李明利

（貴航安順醫(yī)院，貴州 安順 561000）

宮頸癌是女性的常見疾病之一，也是嚴(yán)重危害女性健康的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率和致死率均較高[1]。有研究表明，高危型人乳頭狀瘤病毒（HR-HPV）感染是誘發(fā)宮頸癌的重要因素[2]。誘捕受體3（DcR3）是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，可以阻斷細(xì)胞凋亡信號[3]。在本文中，筆者主要是分析宮頸癌組織DcR3 的表達(dá)與HR-HPV 感染的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 一般資料

回顧性分析我院2018 年12 月至2020 年12 月收治的80 例HR-HPV 感染患者（包括宮頸上皮內(nèi)瘤變患者38 例，宮頸癌患者42 例）的臨床資料。其納入標(biāo)準(zhǔn)是：知情并同意參與本研究；病情經(jīng)病理學(xué)檢查得到確診；病理資料完整。其排除標(biāo)準(zhǔn)是：存在認(rèn)知障礙。這些患者中年齡最大的64 歲，最小的26 歲，平均年齡（41.62±2.64）歲。將其中38 例宮頸上皮內(nèi)瘤變患者作為宮頸上皮內(nèi)瘤變組，將42 例宮頸癌患者作為宮頸癌組。選擇同期在我院接受體檢的36例健康體檢者作為正常宮頸組織組。三組人員的基線資料相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 試劑與方法

本研究中使用的試劑主要包括：SP 試劑盒（生工生物工程股份有限公司提供），鼠抗人DcR3 單克隆抗體（Santa Cruz 公司提供），HPV-DNA 分型檢測試劑盒（美國Digene 公司提供）。采用免疫組織化學(xué)法（SP 法）檢測各組人員宮頸組織中DcR3 蛋白的表達(dá)情況，為了確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行檢測操作，并嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作規(guī)程。檢出細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒，即證明檢測結(jié)果為陽性。采用2 代雜交捕獲法檢測HR-HPV 的感染情況，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行相關(guān)操作，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確。若樣本相對光單位/ 陽性對照光單位≥1.0，則判定為陽性。設(shè)計并合成靶向HR-HPV 16 E7 的siRNA，將含有靶向HR-HPV 16 E7 siRNA 的宮頸組織樣本作為實驗組，將未含有靶向HR-HPV 16 E7 siRNA 的宮頸組織樣本作為對照組，并設(shè)置空白組。將1.5×105/mL的樣本接種在6 孔板上，檢測siHa 細(xì)胞。將溫度設(shè)置為37 ℃，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將其置入10% 的胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基中，24 h 后進(jìn)行檢測。嚴(yán)格按照Trizol 的說明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA 的提取，用Primer 5.0軟件引物序列、PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.0% 瓊脂糖凝膠電泳，掃描成像，分析目的基因與參照基因擴(kuò)增條帶灰度值的比值。采用WB 法檢測HR-HPV 16 E7 基因沉默對DcR3 mRNA 和蛋白表達(dá)的影響。轉(zhuǎn)染48 h 后提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用BCA 法定量蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE。在PVDF 膜上應(yīng)用濃度為5%的瓊脂奶粉進(jìn)行封閉2 h，以特異性一抗4℃法孵育過夜，以IgG 二抗孵育2 h，然后進(jìn)行ECL 顯色處理。應(yīng)用MTT 法檢測siHa 細(xì)胞的增殖情況。取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種在96 孔板上，對細(xì)胞密度進(jìn)行調(diào)整，以3×105/ 孔為宜，每個孔有3 個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h 后每孔加入10 μL MTT 溶液。在37℃下，用濃度為5% 的二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行避光孵育，時間為4 h。離心取上清液，在每個孔中加入150μL DMSO 終止反應(yīng)，測定吸光度值，計算細(xì)胞存活率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

對本次研究中的數(shù)據(jù)均應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 21.0 進(jìn)行分析，計量資料用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同宮頸組織DcR3 蛋白的表達(dá)與HRHPV16/18 感染情況的關(guān)系

與正常宮頸組織組體檢者相比，宮頸上皮內(nèi)瘤變組患者宮頸組織DcR3 蛋白表達(dá)的陽性率、HRHPV 16/18 感染的陽性率均更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與宮頸上皮內(nèi)瘤變組患者相比，宮頸癌組患者宮頸組織DcR3 蛋白表達(dá)的陽性率、HRHPV 16/18 感染的陽性率均更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。宮頸癌組患者中HR-HPV 16/18 感染陽性患者宮頸組織DcR3 蛋白表達(dá)的陽性率為88.24%，HR-HPV 16/18 感染陰性患者宮頸組織DcR3 蛋白表達(dá)的陽性率為25.00%。宮頸癌組患者中HR-HPV 16/18 感染陽性患者宮頸組織DcR3 蛋白表達(dá)的陽性率顯著高于HR-HPV 16/18 感染陰性的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1、表2。這提示，宮頸癌組織DcR3 蛋白的表達(dá)與HR-HPV 16/18 感染呈正相關(guān)。

表1 不同宮頸組織DcR3 蛋白的表達(dá)與HR-HPV 16/18 感染情況的關(guān)系

表2 宮頸癌患者宮頸組織DcR3 蛋白表達(dá)與HR-HPV 16/18 感染的關(guān)系

2.2 轉(zhuǎn)染HR-HPV16E7siRNA 后HR-HPV16E7 mRNA 的表達(dá)

實 驗 組 樣 本HR-HPV 16 E7 mRNA 的 表 達(dá) 量低于空白組樣本和對照組樣本，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表3。這提示，靶向HR-HPV 16 E7 的siRNA 具有抑制HR-HPV 16 E7 mRNA 表達(dá)的作用。

表3 轉(zhuǎn)染HR-HPV 16 E7 siRNA 后HR-HPV 16 E7 mRNA的表達(dá)

2.3 HR-HPV16E7siRNA 對DcR3mRNA 及DcR3 蛋白表達(dá)的影響

實驗組樣本DcR3 mRNA 的表達(dá)量、DcR3 蛋白的表達(dá)量均低于空白組樣本和對照組樣本，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表4。這提示，HR-HPV 16 E7 siRNA 具有抑制DcR3 表達(dá)的作用。

表4 HR-HPV 16 E7 siRNA 對DcR3 mRNA 及DcR3 蛋白表達(dá)的影響

2.4 HR-HPV16E7siRNA 對siHa 細(xì)胞增殖的影響

進(jìn)行MTT 檢測的結(jié)果顯示，48 h 后實驗組樣本中siHa 細(xì)胞的存活率為（52.41±5.09）%，空白組樣本中siHa 細(xì)胞的存活率為（89.28±7.03）%，對照組樣本中siHa 細(xì)胞的存活率為（86.67±6.88）% ；實驗組樣本中siHa 細(xì)胞的存活率低于空白組樣本和對照組樣本，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這提示，HR-HPV 16 E7 siRNA 具有抑制siHa 細(xì)胞增殖的作用。

3 討論

DcR3 屬于TNF 家族的成員之一，不僅具有免疫抑制作用，還具有抗凋亡作用[4]。有研究表明，DcR3在肺、肝、胃等正常組織中呈低表達(dá)，而在惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，其可進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并可直接參與到腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中[5]。本研究的結(jié)果顯示，與正常宮頸組織組體檢者相比，宮頸上皮內(nèi)瘤變組患者宮頸組織DcR3 蛋白表達(dá)的陽性率、HRHPV 16/18 感染的陽性率均更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與宮頸上皮內(nèi)瘤變組患者相比，宮頸癌組患者宮頸組織DcR3 蛋白表達(dá)的陽性率、HRHPV 16/18 感染的陽性率均更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。宮頸癌組患者中HR-HPV 16/18 感染陽性患者宮頸組織DcR3 蛋白表達(dá)的陽性率顯著高于HR-HPV 16/18 感染陰性的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實 驗 組 樣 本HR-HPV 16 E7 mRNA的表達(dá)量、DcR3 mRNA 的表達(dá)量、DcR3 蛋白的表達(dá)量均低于空白組樣本和對照組樣本，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在轉(zhuǎn)染48 h 后，實驗組樣本中siHa細(xì)胞的存活率低于空白組樣本和對照組樣本，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這表明，宮頸癌組織DcR3的表達(dá)與HR-HPV 16/18 感染呈正相關(guān)，靶向HRHPV 16 E7 的siRNA 能夠明顯抑制HR-HPV 16 E7 mRNA、DcR3 的表達(dá)。

綜上所述，宮頸癌組織DcR3 的高表達(dá)與HRHPV 感染率的增加有關(guān)，HR-HPV 感染率越高，宮頸癌組織DcR3 的表達(dá)水平就越高。靶向HR-HPV 16 E7 的siRNA 具有抑制DcR3 轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的作用，同時還能夠抑制siHa 細(xì)胞的增殖和癌變。臨床醫(yī)生應(yīng)對上述情況予以關(guān)注。