聶紫玉，吳艷陽(yáng)，王增光，李子晗，康文麗，潘麗娜，汪家琦，戴智勇，趙玲艷,*，鄧放明,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.澳優(yōu)乳業(yè)（中國(guó)）有限公司，人體微生態(tài)制品湖南省工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410200）

聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織將益生菌定義為“劑量充足時(shí)，對(duì)宿主健康有益的活的微生物”。對(duì)于益生菌的研究，從1899年發(fā)現(xiàn)到目前已有122 年。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013—2017年，全球益生菌市場(chǎng)價(jià)值由320.6億 美元增至3 472.51億 美元，增長(zhǎng)近10 倍。2017—2020年，中國(guó)益生菌產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)價(jià)值由559億 元增至850億 元，發(fā)展迅速。益生菌具有對(duì)抗腸道病原菌與致病微生物菌群競(jìng)爭(zhēng)黏連的獨(dú)特能力，可以與致病性微生物群競(jìng)爭(zhēng)黏附位點(diǎn)進(jìn)而疏遠(yuǎn)病原體，或通過在宿主腸道外激活特定基因刺激和調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)；益生菌還被證明可以調(diào)節(jié)脂肪貯存和刺激腸道血管生成、維持腸道菌群的穩(wěn)定、減少乳糖不耐癥、預(yù)防抗生素誘發(fā)的腹瀉、預(yù)防結(jié)腸癌、提高免疫力、降膽固醇、治療抑郁癥、帕金森癥等與大腦神經(jīng)中樞有關(guān)的疾病等；且近年來病毒感染頻發(fā)，有相關(guān)研究表明益生菌或可與病毒發(fā)生拮抗。因此，益生菌研究是食品和醫(yī)藥領(lǐng)域熱門課題。

乳酸菌是最常見的益生菌，其來源廣泛，可從人類、動(dòng)物、植物和環(huán)境中分離出來。傳統(tǒng)上，大多數(shù)益生菌來自腸道。發(fā)酵蔬菜是一種以蔬菜為原料，利用微生物進(jìn)行發(fā)酵的冷加工方式。我國(guó)自公元前3世紀(jì)就已有發(fā)酵蔬菜的生產(chǎn)，且發(fā)酵蔬菜種類繁多。自然發(fā)酵蔬菜制品是一個(gè)較為復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境，其微生物菌群組成既有優(yōu)勢(shì)菌群存在的共性，也有樣品特異性。在蔬菜的起始發(fā)酵和主發(fā)酵階段，占優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌包括腸膜狀明串珠菌、短乳桿菌、啤酒片球菌、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌以及糞鏈球菌等，乳酸菌是所有自然發(fā)酵蔬菜中最主要的微生物菌群，因此，發(fā)酵蔬菜是重要的乳酸菌分離源，從植物源中分離的乳酸菌主要用作發(fā)酵劑或益生菌，目前對(duì)植物源益生菌研究較多的是韓國(guó)泡菜，而有關(guān)中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的報(bào)道較少。植物源乳酸菌相對(duì)于動(dòng)物源乳酸菌具有更高的安全性，但由于分離源的特殊性，植物源乳酸菌能否適應(yīng)人體腸道環(huán)境和表現(xiàn)出益生功能需要進(jìn)行研究。潛在益生菌篩選的主要指標(biāo)包括：對(duì)胃酸的耐受性、腸道膽鹽的耐受性、以及對(duì)潛在致病性微生物的抗菌性、抗生素的藥物敏感性等。對(duì)于選擇具有特定作用的益生菌菌株，還可以考慮一些額外的益生菌特性，如降低膽固醇的能力、抗炎抗氧化活性或?qū)Π┘?xì)胞的細(xì)胞毒性作用。工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵蔬菜時(shí)，一般接種發(fā)酵劑，以確保發(fā)酵的高效性和安全性，而家庭制備發(fā)酵蔬菜都是自然發(fā)酵，沒有受到商業(yè)益生菌的干擾。本實(shí)驗(yàn)從農(nóng)家制備的傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中分離乳酸菌，并進(jìn)行一系列益生特性的初步研究及菌種鑒定，旨在開發(fā)具益生潛力的中國(guó)本土植物源乳酸菌菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRS固體瓊脂培養(yǎng)基、改良MC培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒、技術(shù)瓊脂粉、牛膽鹽、血平板、賴（酪/組/精）氨酸脫羧酶與氨基酸脫羧酶對(duì)照試劑盒廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；抗菌藥物藥敏紙片杭州微生物試劑有限公司；鹽酸、氯化鈉、丙三醇、無(wú)水乙醇、瓊脂糖 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 東京化成工業(yè)株式會(huì)社；48、96 孔板無(wú)錫耐思生命科技股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒、針式濾菌器 美國(guó)默克公司；電泳純化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物 上海派森諾生物科技有限公司；D4030A dNTP、DRR20AM TaKaRa LA聚合酶 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-2F pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器有限公司；ULTS1368超低溫冰箱 美國(guó)賽默飛世爾公司；全套精密移液槍 德國(guó)艾本德股份公司；SQ810C自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器 重慶雅瑪拓科技有限公司；YP-B10002電子天平 上海光正醫(yī)療儀器有限公司；HCB-1300V潔凈工作臺(tái) 青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；CX31光學(xué)顯微鏡 日本奧林巴斯株式會(huì)社；Heraeus MultifugeX1R高速冷凍離心機(jī)、渦旋振蕩儀 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；SPL250生化培養(yǎng)箱 天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；TECAN spark多功能酶標(biāo)儀 西安縱橫儀器科技有限公司；MNT-150游標(biāo)卡尺 上海美耐特實(shí)業(yè)有限公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；Mini Pro 300V Power Supply電泳儀 美國(guó)Major Science公司；Labnet Sub System 70電泳槽 美國(guó)萊伯特公司；UV-1801分光光度計(jì) 北京北分瑞利分析儀器（集團(tuán)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離與形態(tài)學(xué)鑒定

從中國(guó)不同地區(qū)采集農(nóng)戶按傳統(tǒng)方法自制的發(fā)酵蔬菜。采樣時(shí)用無(wú)菌鑷子取足量樣品至100 mL無(wú)菌管內(nèi)，密封，暫存于低溫采樣箱中，隨后送回實(shí)驗(yàn)室。在超凈臺(tái)中用無(wú)菌鑷子取適量樣品于無(wú)菌生理鹽水中浸泡，用滅菌生理鹽水進(jìn)行10 倍梯度稀釋。選取合適濃度的3 個(gè)梯度，各取0.1 mL稀釋液，在含有碳酸鈣的MC培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布。生長(zhǎng)48 h后挑選有融鈣圈且表面光滑的白色、淡黃色菌落劃線至MRS培養(yǎng)基，反復(fù)劃線至純，待長(zhǎng)出后挑選單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢。革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性且鏡檢菌體外圍無(wú)半透明薄膜、無(wú)芽孢的判定為乳酸菌。將其菌落挑選至MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，與40%甘油按1∶1保藏至-80 ℃冰箱中。

1.3.2 乳酸菌耐酸性篩選

初篩：菌株活化2 代后，培養(yǎng)12 h，以2%接種量接入用濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH 3.0的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h后肉眼觀察是否有顯著沉淀且搖勻后培養(yǎng)液是否顯著渾濁。記錄渾濁的菌株編號(hào)進(jìn)行復(fù)篩。

復(fù)篩：菌株活化至穩(wěn)定，培養(yǎng)12 h后，按1%的接種量接入用濃硫酸調(diào)節(jié)至pH 2.5的酸性MRS培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)0 h和4 h后進(jìn)行稀釋涂布，待菌落長(zhǎng)出后進(jìn)行計(jì)數(shù)，按式（1）計(jì)算存活率，并按照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》方法分別進(jìn)行活菌數(shù)計(jì)算，平行3 次。

1.3.3 乳酸菌耐膽鹽能力篩選

菌株培養(yǎng)至穩(wěn)定，培養(yǎng)12 h后，取6 mL培養(yǎng)液倒入無(wú)菌離心管中，12 000 r/min離心8 min，去除上清液，用生理鹽水反復(fù)洗滌沉淀物表面，去除雜質(zhì)，然后加入含0.3%牛膽鹽的生理鹽水7 mL，制成菌懸液，分別于0 h和2 h進(jìn)行稀釋涂布，培養(yǎng)48 h后平板計(jì)數(shù)，按式（2）計(jì)算存活率，并按照GB 4789.2—2016方法分別進(jìn)行活菌數(shù)計(jì)算，平行3 次。

1.3.4 16S rDNA鑒定

按試劑盒步驟提取DNA后進(jìn)行擴(kuò)增，乳酸菌引物為通用引物（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT），經(jīng)過電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物后，送至上海派森諾生物科技股份有限公司測(cè)序。綜合測(cè)序峰圖將測(cè)序結(jié)果截取800 bp的區(qū)域，將測(cè)序得到的序列在NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）中比對(duì)，選擇相似度最大的序列作為物種鑒定結(jié)果。

1.3.5 乳酸菌藥敏性實(shí)驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法，菌株活化3 代離心后棄去上清液，再用生理鹽水重懸得到菌懸液。采用比濁法調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1×10CFU/mL左右（＝0.5±0.05），吸取1 mL菌懸液于培養(yǎng)皿中，倒入15 mL固體培養(yǎng)基（50 ℃），混勻，待培養(yǎng)基凝固后，在每個(gè)培養(yǎng)皿中均勻放置3 張藥敏紙片，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后測(cè)量抑菌圈直徑，并根據(jù)表1標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥物敏感性判定。

表1 微生物藥物敏感實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for microbial drug susceptibility test

1.3.6 乳酸菌抑菌實(shí)驗(yàn)

采用瓊脂擴(kuò)散法。平板中倒入15 mL融化的素瓊脂（2%），待其充分冷卻凝固后，放入已滅菌的牛津杯數(shù)個(gè)，并按一定次序排列整齊。將指示菌稀釋成合適濃度菌懸液，取該菌懸液l mL與15 mL經(jīng)融化后保持在45 ℃左右的MRS培養(yǎng)基迅速混合均勻，冷卻后用無(wú)菌鑷子取出牛津杯，即形成若干孔洞。分別向孔洞里加入等量待檢菌的離心上清液，37 ℃培養(yǎng)12 h，游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.7 乳酸菌溶血性實(shí)驗(yàn)

取血瓊脂培養(yǎng)基，采用點(diǎn)種法，中心以金黃色葡萄球菌為對(duì)照，外圍取實(shí)驗(yàn)乳酸菌菌點(diǎn)種3 次。37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察實(shí)驗(yàn)菌與對(duì)照菌溶血情況。

1.3.8 乳酸菌氨基酸脫羧酶活性實(shí)驗(yàn)

試劑盒法：菌株活化3 代，培養(yǎng)18 h后，取0.05 mL菌液添加至不同試劑瓶中，并加0.5 mL滅菌液體石蠟封層。37 ℃培養(yǎng)18～24 h后根據(jù)說明書觀察變色情況。

氨基酸脫羧酶基因、毒力因子檢測(cè)：參考黃曉棠方法；精氨酸脫羧酶氨基因、毒力因子引物引自文獻(xiàn)[30-32]。

1.3.9 乳酸菌DPPH自由基清除能力測(cè)定

制備菌懸液，采用比濁法調(diào)節(jié)濃度至1×10CFU/mL。配制DPPH-無(wú)水乙醇溶液0.2 mmol/L，并進(jìn)行無(wú)菌過濾。在避光環(huán)境中，按樣品+DPPH（）、樣品+無(wú)水乙醇（）、純水+DPPH（）分組加入48 孔板中，每組3 個(gè)孔。避光反應(yīng)40 min后，收集液體，離心后取上清液，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。DPPH自由基清除率計(jì)算如下：

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用方差分析和最小顯著差異法，＜0.05，差異顯著。分析、計(jì)算分別采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件和Origin 2018 64Bit。所有測(cè)定均為3 次重復(fù)取平均。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌耐酸能力分析

益生菌要在腸道中發(fā)揮作用，必須通過胃液環(huán)境。人體空腹時(shí)胃液pH值約為1.3～2.0，進(jìn)食后pH值約為3.0～5.0。益生菌必須在pH 3.0的條件下存活1.5～2 h，故篩選植物源潛在益生菌在胃腸道中的生存和持久性至關(guān)重要。由于菌種數(shù)目過多，為有效篩選耐酸的乳酸菌，實(shí)驗(yàn)初期采用pH 3.0的培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，通過肉眼觀察培養(yǎng)基是否渾濁，獲得沉淀明顯乳酸菌82 株。82 株菌經(jīng)pH 2.5 MRS培養(yǎng)得乳酸菌49 株（表2）。其中577、602、722、933、755、578、580、582、584、592、594、601這12 株菌在pH 2.5 MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后活菌數(shù)較之前增加，表明具有極強(qiáng)的耐酸能力。

表2 菌株對(duì)pH 2.5 MRS培養(yǎng)基的耐受能力Table 2 Survival of strains in MRS medium at pH 2.5

2.2 乳酸菌耐膽鹽能力結(jié)果

正常人小腸內(nèi)膽鹽質(zhì)量濃度在0.3～3.0 g/L之間。高濃度膽鹽可以拮抗益生菌的生長(zhǎng)，因?yàn)樗鼈儠?huì)改變細(xì)胞膜的通透性，分解膜蛋白，從而導(dǎo)致細(xì)胞破裂和死亡。經(jīng)pH 2.5 MRS培養(yǎng)得到的49 株乳酸菌進(jìn)行耐膽鹽實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)49 株乳酸菌均具有耐膽鹽能力，可見耐酸菌株同時(shí)具備耐膽鹽能力，耐酸與耐膽鹽之間可能有某種聯(lián)系機(jī)制。其中來自不同樣品的19 株菌株實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。19 株菌中有13 株耐膽鹽能力極強(qiáng)，2 h后活菌數(shù)增加（577、602、664、674、722、6-12、H3D、856、729、727、z1-11、z1-6、z22）（＜0.05）。

表3 菌株對(duì)0.3%牛膽鹽溶液的耐受能力Table 3 Tolerance of strains to 0.3% bovine bile salt solution

2.3 乳酸菌菌株形態(tài)及鑒定結(jié)果

表4 乳酸菌來源及鑒定結(jié)果Table 4 Sources and identification of lactic acid bacteria

將挑選出的19 株乳酸菌進(jìn)行16S rDNA，鑒定結(jié)果見表4。由于菌株來源于發(fā)酵蔬菜，所以大部分菌株為植物乳桿菌及發(fā)酵乳桿菌，嫩江桿菌、戊糖片球菌、利莫西桿菌、戊糖乳桿菌、屎腸球菌、短乳桿菌分別各1 株。其中577為嫩江桿菌，為中國(guó)特有乳酸菌種，因首次分離于黑龍江省嫩江縣而得名，1 株從酸菜中分離的嫩江桿菌被證實(shí)具有較強(qiáng)低溫降解亞硝酸鹽的能力，但幾乎沒有關(guān)于其益生特性的研究。z1-11為屎腸球菌，其一般分離自動(dòng)物，植物源屎腸球菌較少見。胡勇等從青海自然生長(zhǎng)的植物花朵中分離鑒定出10 株乳酸菌，其中包括屎腸球菌。利莫西發(fā)酵乳桿菌是乳酸桿菌科中的一種厚壁菌，1 株來源于母乳的利莫西發(fā)酵乳桿菌被臨床證實(shí)有抗炎功效。

2.4 乳酸菌安全特性分析

益生菌理論上可能導(dǎo)致全身性感染、有害代謝活動(dòng)、易感個(gè)體過度免疫刺激和輕微胃腸道不適癥狀4 種副作用。需注意的是，每一種益生菌菌株，包括那些尚未開發(fā)的，都可能有不同的安全特性。故對(duì)各菌進(jìn)行安全性測(cè)評(píng)尤為重要。

2.4.1 乳酸菌對(duì)抗生素的耐藥性

益生菌中的抗生素耐藥基因可轉(zhuǎn)移到某些病原體上，導(dǎo)致病原體耐藥性提高。因此，對(duì)各菌株進(jìn)行全面的藥敏測(cè)試以了解其藥敏譜是非常必要的。從表5可看出，本實(shí)驗(yàn)供試菌株除729、933外，都對(duì)青霉素類的苯唑西林表現(xiàn)敏感，這與Charteris等發(fā)現(xiàn)乳酸菌對(duì)青霉素和頭孢菌素類藥物敏感的結(jié)果相同。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，供試菌株有63.16%對(duì)頭孢類供試藥物表現(xiàn)敏感，且乳酸菌對(duì)第1代頭孢菌素的敏感性普遍高于第3代產(chǎn)品，與相關(guān)報(bào)道一致。19 株菌都對(duì)紅霉素表現(xiàn)敏感或中介，紅霉素作為廣譜抗生素的抑菌效果已被多次報(bào)道證實(shí)。供試菌株只有577、602、664、662、6d-16這5 株菌對(duì)供試的氨基糖苷類藥物表現(xiàn)敏感，據(jù)報(bào)道，乳酸菌通常對(duì)氨基糖苷類（慶大霉素、卡那霉素和鏈霉素）耐藥，因?yàn)榘被擒盏臄z取是由細(xì)胞色素介導(dǎo)的電子傳遞，而這在厭氧菌（包括乳酸菌）中不存在。供試菌株對(duì)四環(huán)素類藥物中的米諾環(huán)素和多西環(huán)素均較敏感，大多數(shù)菌株四環(huán)素較敏感，但個(gè)別菌株對(duì)四環(huán)素表現(xiàn)出一定的耐藥性，這與Dec等研究中乳酸菌對(duì)四環(huán)素耐藥性大于多西環(huán)素的結(jié)果相似。

綜合上述結(jié)果，供試乳酸菌對(duì)多種藥物具有敏感性，其中664、662、577、602、6d-16對(duì)20 種藥物均敏感。

2.4.2 乳酸菌抑菌能力

供試菌株對(duì)李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌能力的檢測(cè)結(jié)果見表6，可見19 株菌對(duì)3 種典型致病菌具有不同程度的抑制能力（＜0.05）。所有菌株對(duì)李斯特菌的抑菌直徑在（14.95±0.62）mm以上，最高達(dá)到（23.65±0.60）mm，表明具有極強(qiáng)的抑菌作用；所有菌株對(duì)大腸桿菌的抑菌直徑在（10.98±0.27）～（21.24±0.25）mm之間，表明具有較強(qiáng)的抑菌作用；所有菌株對(duì)大腸桿菌的抑菌直徑在（15.38±0.32）～（25.50±0.12）mm之間，表明具有極強(qiáng)的抑菌作用。

表5 菌株對(duì)抗生素的耐藥性Table 5 Antibiotic susceptibility of strains

表6 乳酸菌對(duì)致病菌的抑菌直徑Table 6 Inhibition zone diameter of lactic acid bacteria against pathogenic bacteria

抑菌性是益生菌的重要特性之一，乳酸菌對(duì)病原菌不僅有抑制效果，而且能削弱病原菌的毒力，是制備發(fā)酵劑和食品生物防腐劑的理想選擇。乳酸菌的抗菌活性主要來源于其代謝產(chǎn)生的HO、有機(jī)酸（乳酸、乙酸和甲酸）、蛋白質(zhì)類化合物、小分子肽及乳酸。乳酸菌在宿主腸道中定植后，會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子自由基并通過呼吸作用轉(zhuǎn)化為毒性較小的過氧化氫，過氧化氫的持續(xù)積累抑制了其他細(xì)菌的生長(zhǎng)；一些非均相發(fā)酵的乳酸菌通過代謝己糖產(chǎn)生CO，降低環(huán)境中氧氣濃度，產(chǎn)生厭氧環(huán)境，抑制有害需氧細(xì)菌的生長(zhǎng)；乳酸菌還能通過糖酵解代謝檸檬酸產(chǎn)生雙乙酰，抑制多種有害微生物。

2.4.3 乳酸菌溶血性分析

圖1 菌株溶血性觀察結(jié)果Fig. 1 Hemolytic activity observation of strains

一些菌株在血平板上培養(yǎng)時(shí)，菌落周圍會(huì)形成明顯的透明溶血環(huán)，根據(jù)使綿羊血細(xì)胞瓊脂溶血的能力分類為完全溶血（β溶血）、部分溶血（α溶血）和不溶血（γ溶血），α溶血的鏈球菌呈現(xiàn)半透明草綠色溶血環(huán)，β溶血的鏈球菌呈現(xiàn)透明溶血環(huán)，大多數(shù)溶血性菌株是致病性的。供試菌株的溶血性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，可看出平板中心的指示菌（金黃色葡萄球菌）產(chǎn)生了明顯的溶血環(huán)，而周圍的3 個(gè)供試菌株的菌落無(wú)溶血環(huán)，故19 株菌皆無(wú)溶血性。一般認(rèn)為乳酸菌屬是安全的共生菌，缺乏溶血素，不會(huì)產(chǎn)生機(jī)會(huì)性毒力，符合食品安全的要求。

2.4.4 乳酸菌氨基酸脫羧酶活性

食品中的生物胺大部分由微生物脫羧氨基酸形成，它的產(chǎn)生需耍3 個(gè)條件：足夠的氨基酸、有氨基酸脫羧酶活性的微生物和利于微生物生長(zhǎng)的低酸環(huán)境。常見產(chǎn)生物胺菌株有乳酸桿菌屬、腸桿菌屬、腸球菌屬和乳桿菌屬。適量生物胺有利于人體的正常生理活動(dòng)，一旦過量則會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不利影響，故產(chǎn)生物胺能力也是選擇發(fā)酵乳酸菌和益生菌的標(biāo)準(zhǔn)之一。由于對(duì)人體健康威脅較大的組胺、酪胺、腐胺和尸胺的前提物質(zhì)分別為組氨酸、酪氨酸、精氨酸與賴氨酸，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)供試菌株這4 種氨基酸脫羧酶活性進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)722、647、z1-6、729、6-12、577、yz16-3、856的精氨酸脫羧酶呈陽(yáng)性（圖2），其余皆為陰性。

圖2 精氨酸脫羧酶陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果Fig. 2 Evaluation of arginine decarboxylase activity of strains

精氨酸脫羧酶可與腐胺、精胺、亞精胺的生成有關(guān)。氨基酸脫羧酶試劑瓶顯色是一種簡(jiǎn)便快速的方法，卻也有一定的局限性，易受環(huán)境影響，為進(jìn)一步確定菌株是否具有氨基酸脫羧酶活性，利用PCR法在基因?qū)用鎸?duì)試劑瓶陽(yáng)性的菌株進(jìn)行檢測(cè)。基因擴(kuò)增電泳圖（圖3）顯示，8 株乳酸菌均不攜帶氨基酸脫羧酶基因（精氨酸脫羧酶基因；組氨酸脫羧酶基因、、；酪氨酸脫羧酶基因、、）及毒力因子（asal、esp、ace、gelE、cylA、cylB、cylM）。

圖3 乳酸菌基因擴(kuò)增電泳圖Fig. 3 Electrophoretic patterns of amplified lactic acid bacterial genes

2.5 乳酸菌體外抗氧化能力

DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)是目前乳酸菌的抗氧化作用研究中最常用的方法，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，乳酸菌的DPPH自由基清除率高于40%則可認(rèn)為其體外抗氧化能力較強(qiáng)。由圖4可看出，z1-6、H3D、856、6D-16、z1-11的DPPH自由基清除率分別為（45.28±5.43）%、（43.01±6.58）%、（46.52±2.51）%、（51.07±6.50）%、（59.41±0.32）%（＜0.05），表明體外抗氧化能力較強(qiáng)，可考慮用作進(jìn)一步抗氧化研究。

圖4 各菌株對(duì)DPPH自由基的清除效果Fig. 4 DPPH radical scavenging effect of each strain

3 結(jié) 論

以傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中分離的乳酸菌為出發(fā)菌株，經(jīng)pH 3.0 MRS培養(yǎng)得乳酸菌82 株，再經(jīng)pH 2.5 MRS培養(yǎng)得乳酸菌49 株；49 株菌經(jīng)0.3%膽鹽測(cè)試，均具有耐膽鹽能力，表明植物源乳酸菌具有益生菌的基本特性；根據(jù)鏡檢形態(tài)結(jié)合植物源發(fā)酵樣品的不同，從耐酸耐膽鹽菌株中挑選19 株乳酸菌，經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)、形態(tài)觀察和16S rDNA鑒定，7 株為發(fā)酵乳桿菌、6 株為植物乳桿菌，嫩江桿菌、戊糖片球菌、利莫西桿菌、戊糖乳桿菌、屎腸球菌、短乳桿菌分別各1 株，其中577為嫩江桿菌，屬中國(guó)特有乳酸菌種屬。19 株乳酸菌對(duì)所選20 種抗生素多數(shù)表現(xiàn)敏感，其中4 株菌對(duì)20 種抗生素都較敏感，部分菌株對(duì)氨基糖苷類表現(xiàn)出一定抗藥性，可能由于氨基糖苷類藥物本身特點(diǎn)是對(duì)厭氧菌和腸球菌無(wú)效，對(duì)李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑制能力，且在血平板中均沒有表現(xiàn)出溶血性；經(jīng)氨基酸脫羧酶活性試劑盒結(jié)合PCR擴(kuò)增檢測(cè)表明無(wú)產(chǎn)生物胺的潛在威脅；以上研究表明19 株菌具有益生菌的安全特性；體外DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中，有5 株菌體外抗氧化能力高于40%；綜上所述，該19 株菌均可做為潛在益生菌。由此可見，我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜是益生菌選育的重要來源之一。