梁 爽，蒙艷麗，劉 暢，王曉溪，王 博，王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036)

新對(duì)葉百部堿(neotuberostemonine，NTS)是對(duì)葉百部的主要的活性成分，具有止咳、改善肺損傷和肺纖維化等作用[1-2]。相關(guān)的研究表明，具有飽和的三環(huán)結(jié)構(gòu)是其止咳鎮(zhèn)咳藥理活性所必須條件。Zhou等[3]研究了新對(duì)葉百部堿、對(duì)葉百部堿、對(duì)葉百部堿H和對(duì)葉百部J的體內(nèi)止咳活性，發(fā)現(xiàn)3種百部生物堿對(duì)枸櫞酸誘發(fā)的咳嗽豚鼠均有顯著的止咳作用。

TRPA1蛋白是瞬時(shí)受體電位離子通道蛋白[4]，存在于肺部的表面神經(jīng)末梢，當(dāng)刺激性物質(zhì)或病原體伴隨空氣通過呼吸進(jìn)入肺部時(shí)，TRPA1蛋白將會(huì)被激活，引起Ca2+通透性改變后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生一系列效應(yīng)，導(dǎo)致咳嗽發(fā)生[5]。本文旨在研究新對(duì)葉百部堿對(duì)肺炎支原體肺炎小鼠肺組織TRPA1咳嗽因子的影響，旨在為其治療支原體肺炎提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品 新對(duì)葉百部堿標(biāo)準(zhǔn)品：成都瑞芬斯生物科技有限公司，批號(hào)：RFS-X07901904009,規(guī)格20 mg,加去離子水配制成0.015 g/L的溶液，儲(chǔ)存在-4 ℃?zhèn)溆?。阿奇霉素分散片：石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號(hào)：274150404，規(guī)格：0.25 g×6片×2板/盒。枸櫞酸噴托維林：上海玉瑞生物科技(安陽)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：190305，規(guī)格：25 mg×100 s。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡C576BL小鼠50只，體質(zhì)量20～22 g，雄性，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(黑)2009-001。飼養(yǎng)于室溫25 ℃和濕度60%的GLP實(shí)驗(yàn)室中。保持每日通風(fēng)情況良好，環(huán)境舒適，保證每日光照時(shí)間12 h。

1.3 試劑 肺炎支原體(ATCC 15531)購自American Type Culture Collection。PPLO：美國BD公司；RNA提取試劑盒：中國Tiangen公司；RPMI-1640：北京索萊寶科技有限公司；Real-Time PCR試劑盒：美國Promega公司；胎牛血清：美國Hyclone公司；引物合成：上海生物工程技術(shù)有限公司；免疫組化試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.4 儀器 Line Gene 9600Real-Time PCR儀：中國博日有限公司； M200多功能酶標(biāo)儀：奧地利TECAN公司；DP72熒光顯微鏡：日本Olympus奧林巴斯(深圳)工業(yè)有限公司。

2 方法

2.1 肺炎支原體培養(yǎng) 肺炎支原體在含有10%酵母浸液的2.1% PPLO并合用20%滅活胎牛血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔7 d對(duì)培養(yǎng)的支原體進(jìn)行1次傳代培養(yǎng)。

2.2 模型制備及分組給藥 50只小鼠稱重按相似體質(zhì)量分組放置，每組抽取體質(zhì)量相似小鼠1只進(jìn)行隨機(jī)分組，直至小鼠分組完成。分為正常組、模型組、阿奇霉素組、枸櫞酸噴托維林組、新對(duì)葉百部堿組，每組10只。除正常組外，其余各組小鼠滴鼻法感染50 μL106CCU肺炎支原體液，1次/日，連續(xù)滴鼻3 d建立MPP模型，造模成功后連續(xù)7 d灌胃給藥，新對(duì)葉百部堿組給藥劑量為1.2 mg/(kg·d)；阿奇組給藥劑量為32 mg/(kg·d)；枸櫞酸噴托維林組給藥劑量0.4 mg/(kg·d)(腹腔注射給藥)；正常對(duì)照組、模型組小鼠予等量純凈水，連續(xù)給藥1 周。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.3.1 引咳實(shí)驗(yàn) 末次給藥1 h后，將小鼠置于密閉容器內(nèi)，0.5 mL氨水浸潤棉球放置容器內(nèi)迅速倒扣防止氣體外溢，秒表記數(shù)。小鼠出現(xiàn)第1次咳嗽的時(shí)長為咳嗽潛伏期，計(jì)數(shù)在3 min內(nèi)小鼠咳嗽次數(shù)。

2.3.2 肺組織病理觀察 引咳實(shí)驗(yàn)完成后，脫頸處死小鼠，摘取新鮮完整肺大葉置于10%甲醛溶液中備用(至少24 h)，其余肺組織-80 ℃保存待用。將固定的肺組織取出，清水沖洗除去甲醛殘留，石蠟包埋，制成5 μm石蠟組織切片，隨后進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察。

2.3.3 免疫組化法檢測肺組織TRPA1表達(dá) 肺組織切片滴加覆蓋完全H2O2阻斷內(nèi)源性酶，然后滴加檸檬酸緩沖液抗原修復(fù)，按說明書滴加TRPA1(1∶300)比例配制好的孵育一抗，保持4 ℃濕潤孵育滿8 h，PBS沖洗-反應(yīng)增強(qiáng)液-二抗-DAB染色-蘇木精復(fù)染≤1 min-碳酸鋰返藍(lán)-水洗-梯度乙醇脫水-二甲苯5 min-封片。200倍鏡頭下觀察TRPA1蛋白的表達(dá)量。根據(jù)免疫組化IHC評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，每組切片選取3個(gè)不同視野，根據(jù)染色面積范圍及著色深淺程度計(jì)分，染色深淺程度(0分陰性著色，1分淡黃色，2分淺褐色，3分深褐色)，陽性范圍(1分：0～25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：76%～100%)。

2.3.4 Real-Time PCR檢測TRPA1 mRNA表達(dá) 取小鼠肺組織加入TRIzol試劑提取RNA，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測濃度后，將純度在1.9～2.0的RNA提取液稀釋至100 mg/L。反應(yīng)液根據(jù)PCR試劑盒說明書精準(zhǔn)配制。擴(kuò)增條件為：95 ℃10 min、95 ℃10 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s、40 個(gè)循環(huán)；溶解曲線分析：95 ℃ 10 s、臺(tái)階采樣、臺(tái)階溫度設(shè)置為0.5 ℃。引物基因序列：TRPA1-forward primers 5′-GCG GTT GGG GAC ATT GCT GAG-3′，TRPA1-Reverse primers 5′-TGG ATA CAC GAT GGT GGA CCT CTG-3′。β-actin forward primer: 5′-CTG GGA CGA CAT GGA GAA AA-3′，β-actin reverse primer: 5′-AAG GAA GGC TGG AAG AGT GC-3′。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間的均數(shù)，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠引咳實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見表1。

表1 各組小鼠引咳實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

3.2 各組小鼠肺組織病理變化 模型組出現(xiàn)肺泡

壁充血及肺泡塌陷，支氣管上皮脫落，炎性細(xì)胞大量浸潤。阿奇霉素組肺組織結(jié)構(gòu)相對(duì)于模型組有所改善，結(jié)構(gòu)清晰，炎性細(xì)胞浸潤減少。枸櫞酸噴托維林組結(jié)構(gòu)未明顯好轉(zhuǎn)，存在炎細(xì)胞浸潤情況。新對(duì)葉百部堿組結(jié)構(gòu)清晰，未見到大量炎性細(xì)胞浸潤，病變情況有所改善。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化(HE，×20)

3.3 各組小鼠肺組織TRPA1蛋白表達(dá)免疫組化檢測結(jié)果 模型組染色面積相對(duì)寬泛且著色相對(duì)較深。新對(duì)葉百部堿組著色較淺，各組計(jì)分均低于模型組；阿奇霉素組較模型組著色淺，計(jì)分低于模型組。見圖2，表2。

圖2 各組小鼠肺組織TRPA1蛋白表達(dá)的免疫組化檢測結(jié)果(×200)

表4 各組小鼠肺組織TRPA1蛋白及mRNA表達(dá)的比較

3.4 各組小鼠肺組織TRPA1mRNA表達(dá)的 Real-Time PCR檢測結(jié)果 見表2。

4 討論

百部為百部科植物直立百部[Stemona sessilifolia (Miq.) Miq.]、蔓生百部[Stemona japonica (Bl.) Miq.]或?qū)θ~百部(Stemona tuberosa Lour.)的干燥塊根[6]，其性味甘、苦，微溫，歸肺經(jīng)，具有溫潤肺氣、止咳和殺蟲之功效，主要成分為生物堿類、聯(lián)苯類化合物和對(duì)百部醇等，藥理作用以抗菌、殺蟲、止咳、平喘等為主。在百部的臨床應(yīng)用方面，歷代醫(yī)家已積累了大量的經(jīng)驗(yàn)，主要用于辨證治療外感咳嗽、暴嗽、久咳等，多與其他中藥配合使用[7]。百部在急(慢)性咳嗽、肺結(jié)核、肺炎、 慢性支氣管炎等呼吸系統(tǒng)疾病治療中有較為廣泛的應(yīng)用， 臨床療效亦得到了普遍的認(rèn)可[8-9]。Chung等[10]比較了對(duì)葉百部根的水提物、總生物堿和5種斯替寧堿型(stenine group)生物堿單體的止咳活性，發(fā)現(xiàn)在生物堿單體中，新對(duì)葉百部堿的止咳活性最強(qiáng)，其強(qiáng)度與同等質(zhì)量濃度的磷酸可待因相當(dāng)[11-13]。

本研究通過觀察新對(duì)葉百部堿對(duì)TRPA1的表達(dá)的影響探究其鎮(zhèn)咳作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示新對(duì)葉百部堿能抑制肺炎支原體肺炎小鼠咳嗽的發(fā)生發(fā)展，減少咳嗽次數(shù)及延長咳嗽潛伏期，同時(shí)HE結(jié)果顯示新對(duì)葉百部堿可改善支原體肺炎小鼠肺組織結(jié)構(gòu)，并下調(diào)TRPA1蛋白表達(dá)量及其mRNA的表達(dá)量。表示新對(duì)葉百部堿對(duì)MPP咳嗽具有治療作用。

綜上所述，新對(duì)葉百部堿可能通過抑制TRPA1通道蛋白的表達(dá)而達(dá)到抑制咳嗽效果，為新對(duì)葉百部堿的鎮(zhèn)咳作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)根據(jù)。