邵鑫，蔣先虹，王瑞，劉福

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是最常見(jiàn)的慢性關(guān)節(jié)疾病之一，其特征在于滑膜細(xì)胞激增，并伴有炎性細(xì)胞因子和趨化因子分泌。其發(fā)病機(jī)制至今仍不明確。研究表明，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes，RA-FLS)的類腫瘤細(xì)胞樣過(guò)度增值與自噬密切相關(guān)。根據(jù)機(jī)制，自噬分成三類：微自噬，巨自噬以及分子伴侶介導(dǎo)自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。在哺乳動(dòng)物，研究較多的主要是巨自噬。CMA是一種嚴(yán)格的選擇性蛋白質(zhì)降解過(guò)程，允許蛋白質(zhì)底物從胞質(zhì)溶膠直接轉(zhuǎn)移到溶酶體腔中，并依賴于伴侶蛋白Hsc70和溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP2A的共表達(dá)。通常情況下，自噬是在應(yīng)激條件下促進(jìn)細(xì)胞存活的一種調(diào)節(jié)方式，但過(guò)度激活自噬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。經(jīng)過(guò)多年研究，CMA在體內(nèi)平衡以及細(xì)胞、組織和器官功能中的作用越來(lái)越清晰：CMA的表達(dá)水平與多種疾病有關(guān)，包括溶酶體貯積病、免疫疾病、癌癥甚至衰老。關(guān)于RA巨自噬的研究較多，其機(jī)制也逐漸明確，但由于CMA研究方法尚未成熟，關(guān)于RA CMA的研究尚少。目前，仍不確定CMA的表達(dá)水平與RA的發(fā)病機(jī)制是否相關(guān)。本研究以骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(osteoarthritis fibroblast-like synoviocytes，OA-FLS)作為對(duì)照組，檢測(cè)分子伴侶自噬代表性因子Hsc70、LAMP2A在RA-FLS的表達(dá)水平，并探索其與RA患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

收集8例川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科住院部RA患者的膝關(guān)節(jié)滑膜組織，培養(yǎng)原代RA-FLS，收集患者臨床資料，所有RA患者均符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism，ACR/EULAR)關(guān)于RA的診斷標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)收集性別、年齡匹配的8例骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)患者的膝關(guān)節(jié)滑膜組織，分離、培養(yǎng)原代OA-FLS作為對(duì)照組。該實(shí)驗(yàn)獲得川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均知情并同意參與。8例受試者與8例對(duì)照者基本信息見(jiàn)表1。DAS28=0.56×SQRT(壓痛關(guān)節(jié)數(shù)28)+0.28×SQRT(腫脹關(guān)節(jié)數(shù)28)+0.70×ln(ESR)+0.014×(患者健康狀況評(píng)分)。

表1 受試者與對(duì)照者基本信息

LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自瑞士羅氏公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自法國(guó)Vilber Lourmat公司；激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。Ⅱ型膠原酶、胰酶、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；引物購(gòu)自生工生物工程上海股份有限公司；鼠抗人 Hsc70 單克隆抗體、兔抗人LAMP2A多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)abcom公司，鼠抗人-actin 單克隆抗體、IgG二抗、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的二抗、羅丹明(TRITC)標(biāo)記的二抗購(gòu)自成都 ZenBioScience 公司；DAPI 染劑購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)、換液、傳代及凍存：滑膜組織從手術(shù)室取出后，用Ⅱ型膠原酶消化4 h，過(guò)濾、離心，進(jìn)行培養(yǎng)，1～3 d換液，約一周待培養(yǎng)瓶長(zhǎng)滿80%～90%后進(jìn)行傳代，按1∶2或1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取3～ 8代活性較好的原代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)Hsc70與LAMP2A mRNA表達(dá)：取3～7代較純化的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RA-FLS與OA-FLS細(xì)胞用于下續(xù)實(shí)驗(yàn)，采用RT-qPCR法分別檢測(cè)RA-FLS與OA-FLS兩組細(xì)胞Hsc70 mRNA和LAMP2A mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃反應(yīng)5 s，60 ℃反應(yīng)30 s，72 ℃反應(yīng)20 s，40個(gè)循環(huán)。RT-qPCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果：電泳后分別可見(jiàn)長(zhǎng)度約為286、187、194 bp的條帶，分別為Hsc70、LAMP2A、-actin的PCR產(chǎn)物，堿基序列見(jiàn)表2。

表2 實(shí)時(shí)定量基因堿基序列

1.2.3 Western blot檢測(cè)Hsc70與LAMP2A蛋白表達(dá)：采用Western blot法檢測(cè)RA-FLS與OA-FLS兩組細(xì)胞Hsc70蛋白、LAMP2A蛋白的相對(duì)表達(dá)，具體操作步驟依次為：配制蛋白膠，80 V電泳150 min，200 mA轉(zhuǎn)膜80 min，用5%脫脂牛奶封閉，孵育一抗、二抗，顯影成像。Hsc70抗體稀釋比例為1∶1 000，LAMP2A抗體稀釋比例為1∶1 000。

1.2.4 免疫熒光檢測(cè)Hsc70與LAMP2A蛋白的共定位表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于鋪有爬片的6孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，每孔加入2 mL細(xì)胞懸液，2×10個(gè)細(xì)胞；過(guò)夜待細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)基，PBS輕輕清洗2次；固定、透膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAPI復(fù)染核5 min，最后進(jìn)行封片及檢測(cè)，在共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞共定位表達(dá)，設(shè)置掃描參數(shù)，三通道掃描：各通道激發(fā)波長(zhǎng)紅色熒光TRITC為555 nm，綠色熒光FITC為490 nm，藍(lán)色熒光DAPI為405 nm。

1.2.5 Pearson法分析Hsc70與LAMP2A蛋白水平與RA患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性：采用Pearson法分析Hsc70與LAMP2A蛋白水平與RA患者血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、DAS28、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 RA-FLS與OA-FLS分子伴侶介導(dǎo)自噬基因水平比較

RT-qPCR結(jié)果顯示，RA-FLS與OA-FLS均存在Hsc70 mRNA和LAMP2A mRNA表達(dá)，RA-FLS組Hsc70 mRNA相對(duì)表達(dá)為(1.05±0.15)、LAMP2A mRNA相對(duì)表達(dá)為(1.01±0.06)，顯著高于OA-FLS對(duì)照組Hsc70 mRNA表達(dá)(0.51±0.10)和LAMP2A mRNA表達(dá)(0.63±0.08)，兩組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)(圖1)。

2.2 RA-FLS與OA-FLS分子伴侶介導(dǎo)自噬蛋白水平比較

Western Blot結(jié)果顯示，RA-FLS與OA-FLS均存在Hsc70蛋白和LAMP2A蛋白表達(dá)，RA-FLS組Hsc70蛋白相對(duì)表達(dá)為(1.02±0.08)、LAMP2A 蛋白的相對(duì)表達(dá)為(1.07±0.03)，均顯著高于OA-FLS對(duì)照組中Hsc70的蛋白水平(0.78±0.06)，LAMP2A的蛋白水平(0.61±0.08)，兩組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)(圖2)

2.3 RA-FLS與OA-FLS Hsc70和LAMP2A蛋白共定位表達(dá)

用DAPI藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核，F(xiàn)ITC-綠色熒光標(biāo)記LAMP2A蛋白，TRITC-紅色熒光標(biāo)記Hsc70蛋白。共聚焦結(jié)果顯示，與OA-FLS對(duì)照組相比，RA-FLS中紅色和綠色熒光明顯更強(qiáng)；且在RA-FLS中紅綠熒光融合后的黃色熒光斑點(diǎn)顯著高于對(duì)照組，表明Hsc70與LAMP2A蛋白的共定位表達(dá)增強(qiáng)(圖3)。

2.4 RA-FLS分子伴侶介導(dǎo)自噬蛋白水平與RA患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性

Pearson法分析結(jié)果顯示，Hsc70蛋白水平與8例RA患者的DAS28得分呈正相關(guān)(=0.775 6)，與ESR、CRP、RF無(wú)明顯相關(guān)性；LAMP2A蛋白水平與8例RA患者的DAS28得分、ESR呈正相關(guān)(分別為0.750 7、0.779 0)，與CRP、RF無(wú)明顯相關(guān)性(圖4)。

圖 1 RA-FLS與OA-FLS Hsc70和LAMP2A mRNA相對(duì)表達(dá)水平

圖 2 RA-FLS與OA-FLS Hsc70和LAMP2A蛋白相對(duì)表達(dá)水平

圖 3 共聚焦顯微鏡觀察RA-FLS與OA-FLS中Hsc70和LAMP2A蛋白共定位表達(dá)

圖 4 Hsc70與LAMP2A蛋白水平與RA患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

侵襲性RA-FLS表型在RA的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，RA-FLS以腫瘤樣方式增殖并釋放出大量介導(dǎo)RA關(guān)節(jié)破壞的促炎因子，是RA發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素。以往研究數(shù)據(jù)表明RA-FLS細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)并伴有巨自噬的激活，但RA-FLS細(xì)胞中的CMA水平是否高于正常水平尚未明確，本研究探索RA患者膝關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞中CMA功能水平。CMA不依賴于自噬體的形成，而是依賴于伴侶蛋白Hsc70和LAMP2A的共表達(dá)發(fā)揮作用。Hsc70與底物結(jié)合受到伴侶蛋白的調(diào)控，例如Hsc70相互作用蛋白，熱激蛋白40和Hsc70-HSP90組織蛋白。實(shí)際上，大約三分之一的蛋白質(zhì)組可以靶向CMA介導(dǎo)的降解，因?yàn)榇蠹s30%的蛋白質(zhì)包含Hsc70靶向序列。本研究發(fā)現(xiàn)RA-FLS與OA-FLS對(duì)照組相比，Hsc70 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，提示RA患者細(xì)胞中可能有更多的Hsc70去結(jié)合含有KFERQ堿基序列底物，為CMA順利進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。

一些研究表明，LAMP2A mRNA表達(dá)水平與CMA的發(fā)生呈正相關(guān)。在CMA中，首先，Hsc70識(shí)別含有KFERQ基序的胞質(zhì)蛋白形成Hsc70-底物復(fù)合物，然后與溶酶體受體LAMP2A結(jié)合，底物被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體腔中進(jìn)行降解消化。LAMP2A是一種Ⅰ型整合膜蛋白，可作為貨物運(yùn)輸?shù)目?，Hsc70-KFERQ底物復(fù)合物與LAMP2A C端胞質(zhì)肽GLKRHHTGYEQ相互作用。LAMP2A溶酶體受體則是CMA途徑的主要限制成分。有鑒于此，本實(shí)驗(yàn)比較RA患者和OA對(duì)照之間RA-FLS和OA-FLS中LAMP2A的相對(duì)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)RA患者LAMP2A mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯增加。表明更多的LAMP2A可能與RA患者RA-FLS中的Hsc70結(jié)合，從而激活CMA途徑。LAMP2A是CMA的受體和限制步驟，而Hsc70是CMA的關(guān)鍵載體。CMA途徑主要依賴Hsc70-底物復(fù)合體與LAMP2A溶酶體膜受體結(jié)合而發(fā)揮作用，本研究共聚焦圖像結(jié)果可以說(shuō)明Hsc70和LAMP2A蛋白的共定位表達(dá)增強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)將RA患者的臨床資料進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Hsc70與LAMP2A蛋白水平與RA患者的病情活動(dòng)度呈正相關(guān)，疾病表現(xiàn)越活躍，Hsc70與LAMP2A蛋白水平越高。提示Hsc70、LAMP2A可作為治療RA疾病的作用靶點(diǎn)。

綜上，RA發(fā)病機(jī)制可能與CMA活性增強(qiáng)有關(guān)，且Hsc70與LAMP2A蛋白水平與RA患者的病情活動(dòng)度呈正相關(guān)，抑制CMA途徑的激活可能成為控制RA疾病的有效方案。今后的研究可以從Hsc70與LAMP2A著手，探索分子伴侶介導(dǎo)自噬與RA-FLS的活化、凋亡及巨自噬的相關(guān)性，并研究其具體的通路機(jī)制。