劉婕， 艾菊， 高冬麗

(云南師范大學(xué) 云南省馬鈴薯生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是一年生茄科茄屬作物，是繼水稻和小麥之后的第四大主糧作物，也是世界上最重要的塊莖類糧食作物.馬鈴薯塊莖富含淀粉，其含量達(dá)到薯塊干物質(zhì)的80%左右.葉片合成的蔗糖被運(yùn)輸?shù)今R鈴薯塊莖內(nèi)，蔗糖透過塊莖細(xì)胞的細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后在蔗糖合酶(SuSy)等一系列酶的作用下生成葡萄糖-6-磷酸(G6P).G6P由葡萄糖-6-磷酸/磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GPT)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入質(zhì)體，開始淀粉的合成[1].腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)焦磷酸化酶是淀粉合成的限速酶，ADPG作為淀粉合成前體通過可溶性淀粉合酶(SSs)、淀粉分支酶(SBE)、顆粒結(jié)合性淀粉合酶(GBSS)等酶的相互協(xié)同作用催化形成淀粉[2].Van Harsselaar等利用擬南芥的淀粉合成酶在馬鈴薯基因組中進(jìn)行了同源基因搜索，系統(tǒng)鑒定了馬鈴薯淀粉代謝相關(guān)的基因[3]，但這些基因在塊莖發(fā)育過程中的表達(dá)變化還沒有詳細(xì)的研究.

淀粉以顆粒的形式貯存于細(xì)胞中，淀粉顆粒的大小、性狀和組成等因植物種類和器官而異.李芬芬等采用聚焦光束發(fā)射儀法，測(cè)得馬鈴薯淀粉的粒徑大小為31.3 μm[4].詹錦玲等采用酶解動(dòng)力學(xué)等方法，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)無破損的馬鈴薯淀粉顆粒的粒度大小與其酶解特性相關(guān)聯(lián)，淀粉顆粒越小，其比表面積越大，酶解效率越高[5].以上研究針對(duì)的是成熟塊莖的淀粉顆粒粒徑，塊莖在早期發(fā)育過程中淀粉顆粒大小如何變化尚未可知.此次研究利用塊莖7個(gè)發(fā)育時(shí)期的樣品，檢測(cè)了8個(gè)淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)，分析了顆粒粒徑的變化，以期為進(jìn)一步解析淀粉合成代謝和淀粉顆粒大小的遺傳機(jī)制提供參考.

1 材料與方法

1.1 RT-qPCR

取二倍體馬鈴薯CIP149塊莖發(fā)育早期的7個(gè)時(shí)期的塊莖(最小直徑約為0.3 cm，最大直徑約為4 cm).同一時(shí)期的數(shù)個(gè)新鮮馬鈴薯洗凈削皮，各取3～4片于液氮中研磨成粉，獲得同一時(shí)期的混樣，每個(gè)樣品三個(gè)生物學(xué)重復(fù).稱取約0.2 g用于提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA.RNA提取試劑盒RNAprep Pure Plant Plus Kit為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser以及RT-qPCR所用 2×TB GreenPremixExTaqTMⅡ和50×ROX Reference Dye Ⅱ均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品.RT-qPCR按照以下體積添加各組分：2×TB GreenPremixExTaqTMⅡ 10 μL，50×ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，正向引物(F)0.8 μL，反向引物(R)0.8 μL，稀釋5倍的cDNA 2μL，ddH20 6 μL.RT-qPCR的反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)：95 °C 5 s，60 ℃ 30 s.內(nèi)參基因?yàn)锳ctin，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[6].

表1 RT-qPCR所用引物

1.2 淀粉顆粒粒徑分析

稱取步驟1.1中得到的各時(shí)期馬鈴薯粉末0.1 g，加入800 μL ddH2O進(jìn)行溶解，制得樣液.稱取2.0 g碘化鉀及0.2 g碘溶于ddH2O中，100 mL容量瓶定容，制得碘-碘化鉀染液.取樣液-染液(體積比 3∶1)滴于載玻片上，染色后顯微鏡觀察.根據(jù)放大倍數(shù)校正標(biāo)尺后，測(cè)量所拍區(qū)域內(nèi)淀粉顆粒的粒徑.

2 結(jié)果

2.1 淀粉合成酶基因的組織表達(dá)特異性

Van Harsselaar等對(duì)馬鈴薯淀粉代謝相關(guān)基因進(jìn)行了全基因組分析[3]，我們根據(jù)文獻(xiàn)中提供的基因，結(jié)合其他文獻(xiàn)報(bào)道的淀粉合成相關(guān)基因的功能，篩選了8個(gè)基因進(jìn)行后續(xù)分析.利用Spud DB Potato Genomics Resource (http://spuddb.uga.edu/) 網(wǎng)站提供的Solanum tuberosum Group Phureja double-monoploid (DM) 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析了8個(gè)基因在塊莖、匍匐莖及花等組織中的表達(dá)量(表2).結(jié)果表明，8個(gè)基因在塊莖的表達(dá)遠(yuǎn)高于在其他組織的表達(dá)，說明所選的淀粉合成基因具有組織偏好性表達(dá)的特點(diǎn).

表2 淀粉合成基因的FPKM值

2.2 塊莖發(fā)育過程中淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)

利用RT-qPCR檢測(cè)了淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果如圖1所示.淀粉合成相關(guān)基因在塊莖7個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)有3類模式：第一類是基因的表達(dá)在塊莖發(fā)育時(shí)期變化較小，包括SS5、SS2和SBE3；第二類是基因的表達(dá)基本上隨發(fā)育進(jìn)程升高，但表達(dá)有波動(dòng)，包括GPT2.1和SS3；第三類是隨著塊莖的發(fā)育，基因的表達(dá)逐漸增高，包括APL3、SuSy2和SuSy4.

Y1 到Y(jié)7表示塊莖發(fā)育的7個(gè)時(shí)期.

2.3 塊莖發(fā)育過程中淀粉顆粒粒徑變化

通過碘-碘化鉀染色和顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著馬鈴薯塊莖發(fā)育，視野中大顆粒淀粉數(shù)量增多(圖2).分別統(tǒng)計(jì)了塊莖發(fā)育7個(gè)時(shí)期的206、109、257、166、87、144個(gè)和76個(gè)淀粉顆粒.對(duì)淀粉顆粒粒徑< 20 μm、20～30 μm、30～40 μm和40～50 μm淀粉顆粒在顆粒總數(shù)中的占比進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)< 20 μm的淀粉顆粒占比逐漸降低，而20～30 μm、30～40 μm和40～50 μm的淀粉顆粒占比呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，但< 20 μm的淀粉顆粒的比例始終是最大的(圖3).

圖2 塊莖發(fā)育4個(gè)時(shí)期的淀粉顆粒粒徑圖片展示

圖3 塊莖發(fā)育7個(gè)時(shí)期的淀粉顆粒粒徑統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)語與討論

淀粉生物合成是多種酶共同作用的結(jié)果.從DM的組織表達(dá)數(shù)據(jù)來看，淀粉合成相關(guān)基因具有塊莖高表達(dá)的特征(表2).在塊莖發(fā)育時(shí)期，雖然合成基因的表達(dá)模式不盡一致，但總體上具有發(fā)育后期表達(dá)高于發(fā)育前期表達(dá)的特點(diǎn)(圖1).淀粉的合成不僅需要多種酶的參與，而且也受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控.在小麥、玉米和水稻等作物中已經(jīng)報(bào)道了多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控淀粉的合成[7].將合成基因作為指示基因，篩選出和指示基因具有共同表達(dá)模式的分析方法稱為共表達(dá)分析.共表達(dá)分析是鑒定多基因代謝通路調(diào)控因子的有效方法.研究篩選的8個(gè)淀粉合成相關(guān)基因具有一致的組織偏好性表達(dá)模式，同時(shí)在塊莖發(fā)育時(shí)期也具有后期表達(dá)高于前期表達(dá)的特征，將它們作為指示基因有利于進(jìn)行組織或者發(fā)育時(shí)期共表達(dá)分析，從而篩選出轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子.

小麥淀粉顆粒粒徑的研究已較為深入，小麥淀粉顆粒以10 μm作為分界線，較小的圓形顆粒為B型，較大的盤狀顆粒為A型，A淀粉粒與B淀粉粒在小麥中的比例約為1∶5[8].研究發(fā)現(xiàn)，A淀粉粒與B淀粉粒形成時(shí)期不同.A淀粉粒在開花后3～4 d開始形成，在生長過程中，胚乳中A淀粉粒數(shù)目保持不變，而體積逐漸增大；B淀粉粒直到開花后約15 d才形成，在生長過程中，顆粒大小基本不發(fā)生變化，但其數(shù)目一直增加[9-11].由于形成時(shí)期不同，A淀粉粒與B淀粉粒在很多淀粉理化性質(zhì)方面也有所不同.例如，A淀粉粒比B淀粉粒具有更高的峰值黏度、最低黏度以及支鏈淀粉含量[8].Guo等詳細(xì)研究了紅薯塊根中的淀粉顆粒，發(fā)現(xiàn)A、B和C三種淀粉顆粒在塊根中共存[12].在馬鈴薯中尚未有詳細(xì)的淀粉顆粒粒徑研究[13].從發(fā)育時(shí)期來看，雖然隨著塊莖發(fā)育，大顆粒淀粉占比逐漸增加，但小顆粒淀粉仍占絕大部分(圖2).后續(xù)還需要更詳細(xì)地劃分顆粒粒徑大小，并對(duì)不同大小的淀粉顆粒進(jìn)行深入研究.淀粉顆粒粒徑受到遺傳因素的影響，F(xiàn)eng等利用重組自交系定位了三個(gè)決定淀粉顆粒大小的數(shù)量性狀位點(diǎn)[14].我們測(cè)定了部分二倍體馬鈴薯材料的淀粉顆粒大小，發(fā)現(xiàn)在淀粉顆粒粒徑方面有較大的變異，因此后續(xù)有必要開展馬鈴薯淀粉顆粒粒徑的遺傳分析.

綜上所述，淀粉合成相關(guān)基因在塊莖中高表達(dá)，在塊莖發(fā)育時(shí)期，后期表達(dá)要高于前期表達(dá).在發(fā)育過程中，以小顆粒淀粉為主，大顆粒淀粉占比呈現(xiàn)出逐漸增加趨勢(shì).研究為進(jìn)一步鑒定淀粉合成調(diào)控因子和淀粉顆粒粒徑研究奠定了基礎(chǔ).