田青松 劉建軍 李新志 周 游 胡兆華

(三峽大學(xué) 附屬仁和醫(yī)院 骨科， 湖北 宜昌 443001)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種最常見(jiàn)的骨關(guān)節(jié)疾病。軟骨細(xì)胞的凋亡在OA的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。竹節(jié)參是一個(gè)兼具人參和三七雙重功效的藥物，其主要活性成分竹節(jié)參總皂苷(total saponins ofpanaxjaponicus, TSPJ)能夠預(yù)防和顯著減輕大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的病變[1-2]。TSPJ對(duì)OA治療及其機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT 1)可以通過(guò)抑制凋亡和炎癥等來(lái)調(diào)控細(xì)胞衰老，影響軟骨細(xì)胞存活，使軟骨區(qū)域糖蛋白減少，鈣元素沉積加速，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變[3]。OA發(fā)生時(shí)，軟骨細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)水平顯著降低，抑制SIRT1表達(dá)可引起軟骨細(xì)胞凋亡[4]。另一項(xiàng)研究表明，SIRT1可以通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路減少細(xì)胞凋亡[5]。因而，本研究旨在探討TSPJ是否通過(guò)激活關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的SIRT1并進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游的NF-κB，而最終影響軟骨細(xì)胞的凋亡，為T(mén)SPJ治療OA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

竹節(jié)參購(gòu)于湖北省恩施竹節(jié)參種植基地，經(jīng)三峽大學(xué)湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定為五加科人參屬植物。TSPJ：取竹節(jié)參干燥根莖粗粉，加入60%乙醇加熱回流3次，合并濾液后濃縮干燥，得到竹節(jié)參總提物粉末，得率為25.8%[1-2]。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(human articular chondrocytes， HC-A)購(gòu)于美國(guó)ScienCell；胎牛血清購(gòu)于杭州天杭生物科技有限公司；胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Gibico公司；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetra zolium, MTT)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；Trizol提取試劑盒、RT-PCR試劑盒購(gòu)于大連寶生物科技有限公司；PCR引物購(gòu)于上海生工生物有限公司；SIRT1抗體、NF-κB抗體、Tubulin抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司。

1.2 儀器

NU-4750E型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Nu Aire公司；DMR型多功能顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)購(gòu)于英國(guó)Syngne公司；SW-4T-2F潔凈工作臺(tái)購(gòu)于上海江萊生物科技有限公司；MK3全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)于賽默飛世爾科技公司；Gene Genius凝膠分析系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Syngne公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HC-A細(xì)胞以含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱。以0.25%胰酶消化傳代，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理

采用LPS誘導(dǎo)HC-A細(xì)胞損傷，隨機(jī)分為對(duì)照組，低、中、高劑量TSPJ藥物干預(yù)組。細(xì)胞孵育24 h后，各組分別加入100 ng/mL LPS刺激8 h，低、中、高劑量治療組分別加入TSPJ 10、20、40 mg/L，對(duì)照組給予同等劑量生理鹽水，繼續(xù)孵育12 h，檢測(cè)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。

1.5 MTT檢測(cè)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞HC-A的增殖能力

取各組HC-A細(xì)胞，接種于12孔板內(nèi)，每孔100 μL，每孔8×103個(gè)細(xì)胞，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。12孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后每孔加入三聯(lián)裂解液[10%SDS+5%異丁醇+1%HCl(10 mol/L)]100 μL，37℃孵育過(guò)夜后，酶標(biāo)儀于570 nm處讀取吸光度(optical density, OD)值，以O(shè)D值來(lái)反映細(xì)胞的增殖活性。

1.6 半定量RT-PCR檢測(cè)Caspase3 mRNA水平

取各組HC-A細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，向每孔細(xì)胞加入1mL Trizol試劑，以Trizol試劑一步法提取細(xì)胞總RNA，隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR，以β-actin為內(nèi)參。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 1 min；72℃延伸5 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。凝膠成像分析儀測(cè)定光密度，以待測(cè)基因與相應(yīng)內(nèi)參的光密度比值作為mRNA的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行半定量分析。本實(shí)驗(yàn)所用引物序列如下：

Caspase-3上游：5’-TGT GGC ATT GAG ACA GAC-3’，下游：5’-CAC TTG CCA TAC AAA CTA-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度371 bp；

β-actin 上游：5’-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3’，下游：5’-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度205 bp。

1.7 Western Blot法檢測(cè)SIRT1、NF-κB蛋白表達(dá)

取各組細(xì)胞分別加入蛋白裂解液，離心提取蛋白，上樣電泳、轉(zhuǎn)膜。取出硝酸纖維素薄膜封閉清洗，加入相應(yīng)一抗(NF-κB 1∶1 000，SIRT1 1∶300)4℃孵育過(guò)夜，洗膜后二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h。5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-inodlyl-phosphate，BCIP)/硝基四氮唑蘭(nitro-blue tetrazolium，NBT)顯色，測(cè)定目的蛋白條帶亮度。以Tubulin為內(nèi)參，以目的蛋白/內(nèi)參作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HC-A細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，經(jīng)TSPJ處理后，HC-A細(xì)胞的增殖均較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(均P<0.05)。SNK檢驗(yàn)多重比較顯示，低劑量與中、高劑量TSPJ組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，但中、高劑量TSPJ組兩兩比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與低劑量TSPJ組相比，#P<0.05

2.2 竹節(jié)參總皂苷對(duì)Caspase3 mRNA的影響

半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)TSPJ處理后，HC-A細(xì)胞的Caspase3 mRNA明顯下降(P<0.05)，且隨著劑量的增大，TSPJ對(duì)HC-A細(xì)胞中Caspase3 mRNA表達(dá)的抑制作用更明顯，低、中、高劑量TSPJ組各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

注：A：半定量RT-PCR檢測(cè)Caspase3 mRNA條帶圖；B：Caspase3 mRNA相對(duì)表達(dá)量柱狀圖。與對(duì)照組相比，*P<0.05；與低劑量TSPJ組相比，#P<0.05；與中劑量TSPJ組相比，&P<0.05

2.3 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HC-A細(xì)胞SIRT1和NF-κB蛋白表達(dá)的影響

Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TSPJ處理HC-A細(xì)胞后，低、中、高劑量TSPJ組SIRT1水平顯著上調(diào)(均P<0.05)，低、中、高劑量TSPJ組NF-κB水平顯著下調(diào)(均P<0.05)，且隨著劑量的增大，TSPJ對(duì)SIRT1的上調(diào)和NF-κB的下調(diào)作用增強(qiáng)，見(jiàn)圖3。

注：A：Western Blot檢測(cè)SIRT1和NF-κB蛋白表達(dá)條帶圖；B：SIRT1蛋白相對(duì)表達(dá)量柱狀圖；C：NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量柱狀圖。與對(duì)照組相比，*P<0.05；與低劑量TSPJ組相比，#P<0.05；與中劑量TSPJ組相比，&P<0.05

3 討論

OA是一種由異常生物力學(xué)引起、以關(guān)節(jié)軟骨破壞為主的關(guān)節(jié)疾病，是導(dǎo)致50歲以上人群功能性殘疾的主要疾病之一[6]。關(guān)節(jié)軟骨的退變和缺失以及關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨的慢性炎癥是其基本病理表現(xiàn)[7]。目前OA的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確。年齡、性別、家族易感性、局部生物力學(xué)因素、軟骨細(xì)胞凋亡及細(xì)胞因子降解酶等都與OA的發(fā)生相關(guān)[8]。其中，軟骨細(xì)胞的凋亡在OA的發(fā)病中發(fā)揮著極其重要的作用[9]。

竹節(jié)參是一個(gè)兼具人參和三七雙重功效的常用中草藥，TSPJ是竹節(jié)參的主要活性成分。大量研究已經(jīng)證實(shí)，竹節(jié)參在抗炎、抗心肌缺血、保護(hù)肝損害和延緩衰老方面具有重要的作用[10]。近年來(lái)，TSPJ在關(guān)節(jié)炎的治療方面也有初步的研究報(bào)道，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)TSPJ能夠預(yù)防和顯著減輕大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的病變，體外實(shí)驗(yàn)也表明TSPJ可有效抑制體外培養(yǎng)的膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞的增殖[2,11]。臨床上也觀察到復(fù)方竹節(jié)參口服聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉關(guān)節(jié)腔注射，能明顯緩解膝骨性關(guān)節(jié)炎的癥狀[12]。然而對(duì)于TSPJ治療OA的機(jī)制尚不明確，TSPJ對(duì)軟骨細(xì)胞的作用研究鮮有報(bào)道。本研究中，TSPJ可以增強(qiáng)HC-A細(xì)胞增殖活性，并抑制軟骨細(xì)胞凋亡標(biāo)志物Caspase3的表達(dá)。

SIRT1是一個(gè)依賴(lài)于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙?；?。SIRT1可調(diào)控許多下游基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而通過(guò)抑制凋亡、調(diào)控新陳代謝以及抑制炎癥等多個(gè)方面來(lái)調(diào)控細(xì)胞的衰老[13-14]。SIRT1基因通過(guò)調(diào)節(jié)通路中蛋白的乙?；绊戃浌羌?xì)胞存活，使軟骨區(qū)域糖蛋白減少，鈣元素沉積加速，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變[3]。OA發(fā)生時(shí)，軟骨細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)水平明顯降低，激活SIRT1表達(dá)可抑制軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活[6]。而軟骨細(xì)胞凋亡不僅加速成骨細(xì)胞和血管進(jìn)入，還伴有鈣的積累和基質(zhì)鈣化，加速關(guān)節(jié)軟骨病理性退變。因此，SIRT1基因在OA關(guān)節(jié)軟骨的退變中起到重要作用。NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞損傷、應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的核心通路，在OA的發(fā)生中也起到了重要作用[5,15]。SIRT1可使NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的亞單位p65蛋白等去乙?；龠M(jìn)細(xì)胞存活，減少細(xì)胞凋亡[16]。在脊髓損傷誘發(fā)肺損傷的動(dòng)物模型試驗(yàn)中，SIRT1激活劑可上調(diào)SIRT1表達(dá)，抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制細(xì)胞凋亡[17]。此次體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，TSPJ可濃度依賴(lài)性上調(diào)SIRT1抑制NF-κB的表達(dá)。

綜上所述，TSPJ可通過(guò)調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的SIRT1/NF-κB信號(hào)通路，抑制軟骨細(xì)胞的凋亡。