付超群 周大標(biāo) 石 全

(1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)， 湖北 武漢 430065； 2. 湖北中醫(yī)藥大學(xué) 附屬湖北省中醫(yī)院 皮膚科， 湖北 武漢 430061； 3. 湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院， 湖北 武漢 430015)

帶狀皰疹是由水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zostervirus, VZV)引起的感染性皮膚疾病，常表現(xiàn)為受累區(qū)域疼痛及單側(cè)周圍神經(jīng)簇狀水泡聚集，年齡增長和免疫抑制是VZV再激活的兩個(gè)主要誘發(fā)因素。帶狀皰疹最常見的并發(fā)癥是帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛，其復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。目前西醫(yī)主要采取抗病毒、鎮(zhèn)痛、營養(yǎng)神經(jīng)及疫苗接種等對(duì)癥治療，但西藥會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)[2]。

中醫(yī)藥是祖國醫(yī)學(xué)的瑰寶，在帶狀皰疹治療方面具有豐富經(jīng)驗(yàn)并取得較好的臨床效果?，F(xiàn)代藥理研究表明紫草、白鮮皮具有抗炎、鎮(zhèn)痛及抗氧化等特性，可以改善帶狀皰疹患者生活質(zhì)量，促進(jìn)皮疹愈合，在減輕疼痛以及預(yù)防相關(guān)并發(fā)癥方面療效明確[3-4]。然而，由于中藥成分的復(fù)雜多樣性，目前有關(guān)紫草、白鮮皮治療帶狀皰疹的確切機(jī)制仍不清楚。因此本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)紫草-白鮮皮治療帶狀皰疹的可能機(jī)制進(jìn)行探討，為臨床治療帶狀皰疹提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 紫草-白鮮皮有效成分篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索紫草-白鮮皮有效成分，按照口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%，類藥性(drug-likeness, DL)≥0.18的條件篩選[5]。

1.2 疾病靶點(diǎn)獲取

使用OMIM、Disgenet、GeneCards以“herpeszoster”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得相關(guān)疾病作用靶點(diǎn)。

1.3 藥物疾病靶點(diǎn)篩選

在Venny 2.1在線軟件將上述獲得的藥物與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得紫草-白鮮皮治療帶狀皰疹的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

使用Cytoscape 3.8.2軟件，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

在STRING數(shù)據(jù)庫中輸入藥物-疾病靶點(diǎn)并進(jìn)行檢索，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.6 GO和KEGG富集分析

基于R軟件使用Bioconductor生物信息軟件包進(jìn)行關(guān)鍵靶基因的基因本體(gene ontology, GO)與京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)功能富集分析。

2 結(jié)果

2.1 中藥、疾病化學(xué)成分篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫對(duì)白鮮皮-紫草的有效成分進(jìn)行篩選，獲得紫草潛在活性成分11個(gè)(見表1)，白鮮皮活性成分18個(gè)(見表2)。在OMIM、Disgenet、GeneCards數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，篩選出645個(gè)藥物靶點(diǎn)，去重后獲得疾病靶點(diǎn)473個(gè)。繪制韋恩圖，取交集后獲得中藥疾病共同靶點(diǎn)52個(gè)(見圖1)。

表1 TCMSP數(shù)據(jù)庫中保留的紫草藥物活性成分表

表2 TCMSP數(shù)據(jù)庫中保留的白鮮皮藥物活性成分表

圖1 白鮮皮-紫草與帶狀皰疹靶點(diǎn)韋恩圖

2.2 中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將中藥紫草、白鮮皮中29個(gè)活性成分與52個(gè)藥物-疾病靶點(diǎn)輸入Cytoscape軟件中，繪制“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)。靶點(diǎn)關(guān)系顯示白鮮皮、紫草主要有芋茵素、乙酰紫草素、谷甾醇、黃芩素及槲皮素等成分可發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化及營養(yǎng)神經(jīng)的作用，達(dá)到治療帶狀皰疹的目的。

注：紫色代表中藥紫草-白鮮皮，綠色代表中藥24種活性成分，藍(lán)色代表52個(gè)共同靶點(diǎn)，紅色代表帶狀皰疹疾病

2.3 PPI蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述52個(gè)共同靶點(diǎn)輸入到STRING數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，獲取靶點(diǎn)關(guān)系數(shù)據(jù)，將其導(dǎo)入Cytoscape軟件，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3A)。其中主要靶點(diǎn)有腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)、絲氨酸激酶(serine/threonine-protein kinase, AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3, MAPK3)、雌激素受體1(estrogen receptor 1, ESR1)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, MTOR)等(見圖3B)，這些靶點(diǎn)與免疫調(diào)節(jié)、炎癥、病毒基因復(fù)制、細(xì)胞增殖分化相關(guān)。

注：A：蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(節(jié)點(diǎn)的大小、顏色及其深淺變化代表degree值的大小)；B：基于PPI拓?fù)浞治龅暮诵陌悬c(diǎn)排序(degree排名前30)

2.4 GO與KEGG功能富集分析

使用R語言將中藥紫草-白鮮皮與帶狀皰疹疾病的52個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO與KEGG分析。GO通路獲得1 465條生物學(xué)過程(如圖4A)、50條細(xì)胞組分(如圖4B)及79個(gè)分子功能(如圖4C)，這三部分涉及細(xì)胞凋亡、物質(zhì)合成轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝等方面。KEGG功能富集獲得146條通路，主要有人乳頭瘤病毒感染、愛潑斯坦-巴爾病毒感染、PD-L1在癌癥中的表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、AGE-RAGE信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用，其中排名前20的結(jié)果形成KEGG功能富集的條形圖(如圖4D)。藥紫草-白鮮皮主要是通過這些通路增強(qiáng)免疫、抑制病毒復(fù)制，達(dá)到抗炎、止痛的作用。

注：A：GO富集分析生物學(xué)過程； B：GO富集分析細(xì)胞組分； C：GO富集分析分子功能； D：KEGG富集分析

3 討論

針對(duì)帶狀皰疹的常規(guī)治療，臨床主要目標(biāo)是緩解急性期疼痛、縮短皮損持續(xù)時(shí)間、防止皮損擴(kuò)散、預(yù)防或減輕帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛等并發(fā)癥，主要藥物有阿昔洛韋、膦甲酸鈉、普瑞巴林及糖皮質(zhì)激素等對(duì)癥治療，但是對(duì)癥治療過程中，有相對(duì)較多的禁忌癥并且遠(yuǎn)期效果不甚理想[6]。近年來中藥由于具有療效顯著、服用安全等特點(diǎn)，受到持續(xù)關(guān)注?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，本研究表明紫草-白鮮皮含有的芋茵素、乙酰紫草素、谷甾醇、黃芩素及槲皮素等成分。研究表明，芋茵素抑制促炎細(xì)胞因子水平[7]；乙酰紫草素通過自噬途徑使病毒顆粒失活顯示出抗病毒活性及抗氧化特性[8]；谷甾醇通過抑制白介素-6和TNF發(fā)揮抗炎作用及免疫調(diào)節(jié)特性[9]；槲皮素能夠阻止病毒進(jìn)入或抑制病毒聚合酶復(fù)制[10]；黃芩素降低單純皰疹病毒誘導(dǎo)的NF-κB和MAPK通路激活，減少病毒復(fù)制[11]。因此紫草-白鮮皮的中藥成分主要是限制病毒復(fù)制對(duì)神經(jīng)的損傷和降低炎癥因子的釋放，修復(fù)受損皮膚，從而達(dá)到抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化及營養(yǎng)神經(jīng)等效果，以此達(dá)到治療帶狀皰疹的作用[12]。

PPI構(gòu)建靶點(diǎn)分析表明，紫草-白鮮皮治療帶狀皰疹的主要靶蛋白是TNF、STAT3、AKT1、MAPK3、ESR1及MTOR等。TNF是反映機(jī)體免疫功能的重要細(xì)胞因子，參與機(jī)體內(nèi)微環(huán)境的生理平衡，發(fā)生失衡就會(huì)誘發(fā)相關(guān)的免疫紊亂和異常，如TNF-α在帶狀皰疹病毒引起神經(jīng)性疼痛的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著極其重要的作用[13]。STAT3蛋白在VZV感染的細(xì)胞中表達(dá)豐富，并且可通過免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-6來調(diào)節(jié)通路中的自噬因子[14]。AKT1是一種參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、存活和增殖的多功能蛋白，在G1/S進(jìn)展中起作用。AKT1參與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)，通過下游底物刺激細(xì)胞增殖，對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程和調(diào)解具有多重影響；同時(shí)通過控制新陳代謝和蛋白質(zhì)合成，AKT可確保細(xì)胞生長與細(xì)胞周期相協(xié)調(diào)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖[15]。MAPK的激活可上調(diào)自噬激活激酶1以控制線粒體自噬，除去功能失調(diào)的線粒體并減輕細(xì)胞氧化；MAPK和減數(shù)分裂有關(guān)，抑制基因表達(dá)及細(xì)胞增殖[16]。ESR是一種核受體超家族的轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)雌激素配體促進(jìn)細(xì)胞生長和存活，是細(xì)胞增殖相關(guān)生理過程的重要調(diào)節(jié)劑[17]。MTOR蛋白激酶協(xié)調(diào)細(xì)胞生長的環(huán)境條件；MTOR還抑制CD8+和CD4+效應(yīng)T細(xì)胞的分化和擴(kuò)增[18]。這些關(guān)鍵核心蛋白分子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥、降低病毒基因控制、調(diào)控細(xì)胞增殖分化和周期，從而達(dá)到改善VZV帶來的不利影響。

GO生物功能富集分析表明紫草-白鮮皮藥物成分的靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)基因分子功能主要涉及蛋白酶活性、磷酸酶及細(xì)胞因子受體等方面，生物過程涉及細(xì)胞膠質(zhì)生成和酶活性的正向調(diào)節(jié)，細(xì)胞組分涉及膜筏、膜微域及膜區(qū)等，上述靶點(diǎn)蛋白主要與細(xì)胞凋亡、物質(zhì)合成轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝有關(guān)，其中酶活性在紫草-白鮮皮治療帶狀皰疹中發(fā)揮重要作用。KEGG表明紫草-白鮮皮主要涉及的信號(hào)通路包括人乳頭瘤病毒感染、愛潑斯坦-巴爾病毒感染、PD-L1在癌癥中的表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、AGE-RAGE信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用。Epstein-Barr病毒和卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒為了確保病毒基因組在細(xì)胞分裂過程中不會(huì)丟失，通過蛋白質(zhì)中間體將病毒基因組連接到宿主有絲分裂染色體上[19]。PD-1的表達(dá)與T細(xì)胞功能受損、病毒載量增加和細(xì)胞凋亡敏感性增加有關(guān)。T細(xì)胞感染VZV會(huì)誘導(dǎo)PD-1表達(dá)，并且?guī)畎捳罨颊咴谠偌せ钇陂gT細(xì)胞中的PD-1表達(dá)也會(huì)升高，PD-1通過與程序性死亡配體或PD-L2結(jié)合來引發(fā)其免疫抑制功能，大大降低免疫系統(tǒng)清除病毒的有效性。在VZV感染期間阻斷PD-L1，將增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞效應(yīng)功能，導(dǎo)致IFNγ分泌水平顯著升高，可以逆轉(zhuǎn)VZV介導(dǎo)的免疫抑制，從而減弱與VZV相關(guān)的病毒傳播和多系統(tǒng)疾病[20]。VZV再激活會(huì)產(chǎn)生血管病變和巨噬細(xì)胞升高，巨噬細(xì)胞中的AGE-RAGE相互作用誘導(dǎo)其向炎癥表型激活，導(dǎo)致促炎介質(zhì)過度產(chǎn)生，這是神經(jīng)炎癥和神經(jīng)變性的主要原因。氧化應(yīng)激參與AGE-RAGE的形成，AGEs激活RAGE和toll樣受體，通過下游信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)揮其炎癥作用，活化的巨噬細(xì)胞與一些代謝和炎癥疾病的進(jìn)展有關(guān)[21]。AGEs可與RAGE相互作用，導(dǎo)致某些信號(hào)通路的激活及細(xì)胞趨化因子和其他炎癥介質(zhì)的過量產(chǎn)生，最終誘發(fā)炎癥，RAGE的過表達(dá)會(huì)觸發(fā)NF-κB激活，進(jìn)而介導(dǎo)炎癥、細(xì)胞凋亡和增殖等細(xì)胞過程[22]。

綜上所述，中藥紫草-白鮮皮所含槲皮素、谷甾醇、乙酰紫草素、芋茵素、黃芩素等成分主要是通過病毒、PD-L1、AGE-RAGE信號(hào)通路控制TNF、蛋白激酶、激素受體等核心蛋白，使其跨過膜筏、膜區(qū)細(xì)胞膜，發(fā)揮抗氧化、抗炎、控制細(xì)胞自噬凋亡及抑制病毒復(fù)制的作用，從而達(dá)到治療帶狀皰疹的目的。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)表明中藥治療皮膚病有一定的優(yōu)勢(shì)，紫草-白鮮皮可通過多靶點(diǎn)及多途徑作用于疾病的治療中，本研究預(yù)測(cè)了紫草-白鮮皮治療帶狀皰疹的潛在機(jī)制。但是需要更多的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為臨床使用提供更多新的證據(jù)支持。