作用的信號(hào)調(diào)控元件及通路、揭示蜱媒病原傳播的分子基礎(chǔ)，有助于制定和優(yōu)化蜱媒疾病的防控策略，從而阻斷蜱媒疾病的傳播。

蜱類免疫系統(tǒng)與其他無(wú)脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)類似，而相比于脊椎動(dòng)物來(lái)說(shuō)則更加原始和簡(jiǎn)單，只呈現(xiàn)先天免疫反應(yīng)(Fogacaetal., 2021)。蜱類的先天免疫主要包括兩個(gè)方面, 一是體液免疫，其中包括抗菌肽、防御素等；二是細(xì)胞防御，即細(xì)胞吞噬(phagocytosis)和包囊(encapsulation)作用。在細(xì)胞防御中，一些多樣化的免疫信號(hào)通路(Toll、IMD、JAK/STAT通路)、小RNA干涉通路(RNA inference pathway)和相關(guān)重要免疫因子已經(jīng)被證實(shí)參與蜱媒病原的感染和傳播過(guò)程(Kazimirovaetal., 2013; Kotaletal., 2015; Simoetal., 2017；Aguilar-Díazetal., 2021)。本文就蜱類主要免疫系統(tǒng)信號(hào)通路及泛素化在蜱類調(diào)控信號(hào)通路和免疫逃逸方面的作用進(jìn)行綜述，以期能夠?yàn)橹贫缑郊膊》揽夭呗蕴峁┘夹g(shù)支持。

1 蜱類細(xì)胞免疫信號(hào)通路

1.1 Toll信號(hào)通路

節(jié)肢動(dòng)物有一系列用于預(yù)防和控制感染的抗病毒機(jī)制，包括RNA干擾(RNA interference)、抗病毒肽如防御素(defensins)和利用Toll受體的檢測(cè)機(jī)制等(Kopaceketal., 2010; Ruckertetal., 2014; Schnettleretal., 2014; Talactacetal., 2017)。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLRs)是公認(rèn)的模式識(shí)別受體，它們對(duì)包括病毒在內(nèi)的微生物感染起著關(guān)鍵性的作用(Akiraetal., 2004)。通過(guò)與不同的病原體基序的特異性結(jié)合，TLRs可以激活機(jī)體對(duì)病原感染的免疫反應(yīng)。TLRs保守結(jié)構(gòu)是由一個(gè)氨基末端富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeat, LRRs)的胞外結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜區(qū)和Toll-白介素受體(toll-interleukin receptor, TIR)信號(hào)結(jié)構(gòu)域組成(Belletal., 2003)。TLRs在無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中的廣泛存在，說(shuō)明了TLRs對(duì)控制感染的重要性(Buchmann, 2014)。在果蠅中，TLRs通過(guò)識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁表面的肽聚糖(peptidoglycan, PGN)和真菌細(xì)胞壁中的葡聚糖，形成相應(yīng)的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，從而優(yōu)先激活Toll信號(hào)通路(Lemaitreetal., 2007; Lindsayetal., 2014)。Toll途徑中的大部分元件(Smithetal., 2014; Gulia-Nussetal., 2016; Rosaetal., 2016; Oliva Chavezetal., 2017)已經(jīng)通過(guò)生物信息學(xué)和基因組學(xué)手段在蜱類中發(fā)現(xiàn)，但至今尚未有明確的結(jié)論。Rosa等(2016)人發(fā)現(xiàn)邊緣無(wú)形體Anaplasmamarginale感染微小扇頭蜱RhipicephalusmicroplusBME26細(xì)胞系后，Toll信號(hào)通路途徑成分中大部分元件基因表達(dá)下調(diào)，并推測(cè)這可能與其在微小扇頭蜱中感染繁殖和共進(jìn)化適應(yīng)有關(guān)。相反，肩突硬蜱Ixodesscapularis若蜱Toll基因(ISCW018193)的沉默對(duì)吞噬細(xì)胞無(wú)形體A.phagocytophilum在唾液腺中的定植沒(méi)有任何影響，但不能排除Toll途徑參與吞噬細(xì)胞無(wú)形體A.phagocytophilum的感染調(diào)控(Liuetal., 2012)。因而，在基因?qū)用嫔希≡⑸锔腥究赡軙?huì)抑制Toll信號(hào)通路的相關(guān)元件而促進(jìn)感染，但尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。未來(lái)，依賴已經(jīng)獲得的生物信息學(xué)和基因組學(xué)數(shù)據(jù)，對(duì)蜱類Toll信號(hào)通路關(guān)鍵性元件及其相互作用的深入認(rèn)知，將有助于發(fā)現(xiàn)阻斷蜱媒病原傳播的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.2 JAK/STAT信號(hào)通路

JAK/STAT信號(hào)通路往往被看做是Toll和IMD途徑的旁支通路，在調(diào)控細(xì)菌和真菌感染方面發(fā)揮作用。蜱類中的JAK/STAT信號(hào)通路的生物學(xué)功能也逐漸被認(rèn)知。在肩突硬蜱中，JAK/STAT調(diào)控著吞噬細(xì)胞無(wú)形體A.phagocytophilum在唾液腺和血淋巴中的增殖和感染，5.3 kDa的AMP是其發(fā)揮調(diào)控作用的效應(yīng)器(Liuetal., 2012)。同樣，微小扇頭蜱中JAK/STAT信號(hào)通路與AMPs的調(diào)節(jié)有關(guān)，STAT缺陷導(dǎo)致蜱蟲(chóng)唾液腺中AMPs ixodidin和溶菌酶以及腸道和唾液腺中的防御素下降(Capelli-Peixotoetal., 2017)。此外，圍食膜因子-1(peritrophin-1)也是蜱類JAK/STAT信號(hào)通路的另一效應(yīng)物。圍食膜因子-1的雙向調(diào)節(jié)作用，既能增加伯氏疏螺旋體Borreliaburgdorferi在肩突硬蜱若蜱腸道中的存活率，從而有利于伯氏疏螺旋體B.burgdorferi的定植；也能通過(guò)腸道上皮的修復(fù)和更新，擾亂腸道微生物群而調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞無(wú)形體A.phagocytophilum含量(Narasimhanetal., 2014; Abrahametal., 2017)。但由于JAK/STAT信號(hào)通路中細(xì)胞信號(hào)跨膜受體Domeless的缺失，蜱類激活JAK/STAT信號(hào)通路的方式、其信號(hào)接收和傳導(dǎo)過(guò)程是否有新的跨膜蛋白參與或與別的通路產(chǎn)生交互，還有待進(jìn)一步明確。

1.3 IMD信號(hào)通路

免疫缺陷途徑是調(diào)控大多數(shù)抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)基因表達(dá)的最重要的途徑(Ferrandonetal., 2007)。存在于蜱的血淋巴、脂肪體、腸道、卵巢和唾液腺等組織或器官中的抗菌肽是經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有廣泛抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)(Buletetal., 2004; Sonenshineetal., 2008)。這些抗菌肽按來(lái)源可分為3類，(1)外源性AMPs，如蜱蟲(chóng)利用宿主血紅蛋白衍生的殺血菌素(hemocidins)(Cruzetal., 2010; Dubinetal., 2005)；(2)內(nèi)源性AMPs(核糖體合成的AMPs)，如microplusins(又稱為hebraeins)、防御素(Pelcetal., 2014; Martinsetal., 2019)；(3)通過(guò)基因轉(zhuǎn)移而獲得的AMPs，如Dae2(Chouetal., 2015)；在不同蜱種中廣泛存在，并抵御多種病原微生物產(chǎn)生危害。

研究發(fā)現(xiàn)，埃及伊蚊Aedesaegypti體內(nèi)IMD信號(hào)通路激活后能夠控制其中腸微生物群的水平，并且也能夠允許蚊媒病毒在體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制(Kleinoetal., 2014)。同樣的，節(jié)肢動(dòng)物能夠利用圍食膜和IMD信號(hào)通路去對(duì)抗腸道中的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的感染，并且依賴于IMD信號(hào)通路途徑來(lái)控制入侵細(xì)菌的排出(Barlettaetal., 2017; Horietal., 2018)?？梢?jiàn)，節(jié)肢動(dòng)物中IMD信號(hào)通路途徑對(duì)于控制革蘭氏陽(yáng)性菌的感染傳播存在著重要的作用。故而，有理由推測(cè)蜱類IMD信號(hào)通路途徑也應(yīng)當(dāng)存在類似功能。

研究證實(shí)，果蠅中經(jīng)典的IMD途徑是通過(guò)唾液腺細(xì)胞表面的肽聚糖識(shí)別蛋白(peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)來(lái)識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁中存在的二氨基戊二酸型肽聚糖(diaminopimelic acid-type PGN, PG) 來(lái)控制的，又稱為DAP型肽聚糖 (Lemaitreetal., 2007；Kleinoetal., 2014)。在識(shí)別成功后，受到PG的刺激，胞內(nèi)會(huì)形成一類由IMD蛋白、dFADD蛋白以及DREDD蛋白三者組成的三聚體蛋白復(fù)合物。該復(fù)合物中DREDD蛋白能夠被E3泛素連接酶凋亡抑制劑(DIAP-2)通過(guò)泛素化的方式激活(Meinanderetal., 2012)。激活后的DREDD裂解IMD并通過(guò)依賴K63途徑泛素化IMD蛋白，隨后依賴于K63多聚泛素化鏈招募并激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β激活激酶1(transforming growth factor-beta activated kinase 1, TAK1)，進(jìn)而依靠泛素結(jié)合基序激活TAK1/TAB2(TAK1-binding protein 2, TAK1連接蛋白)復(fù)合物，最終通過(guò)TAK1/TAB2復(fù)合物激活I(lǐng)MD信號(hào)通路NF-kB激酶抑制因子(IKK)/Relish分支和JNK通路，Relish通過(guò)IKK復(fù)合物介導(dǎo)的磷酸化和DREDD的裂解雙重控制激活后被切割為兩部分，其中羧基端部分留在細(xì)胞質(zhì)中，而活性氨基端部分轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄(Stovenetal., 2003; Kimetal., 2005; Paquetteetal., 2010)。

然而，通過(guò)對(duì)蜱類生物信息學(xué)數(shù)據(jù)的分析卻發(fā)現(xiàn)其IMD信號(hào)通路途徑缺乏包括跨膜蛋白PGRPs、具有死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白(FADD)、受體蛋白IMD和死亡相關(guān)的ced-3/Nedd2樣蛋白(DREDD)等許多重要通路元件的同源基因(Smithetal., 2014; Gulia-Nussetal., 2016; Rosaetal., 2016; Shawetal., 2017)。這種IMD途徑成分丟失的情況在其他蛛形綱和半翅目昆蟲(chóng)中也同樣發(fā)生(Palmeretal., 2015; Nishideetal., 2019)，除了基于標(biāo)準(zhǔn)基因結(jié)構(gòu)的錯(cuò)誤注釋這一可能的原因外(Salcedo-Porrasetal., 2019)，IMD通路元件的同源基因的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化也是需要明確的科學(xué)問(wèn)題。

有趣的是，盡管缺少幾個(gè)元件，蜱中IMD途徑仍然具有重要的抗菌功能，并能對(duì)不同類的病原體產(chǎn)生響應(yīng)，并因此被稱為“非常規(guī)免疫缺陷途徑”(Capelli-Peixotoetal., 2017; Shawetal., 2017; McClure Carrolletal., 2019)。蜱類通過(guò)識(shí)別革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜上的甘油磷脂來(lái)激活非常規(guī)IMD途徑，包括1-棕櫚?；?2-油?；?錫-甘油-3-磷甘油(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-3-phosphoglycerol, POPG)和1-棕櫚?；?2-油酰基-二酰甘油(1-palmitoyl-2-oleoyl diacylglycerol, PODAG)，但具體的識(shí)別機(jī)制仍不清楚，需得到進(jìn)一步驗(yàn)證，但不可否認(rèn)的是該通路因此被激活(Shawetal., 2017)。

此外，研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)蜱類非常規(guī)IMD途徑上游成分——X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要功能。XIAP是一類具有細(xì)胞凋亡作用的蛋白，其分子結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)特征性的結(jié)構(gòu)域：一個(gè)是桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)序列(baculoviral IAP repeat, BIR)結(jié)構(gòu)域，另一個(gè)是“真正有趣新基因”(really interesting new gene, RING)結(jié)構(gòu)域(Beugetal., 2012; Severoetal., 2013)。其BIR結(jié)構(gòu)域能夠與鋅原子相結(jié)合，而RING結(jié)構(gòu)域則具有E3泛素連接酶活性，可以促進(jìn)XIAP自身或與其相互作用的蛋白分子泛素化而降解。研究發(fā)現(xiàn)，在肩突硬蜱I.scapularis中E3泛素連接酶XIAP能夠抑制吞噬細(xì)胞無(wú)形體A.phagocytophilum在蜱內(nèi)的定植，通過(guò)沉默XIAP，吞噬細(xì)胞無(wú)形體A.phagocytophilum的定植顯著增加，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)XIAP多聚泛素化依賴于其RING結(jié)構(gòu)域催化且通過(guò)賴氨酸(K)-63途徑，而非K48途徑，同時(shí)在K63泛素化途徑中需要鋅來(lái)催化，BIR結(jié)構(gòu)域?qū)︿\的捕獲促進(jìn)了泛素化過(guò)程的實(shí)現(xiàn)(Severoetal., 2013)。非常規(guī)IMD途徑中，XIAP在被POPG和PODAG激活后，能夠與異二聚體E2結(jié)合酶復(fù)合物(the heterodimer E2 conjugating enzyme complex) Bendless:UEV1a特異性地結(jié)合，以K63依賴方式結(jié)合并泛素化p47底物(Shawetal., 2017)。而泛素化的p47能夠與Kenny(又名NEMO)連接，并誘導(dǎo)NF-kB激酶抑制因子β(IKKβ)(又名IRD5)的磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)IMD途徑轉(zhuǎn)錄因子Relish被切割，隨后Relish活性N端部分轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄(McClure Carrolletal., 2019)。進(jìn)一步的研究也證實(shí)了這一級(jí)聯(lián)反應(yīng)中各種組分確實(shí)參與了肩突硬蜱若蜱中吞噬細(xì)胞無(wú)形體A.phagocytophilum和伯氏疏螺旋體B.burgdorferi定植數(shù)量的控制(Shawetal., 2017)。而果蠅經(jīng)典IMD途徑中TAK1和TAB1蛋白基因敲除后對(duì)吞噬細(xì)胞無(wú)形體A.phagocytophilum定植沒(méi)有影響，從側(cè)面也佐證了蜱中IMD途徑的激活和傳導(dǎo)與果蠅等其他模式生物中IMD途徑具有特殊性(Liuetal., 2012)。借助這一點(diǎn)，針對(duì)該非常規(guī)IMD途徑的繼續(xù)深入探索，明晰其信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)途經(jīng)和關(guān)鍵元件如E3泛素連接酶XIAP的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系對(duì)于控制蜱及蜱媒病原的傳播具有重要意義。

2 泛素及泛素化在蜱類免疫反應(yīng)中的作用

2.1 泛素和泛素化

泛素(Ubiquitin, Ub)是真核生物一種高度保守的、由76 aa組成的多肽，可通過(guò)E1、E2和E3三種酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)與其他蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)合(Pickart, 2001)。泛素的“信號(hào)”是由含有一個(gè)或多個(gè)泛素連接結(jié)構(gòu)域的特定泛素“受體”識(shí)別的(Dikicetal., 2009)。有20多種不同類型的泛素連接結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域嵌入到大量的細(xì)胞蛋白中。而泛素修飾就是通過(guò)泛素和存在于特殊蛋白中的泛素受體之間的低親和力、非共價(jià)的相互作用來(lái)識(shí)別，表明這種結(jié)合具有高度的動(dòng)態(tài)性和特異性調(diào)節(jié)的性質(zhì)。因此，泛素結(jié)合和去泛素結(jié)合以及泛素連接蛋白一起構(gòu)成了泛素介導(dǎo)的多種細(xì)胞過(guò)程調(diào)控的分子機(jī)制，在信號(hào)通路的傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能(Cooketal., 1992; Varadanetal., 2004; Jiangetal., 2011)。

另外，對(duì)于泛素來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)自身賴氨酸殘基(Lysine, K)以單一泛素(單泛素化)或多聚鏈狀泛素(多泛素化)兩種形式連接到靶蛋白上。不同泛素鏈類型以及靶蛋白的不同，產(chǎn)生的作用也不一樣，例如最常見(jiàn)的K48連接的泛素化鏈采用扭曲拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，通常以蛋白酶體的降解作為靶標(biāo)；相反地，K63連接的泛素化鏈則采用線性“串珠”狀結(jié)構(gòu)，通常被用作激活NK-κB信號(hào)通路和細(xì)胞存活的關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)，如DNA修復(fù)和蛋白激酶激活等(Cooketal., 1992; Varadanetal., 2004; Hoelleretal., 2006; Chenetal., 2009)。此外，通過(guò)泛素的其他賴氨酸殘基位點(diǎn)連接的多聚泛素鏈在細(xì)胞中也被發(fā)現(xiàn)但未確定其功能，如K6、K11、K27、K29、K33；許多類泛素蛋白也能夠通過(guò)修飾其他靶蛋白而發(fā)揮功能，包括SUMO(small ubiquitin-related modifier)、NEDD8、ATG12等(Kerscheretal., 2006; Xuetal., 2009)。

而上述多種泛素化類型都離不開(kāi)其共性反應(yīng)過(guò)程和關(guān)鍵功能酶，泛素化由E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶組成的三級(jí)酶聯(lián)反應(yīng)組成，作為一種通用的翻譯后修飾，廣泛應(yīng)用于免疫系統(tǒng)的各個(gè)方面，包括先天免疫系統(tǒng)對(duì)病原體的識(shí)別和清除、抗原提呈和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的激活等(Jiangetal., 2011)。研究發(fā)現(xiàn)，泛素化底物和泛素鏈類型的選擇很大程度上取決于E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶，而E3泛素連接酶因其又能嚴(yán)格控制泛素化的效率而成為泛素化級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵成分(Zhengetal., 2017; Cabezas-Cruzetal., 2019)。對(duì)于E3泛素連接酶來(lái)說(shuō)，主要依據(jù)其功能結(jié)構(gòu)域分為兩種，含有一個(gè)RING結(jié)構(gòu)域或一個(gè)HECT結(jié)構(gòu)域，用來(lái)介導(dǎo)E2泛素結(jié)合酶的結(jié)合以及泛素化過(guò)程，如E3泛素連接酶cullin-RING家族(Petroskietal., 2005)。有趣的是，目前已經(jīng)證實(shí)很多病原體進(jìn)化出許多方法來(lái)利用泛素化系統(tǒng)，例如對(duì)關(guān)鍵的免疫蛋白進(jìn)行降解；通過(guò)干擾或阻斷重要的抗菌途徑中的泛素調(diào)節(jié)機(jī)制；甚至通過(guò)劫持泛素系統(tǒng)來(lái)促進(jìn)自身的繁殖和致病。因而對(duì)蜱媒疾病的阻斷和預(yù)防也避不開(kāi)E3泛素連接酶這一關(guān)鍵元件。

2.2 E3泛素連接酶在免疫信號(hào)通路中的作用

研究發(fā)現(xiàn)，泛素化參與了Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)下游的NK-κB和分裂素激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活。例如TNF受體相關(guān)因子6(TRAF6)是含有RING結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶之一，通過(guò)與UBC13和UEV1A組成的E2泛素復(fù)合物結(jié)合，催化K63泛素化鏈的合成，合成的K63泛素化鏈進(jìn)一步導(dǎo)致TAK1激活，從而激活MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)；同時(shí)，K63泛素化鏈還能促進(jìn)TAK1對(duì)IKKβ的磷酸化導(dǎo)致IKK磷酸化NF-κB抑制劑(IKK phosphorylates NF-κB inhibitor, IκB)蛋白被F-box蛋白βTrCP(SCFβTrCP)識(shí)別，而SCFβTrCP也是E3泛素連接酶復(fù)合物的一個(gè)亞單位，泛素化作用于磷酸化后的IκB蛋白使其被蛋白酶體降解，使得NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核、開(kāi)啟靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)T細(xì)胞的增殖、存活和細(xì)胞因子的產(chǎn)生(Kanayamaetal., 2004; Sunetal., 2004; Liuetal., 2011; Wangetal., 2001)。

此外，另一種E3泛素連接酶TRAF3也能夠被招募到TLRs下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，通過(guò)激活TBK1和IKKε，導(dǎo)致干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3, IRF3)磷酸化和Ⅰ型干擾素(IFN)的產(chǎn)生(Hackeretal., 2006; Oganesyanetal., 2006)。值得一提的是，不同類型的泛素化可以協(xié)同作用來(lái)確定特定的信號(hào)輸出，例如在TLRs下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，由于不同TLR受體誘導(dǎo)的途徑不同，招募的泛素連接酶種類也不同，其中TLR4誘導(dǎo)激活的途徑中，幾種E3泛素連接酶介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抑制蛋白(cIAP)泛素化而促進(jìn)TRAF3的降解能夠激活MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而TLR介導(dǎo)的NK-κB的激活卻不需要TRAF3的降解(Tsengetal., 2010)。

泛素化在抗病毒感染方面作用的研究發(fā)現(xiàn)，在人類中，丙型肝炎病毒能夠使用病毒蛋白酶NS3-NS4A來(lái)切割線粒體膜上的抗病毒信號(hào)蛋白(MAVS)，從而幫助病毒逃避宿主免疫反應(yīng)造成持續(xù)性感染。但E3泛素連接酶包括三基序包含蛋白(tripartite motif-containing protein 25, TRIM25)、Riplet(也稱為RNF135)都能夠通過(guò)泛素化激活維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene Ⅰ, RIG-I)途徑，從而通過(guò)促進(jìn)MAVS的大量聚集誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型IFNs來(lái)抵御病毒感染(Lietal., 2005; Meylanetal., 2005; Gacketal., 2007; Houetal., 2011; Oshiumietal., 2009)。同樣，在細(xì)胞質(zhì)中DNA誘導(dǎo)的IFN途徑中，E3泛素連接酶TRIM56能夠通過(guò)刺激K63連接的干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)多泛素化而促進(jìn)TBK1的募集(Tsuchidaetal., 2010; Barber, 2011)。此外，E3泛素連接酶TRIM5在限制逆轉(zhuǎn)錄病毒感染中也起著關(guān)鍵性作用，TRIM5能夠通過(guò)泛素化病毒衣殼蛋白并針對(duì)降解來(lái)限制逆轉(zhuǎn)錄病毒，同時(shí)病毒衣殼蛋白能夠強(qiáng)烈刺激TRIM5合成游離的多泛素鏈，激活TAK1激酶復(fù)合體，啟動(dòng)先天免疫反應(yīng)(Xiaetal., 2009; Perteletal., 2011)。

此外，在哺乳動(dòng)物中的研究證實(shí)E3泛素連接酶介導(dǎo)的泛素化在抗原提呈、獲得性免疫中也發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。例如在小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)中，抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cells, APCs)表面MHC-Ⅱ類分子隨著DCs細(xì)胞逐漸成熟而不再泛素化，這加強(qiáng)了MHC Ⅱ的表達(dá)和聚集，增強(qiáng)了抗原提呈能力(Shinetal., 2006; van Nieletal., 2006)；兩種E2酶，UBC5和UBC13能夠與肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus, KSHV)E3泛素連接酶一起作用誘導(dǎo)表面MHC-Ⅰ類分子的內(nèi)吞，從而幫助病毒逃避細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷(Duncanetal., 2006)；在T細(xì)胞下游信號(hào)成分中E3泛素連接酶PELI1的缺失能夠?qū)е耇細(xì)胞的過(guò)度激活(Changetal., 2011)；類似的，在B細(xì)胞中已經(jīng)提出了泛素化介導(dǎo)的MAPK和非典型性NF-κB信號(hào)通路的激活機(jī)制，通過(guò)招募E3泛素連接酶TRAF2和cIAP，TRAF2通過(guò)K63泛素化鏈激活cIAPs，cIAP進(jìn)一步誘導(dǎo)K48泛素化鏈合成和TRAF3的降解，向胞漿中釋放MAPK激酶的信號(hào)復(fù)合體，隨后激活JNK和MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而TRAF3的降解能夠穩(wěn)定NF-κB誘導(dǎo)激酶(NIK)并使其磷酸化，NIK磷酸化后激活I(lǐng)KKα進(jìn)而磷酸化NF-κB前體P100，P100隨后被E3泛素連接酶復(fù)合物SCFβTrCP多泛素化，并被蛋白酶體加工成成熟的p52亞基。然后，p52與另一個(gè)NF-κB亞基REL-B一起發(fā)揮作用，啟動(dòng)對(duì)B細(xì)胞存活、成熟和激活至關(guān)重要的基因的表達(dá)(Neumannetal., 2007; Matsuzawaetal., 2008; Vallabhapurapuetal., 2008)。

2.3 E3泛素連接酶在病原體免疫逃逸中的作用

盡管許多病原體(如病毒和細(xì)菌等)缺乏經(jīng)典的泛素化系統(tǒng)，但為了自身生存，它們進(jìn)化中具備了通過(guò)基因流動(dòng)和/或趨同進(jìn)化而獲得泛素化相關(guān)成分的能力并利用泛素化調(diào)控宿主的免疫反應(yīng)，破壞宿主免疫系統(tǒng)，這反映出泛素化系統(tǒng)在免疫防御中的重要地位。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多病毒和細(xì)菌的E3泛素連接酶與宿主蛋白的序列相似，表明它們是通過(guò)基因轉(zhuǎn)移獲得的(Zhuetal., 2008; Quezadaetal., 2009; Jiangetal., 2011)。

一些病原體可以通過(guò)降解宿主關(guān)鍵性的E3泛素連接酶或是通過(guò)抑制泛素化途徑、甚至是利用泛素化系統(tǒng)來(lái)降解關(guān)鍵性靶標(biāo)蛋白等不同的方式，來(lái)阻斷宿主相關(guān)免疫反應(yīng)通路的激活。例如輪狀病毒蛋白NSP1通過(guò)誘導(dǎo)SCFβTrCP的降解阻斷NF-κB的激活(Graffetal., 2009)；沙門氏菌蛋白SseL具有去泛素化活性而抑制IκBα的泛素化(Le Negrateetal., 2008)；HIV蛋白Vpu則通過(guò)SCFβTrCP誘導(dǎo)CD4和骨髓基質(zhì)抗原2(bone marrow stromal antigen 2, BST2)的降解來(lái)控制HIV感染(Andrewetal., 2010)。此外，干擾素的分泌對(duì)于宿主的抗病毒反應(yīng)是十分重要的，副黏病毒V蛋白能夠通過(guò)組裝成為cullin-RING E3泛素連接酶復(fù)合體來(lái)招募STATs蛋白并對(duì)其泛素化，進(jìn)而誘導(dǎo)其降解、阻斷JAK/STAT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)免疫逃逸(Ramachandranetal., 2009)。

同樣，病原體也能夠通過(guò)去泛素化途徑來(lái)抑制相關(guān)免疫信號(hào)通路。例如克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus)的L蛋白氨基端具有一個(gè)OTU結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域已知能夠介導(dǎo)去泛素化反應(yīng)，OUT結(jié)構(gòu)域的表達(dá)抑制了TNF誘導(dǎo)的NF-κB通路的激活，并且抵消了體內(nèi)泛素樣蛋白ISG15的抗病毒活性(Frias-Stahelietal., 2007; Skaugetal., 2010)。此外，單純皰疹病毒1型(HSV-1)編碼的ICP0多功能蛋白具有泛素連接酶的活性，能夠招募細(xì)胞內(nèi)去泛素化蛋白酶USP7使得TRAF6和NEMO去泛素化，從而抑制了TLR-NF-κB通路(Daubeufetal., 2009)。

2.4 E3泛素連接酶在釋放病毒顆粒中的作用

拉薩病毒(LASV)和莫培亞病毒(MOPV)是關(guān)系密切的嚙齒類蟲(chóng)媒病毒，E3泛素連接酶ITCH雖不參與蟲(chóng)媒病毒Z蛋白的泛素化，但能夠與拉薩病毒和莫培亞病毒Z蛋白的PPxY結(jié)構(gòu)域相互作用，參與病毒的組裝和傳染性子代病毒的釋放(Bailletetal., 2019)。同樣，埃博拉病毒(EBOV)和馬爾堡病毒(MARV)的VP40基質(zhì)蛋白都能夠通過(guò)其PPxY-L型結(jié)構(gòu)域與E3泛素連接酶中的WW結(jié)構(gòu)域相互作用，以招募宿主的E3泛素連接酶Nedd4、進(jìn)而促進(jìn)病毒的復(fù)制和釋放(Hanetal., 2016)。

上述泛素化過(guò)程和E3泛素連接酶作用無(wú)論是縱向思考在宿主還是在病原生物中，或是橫向思考在免疫相關(guān)信號(hào)通路的激活和傳導(dǎo)、抗病毒感染、免疫逃逸、病毒顆粒的釋放等方面都發(fā)揮著極其關(guān)鍵且重要的作用，因此，借助E3泛素連接酶這一突破口，深刻認(rèn)知泛素化和E3泛素連接酶在蜱、病原及宿主動(dòng)物三者之間的作用尤為關(guān)鍵，可能為未來(lái)的蜱媒疾病的防控提供技術(shù)和策略。

2.5 E3泛素連接酶在節(jié)肢動(dòng)物免疫反應(yīng)中的存在、作用及展望

泛素對(duì)蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)已經(jīng)在模式生物中得到廣泛證實(shí)，并作為一種新的疾病干預(yù)療法在臨床上采用。但在媒介節(jié)肢動(dòng)物中，岡比亞按蚊Anophelesgambiae、埃及伊蚊Aedesaegypti、致倦庫(kù)蚊Culexquinquefasciatus、肩突硬蜱、人虱Pediculushumanus、長(zhǎng)紅錐蝽Rhodniusprolixus的基因組中泛素化途徑元件逐漸被發(fā)現(xiàn)，同樣是E3泛素連接酶的種類遠(yuǎn)比E1激活酶和E2結(jié)合酶多得多，但具體的泛素過(guò)程仍不清楚。與黑腹果蠅Drosophilamelanogaster、小鼠Musmusculus和人相比，這幾種媒介生物編碼的泛素相關(guān)基因比例相對(duì)較低，如肩突硬蜱中E1激活酶和HECT型E3泛素連接酶含量較低，這預(yù)示著蜱類中E3泛素連接酶以RING型為主，這是否表明蜱類對(duì)于泛素化功能的利用具有傾向性和特異性還有待證實(shí)(Choyetal., 2013) 。

研究已經(jīng)證實(shí)蜱蟲(chóng)叮咬可通過(guò)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、己糖激酶1(hexokinase, HK1)和磷酸丙糖異構(gòu)酶1(triosephosphate isomerase 1, TPI1)的差異性泛素化表現(xiàn)來(lái)調(diào)節(jié)宿主皮膚糖酵解途徑；同時(shí)，通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase kinase 1, MEK1)、26 S蛋白酶體亞基ATP酶3(26 S proteasome subunit ATPase 3, PSMC3)、蛋白酶體α亞基-6型(proteasome subunit alpha type-6, PSMA6)、MHC-Ⅱ和26 S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基1(26 S proteasome non-ATPase regulatory subunit, PSMD1)的差異泛素化來(lái)調(diào)節(jié)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ抗原提呈途徑以及HIF-1信號(hào)通路(Wangetal., 2020)。HEK 293 T細(xì)胞急性感染蜱媒蘭加特病毒(Langat virus, LGTV)時(shí)，ATK1或ATK2表達(dá)水平下降的同時(shí)，會(huì)上調(diào)AKT3和具有E3連接酶作用的凋亡抑制蛋白(如X連鎖凋亡抑制蛋白, XIAP)，這有助于逃避細(xì)胞裂解死亡造成持續(xù)感染(Kirschetal., 2020)。而凋亡抑制蛋白XIAP則是NF-κB和MAPK信號(hào)通路的重要作用靶點(diǎn)。在肩突硬蜱中，XIAP以p47為泛素化底物、調(diào)控著肩突硬蜱的免疫信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是肩突硬蜱IMD途徑的分子變阻器。p47表達(dá)的中斷能夠增加伯氏疏螺旋體和吞噬細(xì)胞無(wú)形體的定植(Severoetal., 2013; McClure Carrolletal., 2019)。雖然目前對(duì)于蜱類中泛素化及E3泛素連接酶的了解如同冰山一角，但也不難看出其在未來(lái)對(duì)于蜱媒疾病防控的重要作用。

3 結(jié)論

E3泛素連接酶及其控制的泛素化反應(yīng)，在調(diào)控媒介蜱類和宿主免疫反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路中起著至關(guān)重要的作用。對(duì)媒介蜱種的泛素化機(jī)制的利用是決定蜱媒病原在蜱內(nèi)的定植、復(fù)制、感染和傳播的關(guān)鍵效應(yīng)元件。通過(guò)E3泛素連接酶來(lái)進(jìn)一步了解和洞悉蜱類細(xì)胞免疫反應(yīng)和相應(yīng)泛素化機(jī)制對(duì)于進(jìn)一步控制蜱媒病原的感染和傳播具有極為重要的意義。泛素化途徑在蜱媒病原感染中識(shí)別和調(diào)控可望成為阻斷蜱媒病原傳播、開(kāi)發(fā)蜱媒疾病創(chuàng)新性防控策略的有效途徑，值得系統(tǒng)研究和深入探討。