晉湘宜，趙 婷，王家勝，李 良，李俊薇，陳茂彬，方尚玲,*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068；2.黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北 武漢 430050）

己酸菌是經(jīng)培養(yǎng)能夠生成己酸的一類微生物的統(tǒng)稱。目前從濃香型白酒窖泥中篩選出的己酸菌主要是以乙醇為底物合成己酸的微生物，如克氏梭菌（）、速生梭菌（）、酪酸梭菌（），以及以乳酸為底物合成己酸的微生物，如瘤胃菌（Ruminococcaceae）。近幾年朱曉軍等也從窖泥中分離出1 株葡萄糖營養(yǎng)型的己酸菌，屬于瘤胃球菌科梭菌屬。

濃香型白酒的生產(chǎn)是多種微生物協(xié)同作用的過程，酵母是完成乙醇發(fā)酵的主體微生物，己酸菌利用酵母代謝生成的乙醇及其他微生物生成的有機(jī)酸合成己酸，己酸與乙醇酯化形成濃香型白酒的特征風(fēng)味物質(zhì)己酸乙酯。研究己酸菌與酵母之間的相互作用對探究濃香型白酒發(fā)酵機(jī)理有重大意義。濃香型白酒的生產(chǎn)是利用高粱等谷物原料邊糖化邊發(fā)酵的過程，谷物原料經(jīng)蒸煮糊化后拌曲入窖池密封發(fā)酵。隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，酒醅中的淀粉、葡萄糖、乙醇、有機(jī)酸等物質(zhì)滲入窖泥，為窖泥中的微生物補(bǔ)充生長所需的營養(yǎng)成分。在不同營養(yǎng)條件下研究釀酒酵母（）對己酸菌己酸代謝的影響，更接近兩種微生物在窖池中的實(shí)際情況，有助于解析濃香型白酒實(shí)際生產(chǎn)過程中己酸菌與酵母的代謝情況。

目前關(guān)于己酸菌與酵母間互作關(guān)系的研究主要集中于己酸菌代謝產(chǎn)物對的影響、添加對己酸菌產(chǎn)酸的影響等方面。而針對不同碳源條件下對己酸菌的影響及其機(jī)理的研究較少。以實(shí)驗(yàn)室前期從窖泥中篩選得到的1 株可產(chǎn)己酸的JSJ-1和C-1為研究對象，在葡萄糖為唯一碳源和乙醇、葡萄糖為碳源這2 種營養(yǎng)條件下，比較2 種微生物純培養(yǎng)、共培養(yǎng)過程中生長代謝（菌落數(shù)、葡萄糖、乙醇、丁酸、己酸）的差異，分析對己酸菌己酸代謝的影響及其機(jī)理，旨在對濃香型白酒的發(fā)酵過程有更加深入的認(rèn)識，為進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝提供一定理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

分離自濃香型白酒廠優(yōu)質(zhì)老窖泥，命名為JSJ-1，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2020881；命名為C-1，實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

乙醇乙酸鈉（sodium ethyl acetate，ES）培養(yǎng)基：酵母膏1 g、無水乙酸鈉0.5 g、硫酸銨0.05 g、MgSO·7HO 0.02 g、KHPO0.04 g、蒸餾水100 mL，滅菌后加入無水乙醇2 mL、干熱滅菌后CaCO1 g。

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母膏1 g、蛋白胨2 g、葡萄糖2 g、水100 mL。

復(fù)合培養(yǎng)基A：葡萄糖4 g、酵母膏1 g、無水乙酸鈉0.5 g、硫酸銨0.05 g、MgSO·7HO 0.02 g、KHPO0.04 g、蒸餾水100 mL。

復(fù)合培養(yǎng)基B：葡萄糖0.5 g、酵母膏1 g、無水乙酸鈉0.5 g、硫酸銨0.05 g、MgSO·7HO 0.02 g、KHPO0.04 g、蒸餾水100 mL。滅菌后加入無水乙醇2 mL、干熱滅菌后的CaCO1 g。

1.1.3 試劑

酵母膏、無水乙酸鈉、無水硫酸鈉、無水乙醇、葡萄糖、CaCO、氯化鈉、硫酸銨、MgSO·7HO、KHPO、二氯甲烷（均為分析純），乙酸、丁酸、己酸（均為色譜純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2.5 L圓底立式厭氧培養(yǎng)袋 青島高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園海博生物科技有限公司；厭氧產(chǎn)氣袋 日本三菱公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器有限公司；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；WFJ 2000分光光度計(jì) 江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；5977B-7890B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；SBA-40D生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

JSJ-1種子液的制備：JSJ-1種子液的培養(yǎng)使用18 mm×180 mm的試管，裝液量為30 mL。將JSJ-1斜面接種到ES培養(yǎng)基，用封口膜密封，34 ℃靜置培養(yǎng)7 d。

C-1種子液的制備：將C-1斜面接種到裝有YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于30 ℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)16 h。

1.3.2 不同營養(yǎng)條件下C-1對JSJ-1生長及代謝的影響

1.3.2.1 葡萄糖為碳源

在ES培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上使用不同用量葡萄糖替換乙醇，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別設(shè)置為1%、2%、3%、4%、5%。將接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，檢測乙醇含量。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，乙醇添加量為體積分?jǐn)?shù)2%時(shí)最適合產(chǎn)己酸。故選擇C-1發(fā)酵3 d乙醇約為16 g/L的葡萄糖含量作為下一步C-1與JSJ-1共同培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中葡萄糖含量，培養(yǎng)基命名為復(fù)合培養(yǎng)基A。然后在此培養(yǎng)基中將C-1與JSJ-1種子液按體積比2∶1同時(shí)接入，總接種量為5%。C-1與JSJ-1相同情況下單獨(dú)培養(yǎng)作為對照組。培養(yǎng)條件均同己酸菌種子液的培養(yǎng)。培養(yǎng)9 d，定期取樣檢測。

1.3.2.2 葡萄糖和乙醇為碳源

為探究在葡萄糖和乙醇同時(shí)存在時(shí)，C-1除提供底物和消耗氧氣外對JSJ-1的生長代謝是否還存在其他影響。在ES培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加0.5%葡萄糖作為共培養(yǎng)培養(yǎng)基，命名為復(fù)合培養(yǎng)基B。

由交叉劃線觀察C-1對JSJ-1生長的影響：在復(fù)合培養(yǎng)基B固體平板上，將JSJ-1和C-1分別采用不同的劃線順序接種，34 ℃厭氧培養(yǎng)4 d后觀察兩種菌的生長情況。將接種好的平板倒置放入2.5 L厭氧培養(yǎng)袋，放入1 包厭氧產(chǎn)氣袋，迅速密封提供厭氧環(huán)境。

液體共培養(yǎng)探究C-1對JSJ-1生長及代謝的影響：將培養(yǎng)好的JSJ-1種子液與C-1種子液按體積比為1∶2同時(shí)接種到復(fù)合培養(yǎng)基B，接種量為5%。C-1與JSJ-1相同條件下分別單獨(dú)培養(yǎng)作為對照組。培養(yǎng)條件均同JSJ-1種子液的培養(yǎng)。培養(yǎng)12 d，定期取樣檢測。

1.3.3 菌落數(shù)的測定

定期取發(fā)酵液，用生理鹽水梯度稀釋后取100 μL涂布于復(fù)合培養(yǎng)基B固體平板上，倒置裝入2.5 L立式厭氧培養(yǎng)袋，加入1 包厭氧產(chǎn)氣袋，迅速密封。置于培養(yǎng)箱內(nèi)，34 ℃培養(yǎng)4 d，分別記錄C-1與JSJ-1的菌落數(shù)。

1.3.4 有機(jī)酸的定量測定

有機(jī)酸測定采用液液微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。液液微萃?。喝?00 μL發(fā)酵液，然后加入100 μL 2%稀硫酸將pH值調(diào)至約為2，加入2 mL二氯甲烷，使用渦旋振蕩儀充分振蕩，靜置30 min待溶液分層。將上層發(fā)酵液吸出，然后加入過量無水硫酸鈉，在-80 ℃冰箱放置4 h除去水分。然后使用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，每毫升發(fā)酵液中加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，裝入進(jìn)樣瓶自動(dòng)進(jìn)樣。內(nèi)標(biāo)溶液為18.18 g/L的2-乙基丁酸溶液。

氣相色譜條件：DB-Wax石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），初始柱溫為45 ℃，保留1.5 min，以6 ℃/min升溫至85 ℃，保持0 min，再以4 ℃/min升溫至115 ℃，保持0 min，再以3 ℃/min升溫至190 ℃，保持0 min，再以5 ℃/min升溫至225 ℃，保持3 min，進(jìn)樣口溫度260 ℃，載氣為氦氣（He）（99.999%），載氣流量為10.7 mL/min，分流進(jìn)樣，分流比10∶1，溶劑延遲5 min。

質(zhì)譜條件：離子源為電子電離源，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，電子能量為70 eV，發(fā)射電流為34.6 μA，倍增器電壓為1 294 V；接口溫度為280 ℃，質(zhì)量范圍為/50～600，對采集到的質(zhì)譜圖根據(jù)化合物峰離子對照NEST數(shù)據(jù)庫檢索定性。

1.3.5 乙醇與葡萄糖的測定

采用生物傳感分析儀檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用GraphPad Prism 8對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖分析，使用CorelDRAW 2019對圖片進(jìn)行處理和組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖為碳源S. cerevisiae C-1對C. celerecrescens JSJ-1生長及代謝的影響

在濃香型白酒的生產(chǎn)過程中，一般認(rèn)為對己酸菌的影響主要為生成的乙醇為己酸菌提供合成己酸的底物，另外前期利用氧氣進(jìn)行生長可以為己酸菌生長創(chuàng)造有利的環(huán)境。故在培養(yǎng)基中唯一碳源為葡萄糖時(shí)同時(shí)接種和己酸菌，驗(yàn)證利用葡萄糖生成的乙醇可為己酸的合成提供底物。

圖1 不同葡萄糖添加量條件下乙醇的生成情況Fig. 1 Ethanol production at different glucose concentrations in the medium

如圖1所示，當(dāng)葡萄糖添加量為4%時(shí)，C-1靜置培養(yǎng)3 d乙醇質(zhì)量濃度為15.6 g/L，最接近JSJ-1產(chǎn)己酸的最佳乙醇添加量。故將復(fù)合培養(yǎng)基A中葡萄糖設(shè)置為4%。

圖2 葡萄糖為碳源時(shí)S. cerevisiae C-1對C. celerecrescens JSJ-1生長及代謝的影響Fig. 2 Effect of S. cerevisiae C-1 on the growth and metabolism of C. celerecrescens JSJ-1 utilizing glucose as the carbon source

如圖2所示，JSJ-1在4%葡萄糖為碳源的復(fù)合培養(yǎng)基A單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，利用了少量的葡萄糖用于生長，生成某些酸性物質(zhì)引起pH值迅速下降，未生成己酸。C-1單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，葡萄糖在第3天已被完全利用，生成了乙醇，后期乙醇含量幾乎不變，未生成己酸。當(dāng)JSJ-1與C-1共同培養(yǎng)時(shí)，葡萄糖含量變化趨勢與C-1單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)相同，乙醇含量在第3天最高，第6天開始下降，同時(shí)對應(yīng)己酸的生成。這與己酸菌合成己酸的逆β氧化途徑相符，己酸菌利用乙醇生成乙酰輔酶A，然后通過碳鏈的延伸依次生成丁酸和己酸。說明當(dāng)葡萄糖為唯一碳源時(shí)，C-1可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇，為JSJ-1提供合成己酸的底物。

2.2 葡萄糖和乙醇同時(shí)存在S. cerevisiae C-1對C. celerecrescens JSJ-1生長及代謝的影響

2.2.1 交叉劃線觀察

圖3 C. celerecrescens JSJ-1與S. cerevisiae C-1的交叉劃線結(jié)果Fig. 3 Cross-streaking results of C. celerecrescens JSJ-1 and S. cerevisiae C-1

在置于厭氧培養(yǎng)袋內(nèi)的固體復(fù)合培養(yǎng)基B上34 ℃培養(yǎng)，JSJ-1菌落呈淺褐半透明狀，C-1菌落呈白色。根據(jù)圖3A，當(dāng)JSJ-1先劃線C-1后劃線時(shí)，C-1與JSJ-1接觸后的后半段肉眼觀察到的菌落仍然是酵母菌，未觀察到JSJ-1；由圖3B可以看出，當(dāng)C-1先劃線至平板，JSJ-1后劃線時(shí)，交叉點(diǎn)的后半段觀察到菌落為C-1而不是JSJ-1。當(dāng)劃線至與C-1的交叉點(diǎn)后，接種環(huán)上既有JSJ-1也有C-1。JSJ-1為可耐受一定氧氣的厭氧菌，而C-1為兼性厭氧，較JSJ-1而言生長速度更快，所以會優(yōu)先利用營養(yǎng)物質(zhì)。這說明，此培養(yǎng)條件下，兩種微生物同時(shí)接種，C-1比JSJ-1更具有生長優(yōu)勢，會占據(jù)主要地位。

2.2.2 液體共培養(yǎng)

如圖4A所示，JSJ-1單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)丁酸質(zhì)量濃度在前7 d幾乎不變，第8～10天迅速上升至約2 g/L，之后開始下降。共培養(yǎng)時(shí)丁酸質(zhì)量濃度在前2 d迅速上升至約2 g/L，之后開始下降。共培養(yǎng)時(shí)丁酸的生成及下降均早于JSJ-1在復(fù)合培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)。

如圖4B所示，當(dāng)JSJ-1單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，第8天開始生成己酸，第12天己酸產(chǎn)量達(dá)9.70 g/L。C-1與JSJ-1共同培養(yǎng)時(shí)，己酸在第4天開始生成，第12天己酸產(chǎn)量為9.64 g/L。C-1與JSJ-1共同培養(yǎng)相比JSJ-1單獨(dú)培養(yǎng)使己酸生成時(shí)間提前了4 d，發(fā)酵12 d己酸產(chǎn)量相差不大。根據(jù)己酸菌利用乙醇生成己酸的逆β氧化途徑，6分子乙醇氧化生成1分子乙酸，另外5分子生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A與乙酸結(jié)合生成丁酸，丁酸再與乙酰輔酶A結(jié)合生成己酸。丁酸是合成己酸的中間產(chǎn)物，說明己酸菌與共培養(yǎng)可以促進(jìn)己酸的生成。

由圖4C可知，C-1在復(fù)合培養(yǎng)基B中單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，乙醇含量并未升高，反而略有下降，可能由于培養(yǎng)基中葡萄糖含量偏低，主要被用來供C-1進(jìn)行生長和繁殖，沒有多余的葡萄糖代謝生成乙醇。C-1單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，乙醇下降的原因主要為培養(yǎng)過程中揮發(fā)損失。JSJ-1與C-1共培養(yǎng)時(shí)乙醇含量也一直處于下降趨勢?？梢?，在復(fù)合培養(yǎng)基B中JSJ-1與C-1共培養(yǎng)時(shí)丁酸及己酸生成的提前并不是由于C-1利用葡萄糖生成了乙醇為JSJ-1提供底物。

由圖4D、E可以看出，當(dāng)JSJ-1與C-1液體共培養(yǎng)時(shí)，第1天生長的菌落主要為C-1，葡萄糖在第1天基本耗盡，C-1的菌體量第1天最高，之后持續(xù)下降。JSJ-1的菌落數(shù)在第2天開始緩慢增長，第5天時(shí)數(shù)量最高，之后緩慢下降。這與平板交叉劃線得出的結(jié)論一致，在復(fù)合培養(yǎng)基中，C-1比JSJ-1更占據(jù)生長優(yōu)勢，會優(yōu)先生長，培養(yǎng)基中的葡萄糖主要是被C-1消耗用于生長和繁殖。

由前期實(shí)驗(yàn)得知，葡萄糖對JSJ-1產(chǎn)己酸有抑制作用，會使己酸的生成延遲。當(dāng)JSJ-1與C-1在液體復(fù)合培養(yǎng)基共培養(yǎng)時(shí)，C-1占據(jù)生長優(yōu)勢，會利用大部分的葡萄糖，緩解JSJ-1利用葡萄糖對產(chǎn)己酸的抑制作用，從而使丁酸、己酸的生成時(shí)間提前。

圖4 葡萄糖和乙醇為碳源時(shí)S. cerevisiae C-1對C. celerecrescens JSJ-1生長及代謝的影響Fig. 4 Effect of S. cerevisiae C-1 on the growth and metabolism of C. celerecrescens JSJ-1 utilizing glucose and ethanol as the carbon source

3 結(jié) 論

在葡萄糖為碳源和乙醇、葡萄糖為碳源這2 種營養(yǎng)條件下探究了C-1對JSJ-1己酸代謝的影響。在葡萄糖為唯一碳源時(shí)，C-1利用葡萄糖生成乙醇，為JSJ-1提供合成己酸的底物。在乙醇與葡萄糖同時(shí)存在時(shí)，由于C-1比JSJ-1更具有生長優(yōu)勢，會優(yōu)先利用葡萄糖進(jìn)行生長繁殖，緩解葡萄糖對己酸菌產(chǎn)己酸的抑制作用。本研究確定了共培養(yǎng)時(shí)對己酸菌的影響及其機(jī)理，對濃香型白酒釀造過程中兩種微生物間的相互作用機(jī)制有了更清晰的認(rèn)識，可為后續(xù)將與己酸菌復(fù)配應(yīng)用于窖池養(yǎng)護(hù)提供重要參考依據(jù)。