楊騏瑞， 王娜， 李麗華， 邱艾， 余永飛， 吳駿， 劉晶

(云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南省馬鈴薯生物學(xué)重點(diǎn)實驗室，云南省高校馬鈴薯生物學(xué)重點(diǎn)實驗室，云南 昆明 650500)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是茄科茄屬作物，其營養(yǎng)全面且口感佳，在全世界范圍內(nèi)被廣泛種植，是世界四大糧食作物之一[1].馬鈴薯自傳入我國以來便在全國范圍內(nèi)大量種植并深受人們喜愛.然而，馬鈴薯生長過程中往往會遭遇各種病害，其中晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)中的毀滅性病害.馬鈴薯晚疫病由病原卵菌致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起，會導(dǎo)致馬鈴薯產(chǎn)量急劇下降甚至絕收，嚴(yán)重威脅全球糧食安全.

病原菌在侵染植物過程中往往會分泌效應(yīng)蛋白到植物中幫助其成功侵染.同時，植物也進(jìn)化出了相應(yīng)的抗病蛋白，當(dāng)抗病蛋白識別病原菌的效應(yīng)蛋白后，植物的特異性免疫反應(yīng)(Effector-triggered Immunity,ETI)被激活，引起植物局部產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)(Hypersensitive Response,HR)，HR反應(yīng)能夠?qū)⒉≡拗圃谥参锏木植刻囟▍^(qū)域來抵抗病原菌入侵，從而確保植物的正常生長發(fā)育[2-3].致病疫霉是疫霉屬(Phytophthora)的卵菌，據(jù)報道其基因組中有563 個RxLR胞質(zhì)效應(yīng)蛋白基因，其中有100多個效應(yīng)蛋白基因能夠在植物體內(nèi)表達(dá)并調(diào)控[4].典型的RxLR效應(yīng)蛋白含有信號肽、N端RxLR(Arg-x-Leu-Arg)保守結(jié)構(gòu)域和C端功能域三個結(jié)構(gòu)域[5-6].信號肽在RxLR效應(yīng)蛋白的N端，由15～25個疏水性氨基酸殘基組成，負(fù)責(zé)將效應(yīng)蛋白分泌到細(xì)胞外，成熟效應(yīng)蛋白的信號肽會被切除.保守的RxLR結(jié)構(gòu)域能夠幫助效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到植物細(xì)胞中.效應(yīng)蛋白的C端功能域包含K、W、Y和L 四個模式基序，該區(qū)域的序列多態(tài)性較高，這些結(jié)構(gòu)域?qū)π?yīng)蛋白的無毒功能及在抑制宿主細(xì)胞死亡過程中發(fā)揮重要作用[5].

RxLR效應(yīng)蛋白被病原菌分泌到寄主植物細(xì)胞內(nèi)并與植物細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)蛋白結(jié)合，干擾植物的免疫反應(yīng).目前，關(guān)于致病疫霉效應(yīng)蛋白的植物靶標(biāo)蛋白已有不少文獻(xiàn)報道，如Ren等人的研究表明，致病疫霉效應(yīng)蛋白Pi22926能夠靶標(biāo)馬鈴薯絲裂原活化蛋白激酶StMAP3Kβ2，前者通過特異與后者的激酶結(jié)構(gòu)域互作來抑制馬鈴薯免疫應(yīng)答信號傳導(dǎo)[6].致病疫霉效應(yīng)蛋白Pi02860可與馬鈴薯E3泛素連接酶StNRL1互作，促進(jìn)病原菌的侵染[7].Boevink等研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯蛋白磷酸酶PP1c是致病疫霉效應(yīng)蛋白Pi04314的靶標(biāo)蛋白，PP1c的磷酸酶活性對促進(jìn)病原菌的侵染至關(guān)重要，當(dāng)二者互作時PP1c的亞細(xì)胞定位發(fā)生改變，進(jìn)而幫助病原菌成功侵染[8].Wang等研究表明，馬鈴薯RNA結(jié)合蛋白StKRBP1能夠結(jié)合致病疫霉效應(yīng)蛋白Pi04089，突變StKRBP1的保守基序后不能再促進(jìn)病原菌的侵染，證明StKRBP1負(fù)調(diào)控馬鈴薯的抗病免疫反應(yīng)[9].致病疫霉效應(yīng)蛋白PexRD2 能夠靶標(biāo)植物MAPK激酶MAPKKKε并與之互作，通過抑制MAPKKKε的磷酸化來抑制植物抗病信號傳導(dǎo)[10].還有研究發(fā)現(xiàn)，Avr3a能夠靶標(biāo)參與細(xì)胞內(nèi)吞的GTPase DRP2，進(jìn)而抑制植物活性氧的積累[11].綜上所述，篩選并研究效應(yīng)蛋白的植物靶標(biāo)蛋白，解析靶標(biāo)蛋白在植物免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮的功能對后續(xù)選育作物抗病品種具有重要意義.

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)一個致病疫霉RxLR效應(yīng)蛋白PITG_16275并命名為Pi16275，在本氏煙草葉片上瞬時超量表達(dá)該效應(yīng)蛋白能夠促進(jìn)致病疫霉的侵染.研究利用Pi16275作為誘餌蛋白，篩選酵母cDNA文庫獲得Pi16275的植物靶標(biāo)蛋白，利用病毒介導(dǎo)的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)體系在煙草中瞬時沉默靶標(biāo)蛋白同源基因，并對靶標(biāo)蛋白的功能做了初步研究.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

致病疫霉菌株88069、大腸桿菌菌株DH5α、根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101、釀酒酵母菌菌株Y187及Y2HGold均由本實驗室保存提供.本氏煙草種植于人工恒溫氣候室中(22 °C，16 h/8 h 光照/黑暗)，生長3～6周后備用.酵母雙雜交載體pGBKT7和pGADT7，VIGS載體pTRV1、pTRV2-GFP、pTRV2-PDS和pTRV2 均由本實驗室保存提供.酵母cDNA文庫由本實驗室提供，文庫材料來源于致病疫霉菌株88069侵染不同時間的馬鈴薯栽培種C88葉片.

1.2 酵母cDNA文庫篩選及酵母點(diǎn)對點(diǎn)雜交

以致病疫霉cDNA為模版，利用引物對(見表1)擴(kuò)增不含信號肽序列的Pi16275編碼序列，利用One Step Cloning Kit (Vazyme)將擴(kuò)增序列連接到酶切后的pGBKT7載體上，形成重組載體pGBKT7-Pi16275.隨后將重組載體轉(zhuǎn)入DH5α中，菌落PCR鑒定后送測序，確認(rèn)重組載體序列正確無誤后用于酵母cDNA文庫篩選，具體操作步驟參照韋吉的方法[12].隨后，利用引物對(見表1)以馬鈴薯栽培種C88的cDNA為模版，擴(kuò)增上述酵母cDNA文庫篩選出的候選互作蛋白X的編碼序列，利用相同方法將X的編碼序列連接到酶切后的pGADT7載體上，形成重組載體pGADT7-X.最后，利用酵母點(diǎn)對點(diǎn)雜交技術(shù)驗證候選互作蛋白X與Pi16275是否真正存在互作.實驗設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù).

1.3 病毒介導(dǎo)的基因沉默(VIGS)及沉默植株抗病性分析

利用引物對(見表1)以本氏煙草cDNA為模版，擴(kuò)增X在本氏煙草中同源蛋白的編碼序列并連接到酶切后的pTRV2載體上，形成重組載體pTRV2-X′.將上述重組載體轉(zhuǎn)入DH5α中，PCR鑒定及測序結(jié)果確認(rèn)重組載體正確后，提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化GV3101，PCR鑒定正確后用于VIGS實驗.VIGS具體操作步驟參照文獻(xiàn)[13]的方法.利用RT-qPCR技術(shù)檢測目的基因的沉默效率，同時利用離體葉片接種法對本氏煙草進(jìn)行抗病性分析.選取本氏煙草頂葉以下第3～5片葉片，采用離體葉片接種法在主葉脈兩側(cè)各接種10 μL濃度為2×105個/mL的致病疫霉孢子囊懸浮液.保濕培養(yǎng)6 d后，測量病斑大小,計算病斑面積.實驗設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù).

表1 研究中使用到的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 誘餌蛋白毒性和自激活檢測

構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-Pi16275，并進(jìn)行毒性及自激活檢測，確定誘餌蛋白對酵母生長無毒性且不會引起酵母自激活后，再進(jìn)行酵母cDNA文庫篩選.分別將載體組合轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold菌株，并涂布篩選平板.載體組合如下：陽性對照組(pGADT7-T與pGBKT7-53)、陰性對照組(pGADT7-T與pGBKT7-Lam)、空白載體組(pGADT7與pGBKT7)、實驗組(pGADT7與pGBKT7-Pi16275).研究發(fā)現(xiàn)所有酵母轉(zhuǎn)化菌株都能在SD-Trp(一缺)培養(yǎng)基上生長，實驗組的酵母菌落數(shù)量及菌落大小與陽性對照組、陰性對照組及空白載體組均沒有明顯差異.說明誘餌蛋白對酵母細(xì)胞無毒性(圖片未展示).此外，不同載體組合的酵母轉(zhuǎn)化菌株均能在SD-Trp-Leu/X-α-gal(二缺)培養(yǎng)基上生長，且除陽性對照組外，其余酵母轉(zhuǎn)化菌株在上述培養(yǎng)基上均不顯藍(lán)色；陽性對照組能夠在SD-Trp-Leu-His/X-α-gal(三缺)培養(yǎng)基上生長且顯藍(lán)色，但其余組均不能在上述培養(yǎng)基上生長(圖1).該結(jié)果說明，誘餌蛋白不存在自激活，可以進(jìn)行酵母cDNA文庫篩選.

2.2 酵母cDNA文庫篩選互作蛋白

課題組前期構(gòu)建了酵母cDNA文庫，此次以Pi16275作為誘餌蛋白，篩選其互作蛋白.挑取能夠在四缺培養(yǎng)基上生長并且顯藍(lán)色的陽性酵母菌落，液體培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并送生物公司測序.測序結(jié)果返回后，在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)上進(jìn)行BLAST比對分析.排除相同序列后，得到8個可能與Pi16275有互作的候選靶標(biāo)蛋白(表2).

表2 候選靶標(biāo)蛋白編碼基因測序比對結(jié)果

2.3 酵母點(diǎn)對點(diǎn)雜交驗證

以馬鈴薯栽培種C88的cDNA為模版，設(shè)計引物擴(kuò)增上述候選靶標(biāo)蛋白基因的全長編碼序列，將這些序列分別連接到pGADT7 載體上構(gòu)建成獵物載體.隨后，利用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)法，將誘餌載體與獵物載體分別共轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold菌株并涂布到酵母營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上.結(jié)果顯示，除陽性對照、BD-Pi16275+AD-5組合和BD-Pi16275+AD-7組合能夠在四缺培養(yǎng)基上生長并顯藍(lán)色外，其余組合在四缺培養(yǎng)基上均沒有菌落生長(圖2).挑取陽性對照、陰性對照及兩組能夠在四缺平板上生長并顯藍(lán)色的菌落制備成菌液，點(diǎn)樣于二缺及四缺平板上.所得結(jié)果與上述結(jié)果一致，陽性對照、BD-Pi16275+AD-5組合及BD-Pi16275+AD-7組合均能在四缺培養(yǎng)基上生長并顯藍(lán)色(圖3).說明5號及7號靶標(biāo)蛋白能夠與效應(yīng)蛋白Pi16275產(chǎn)生互作.序列比對結(jié)果顯示，5號靶標(biāo)蛋白為3,4-二羥基-2-丁酮激酶，7號靶標(biāo)蛋白為一個未知蛋白(表2).

2.4 VIGS沉默靶標(biāo)蛋白基因及基因沉默植株抗病性檢測

利用VIGS技術(shù)在本氏煙草中瞬時沉默5號及7號靶標(biāo)蛋白基因的煙草同源基因，以注射綠色熒光蛋白(GFP)的本氏煙草植株作為陰性對照，以瞬時沉默八氫番茄紅素脫氫酶基因(PDS)的植株作為陽性對照.農(nóng)桿菌共注射煙草植株約10 d左右，陽性對照植株頂葉開始出現(xiàn)白化現(xiàn)象，約25 d后，陽性對照植株葉片的白化現(xiàn)象極為明顯，說明整個實驗體系正確(圖4).

圖4 陽性對照植株的白化現(xiàn)象

提取農(nóng)桿菌注射25 d后的陰性對照組植株以及兩個實驗組植株的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行RT-qPCR檢測.結(jié)果表明，實驗組煙草葉片目的基因沉默效率分別為54%及39%(圖5C).收集陰性對照組及實驗組的煙草葉片，接種致病疫霉孢子囊懸浮液，6 d后統(tǒng)計各組病斑面積.結(jié)果顯示，沉默5號靶標(biāo)蛋白基因在本氏煙草中的同源基因后，本氏煙草對致病疫霉的抗性顯著降低，葉片病斑面積顯著大于陰性對照組的病斑面積(圖5A和5B)；沉默7號靶標(biāo)蛋白基因在本氏煙草中的同源基因后，葉片病斑面積與陰性對照組相比無顯著差異.上述結(jié)果說明，Pi16275在馬鈴薯中的5號靶標(biāo)蛋白在植物抗病免疫過程中發(fā)揮正調(diào)控作用.

3 討論

致病疫霉是引起世界范圍內(nèi)馬鈴薯晚疫病的重要病原菌，該病危害程度大，使用化學(xué)藥物很難根治.因此，可從致病疫霉侵染馬鈴薯時分泌的效應(yīng)蛋白著手，篩選效應(yīng)蛋白的植物靶標(biāo)蛋白，解析靶標(biāo)蛋白在馬鈴薯抗病免疫應(yīng)答中的作用，為后續(xù)選育馬鈴薯抗病品種奠定理論基礎(chǔ).研究以致病疫霉RxLR效應(yīng)蛋白Pi16275作為誘餌蛋白，篩選得到2個與之互作的植物靶標(biāo)蛋白(5號及7號).然后利用VIGS技術(shù)沉默靶標(biāo)蛋白在本氏煙草中的同源基因，發(fā)現(xiàn)沉默5號靶標(biāo)蛋白基因的同源基因后，本氏煙草的抗病能力顯著降低，表明該靶標(biāo)蛋白在植物抗病免疫過程中發(fā)揮一定作用.

前人研究發(fā)現(xiàn)，致病疫霉效應(yīng)蛋白AVR2能夠與馬鈴薯磷酸酶StBSL1結(jié)合形成復(fù)合體并被抗病蛋白Rpi-R2識別，進(jìn)而引發(fā)一系列抗病反應(yīng)[13].致病疫霉效應(yīng)蛋白AVRblb2能夠與馬鈴薯免疫相關(guān)蛋白酶—類似木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶C14互作，從而抑制了C14 轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)外體，最終導(dǎo)致病原菌成功侵染[14].致病疫霉效應(yīng)蛋白AVR1靶標(biāo)植物胞泌復(fù)合體亞基Sec5，AVR1與Sec5結(jié)合后影響植物細(xì)胞囊泡運(yùn)輸，進(jìn)而抑制了植物基礎(chǔ)免疫，導(dǎo)致植物感病[15].目前，有關(guān)效應(yīng)蛋白的植物互作靶標(biāo)蛋白研究多集中在泛素化系統(tǒng)、免疫相關(guān)蛋白酶、MAPK 信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子和植物基礎(chǔ)免疫等幾個方面，是否有新的重要成員參與上述過程目前還不知曉.此次研究發(fā)現(xiàn)了一個致病疫霉效應(yīng)蛋白Pi16275的植物靶標(biāo)蛋白(5號靶標(biāo)蛋白)，該蛋白在植物抵御病原菌侵染過程中發(fā)揮作用.后續(xù)可從該靶標(biāo)蛋白入手，深入解析該蛋白與效應(yīng)蛋白Pi16275的作用機(jī)制，揭示該蛋白參與植物抗病免疫應(yīng)答的可能作用方式.