周大標 吳冰心 汪松林 吳 釩 李志鋼

(1. 湖北中醫(yī)藥大學， 湖北 武漢 430065； 2. 湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 骨科， 湖北 武漢 430015； 3. 南京中醫(yī)藥大學 附屬蘇州市中醫(yī)院 骨科， 江蘇 蘇州 215009)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是女性最常見的骨骼疾病，以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)退化導致骨脆性增加為特點。由于絕經(jīng)后女性卵巢功能衰退導致雌激素分泌不足，后者對破骨細胞的抑制作用減弱，致使骨吸收大于骨形成，使骨骼出現(xiàn)骨丟失的病理變化[1]。PMOP在古代醫(yī)籍并無病名記載，中醫(yī)如今將其歸納為“骨痿”“骨枯”等范疇。《素問·上古天真論》曰：女子七七，任脈虛，天癸竭，地道不通，因此認為“腎虛精虧”是女性PMOP發(fā)生的主要病機，腎主骨生髓，腎虛則精血化生無源，精枯髓減則導致骨骼脆性增加，痿弱難用，故而引發(fā)PMOP[2]。

PMOP與其他慢性疾病一樣，需要長期個體化治療。服用抗骨質(zhì)疏松西藥需要聯(lián)合或序貫治療，存在副作用大、有藥物假期以及停藥后骨量會迅速下降等問題[1]。因此，亟待探索更有效的藥物及治療思路。近年研究表明，中醫(yī)中藥治療PMOP效果顯著，其價格適中、不良反應小并且可整體調(diào)節(jié)[3]。

網(wǎng)絡藥理學可識別和篩選出有效活性成分及作用于疾病的潛在作用靶點，并構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡，為中醫(yī)藥治療疾病提供嶄新理念和研究途徑。牛膝、補骨脂具有補腎陽、滋腎陰、填精髓功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，兩藥具有抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、抗氧化、抗炎、減少骨量丟失等多種藥理作用[4-5]。兩藥藥性溫和、不良反應小，常用于肝腎虧虛型PMOP的治療。牛膝-補骨脂藥對成分復雜，其作用機理仍不完全清楚，本研究基于網(wǎng)絡藥理學分析牛膝-補骨脂的活性成分、作用靶點及其可能的作用機制，以期為臨床應用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與統(tǒng)計學軟件

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫TCMSP、TCMID及Swiss Target Prediction，人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)，基因組數(shù)據(jù)庫Genecards，藥物靶標數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database, TTD)，蛋白相互作用String數(shù)據(jù)庫。應用的軟件包括Venny 2.1，Cytoscape 3.8.2，R 4.0.5軟件等[6]。

1.2 方法

1.2.1 “牛膝-補骨脂”藥對主要活性成分及靶點篩選

在TCMSP及TCMID數(shù)據(jù)庫中檢索“牛膝，補骨脂”成分，口服利用度(oral bioavailability, OB)≥30% 和類藥性(drug like ness, DL)≥0.18 表示化合物能被較好吸收循環(huán)并具有更好的藥理特性，以此為篩選條件從TCMSP獲取有效成分對應的靶點。

1.2.2 PMOP相關(guān)靶點獲取

以“postmenopausal osteoporosis”為檢索詞，在GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫中檢索得到PMOP相關(guān)靶點，對搜集到的疾病靶點處理、去重后得到PMOP的相關(guān)靶點。

1.2.3 “牛膝-補骨脂”藥對與PMOP共同靶點的篩選

運用Venny 2.1軟件將1.2.1獲得的“藥物-靶點”與1.2.2獲得的“疾病-靶點”進行映射，繪制Venny圖并得到“牛膝-補骨脂”藥對治療PMOP的交集潛在作用靶點。

1.2.4 “中藥-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構(gòu)建及分析

標識1.2.3步驟獲取的靶點集導入Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“藥材-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖。使用Network Analyzer功能對牛膝、補骨脂的活性成分進行分析，篩選出核心成分并對其進行分析。

1.2.5 靶點蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡分析

將1.2.4中獲取的藥物-疾病潛在化學成分的共同靶點蛋白上傳至在線STRING數(shù)據(jù)庫，物種選擇“Homo sapiens”獲取蛋白互作信息，設置最低相互作用閾值0.4并構(gòu)建蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡圖。

1.2.6 GO生物功能與KEGG通路富集分析

基于R軟件獲取“牛膝-補骨脂”中藥治療PMOP的關(guān)鍵靶點，以Pvalue<0.05，Qvalue<0.05進行GO(gene ontology)與KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析，探討“牛膝-補骨脂”藥對治療PMOP的相關(guān)生物過程及信號通路，并將結(jié)果以條形圖和氣泡圖形式呈現(xiàn)。

1.2.7 分子對接實驗

將牛膝、補骨脂中篩選出來的關(guān)鍵活性成分作為配體，核心蛋白靶點作為受體進行分子對接實驗并將其可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 “牛膝-補骨脂”藥對主要活性成分、靶點預測以及PMOP作用靶點

通過TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫獲取中藥牛膝、補骨脂化合物及靶點，并對牛膝、補骨脂的有效成分進行篩選，共得到潛在活性成分53個(見表1)。

表1 中藥-成分-靶標基本信息統(tǒng)計表

使用Swiss Target Prediction篩選出648個藥物靶點；以“postmenopausal osteoporosis”為關(guān)鍵詞，分別在OMIM、Genecards、TTD數(shù)據(jù)庫進行檢索，對搜集到的PMOP靶點去重處理后共獲得靶點700個。

2.2 “牛膝-補骨脂”藥對與PMOP共同靶點的篩選

使用Venny 2.1軟件輸入篩選得到的648個藥物靶點和700個疾病靶點，繪制交集韋恩圖獲得藥物-疾病共同靶點135個(見圖1)。

圖1 牛膝-補骨脂與PMOP靶點韋恩圖

2.3 構(gòu)建“藥物-活性成分-PMOP-作用靶點”網(wǎng)絡

將牛膝-補骨脂篩選出的53個潛在活性成分與135個藥物-疾病共同靶點輸入Cytoscape 3.8.2軟件中，繪制出“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用的網(wǎng)絡圖(見圖2)。使用Network Analyzer對網(wǎng)絡圖進行核心成分拓撲分析，Degree值越大說明該成分越重要。Degree值靠前的活性成分，主要有脫皮甾酮、黃芩素、補骨脂查爾酮、山奈酚、槲皮素等。

注：橙色代表藥物，紫色代表牛膝-補骨脂中的52種活性成分(1個靶點無交集，予刪除)，綠色代表135個共同靶點，紅色代表疾??；PMOP：絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥； Psoralea Corylifolia： 補骨脂； Achyranthes Bidentata：牛膝

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡構(gòu)建及核心靶點分析

將135個交集靶點利用STRING軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡圖(見圖3A)，鄰接節(jié)點數(shù)目越多表示該基因在PPI中處于核心位置并起關(guān)鍵作用。將PPI網(wǎng)絡導入Cystoscap 3.8.2中，通過Network Analyzer進行拓撲分析，篩選核心靶點，前30個靶點使用R 4.0.5繪制條形圖(見圖3B)。結(jié)果顯示，蛋白激酶(AKT)、腫瘤壞死因子(TNF)、雌激素受體(ER)、應激活化蛋白激酶(JUN)等涉及代謝、增殖、細胞存活可能是“牛膝-補骨脂”藥對治療PMOP的核心靶點基因。

2.5 “牛膝-補骨脂”藥對治療PMOP的KEGG通路分析

經(jīng)R語言運行135個共同靶點后得到143條KEGG通路，排列前20的結(jié)果以KEGG功能富集條形圖(見圖4)呈現(xiàn)。富集結(jié)果顯示，主要與化學致癌作用受體激活、糖尿病中的AGE-RAGE信號通路、癌癥中的蛋白多糖、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化等涉及代謝、炎癥、免疫、抗氧化的多個方面相關(guān)。

圖4 “牛膝-補骨脂”藥對治療PMOP的KEGG富集分析

2.6 “牛膝-補骨脂”藥對治療PMOP的GO富集分析

將135個共同靶點經(jīng)R語言運行后GO分析選取生物學過程、細胞組分及分子功能3部分，具體結(jié)果見氣泡圖(見圖5)。氣泡大小、顏色分別代表基因個數(shù)與P值，氣泡越大基因個數(shù)越多，顏色越紅P值越小。GO結(jié)果顯示，富集的2 064條生物學過程通路中，主要涉及類固醇代謝、平滑肌細胞增殖、腺體發(fā)育、衰老及營養(yǎng)物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)通路等；富集的46條細胞組分表達過程中，主要涉及膜區(qū)、脂筏、膜微區(qū)、質(zhì)膜外側(cè)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔體及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器復合體等；富集的120個與分子功能相關(guān)的過程中，主要涉及核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇集合及血色素結(jié)合等。

A：生物學過程富集氣泡圖； B：細胞組分富集氣泡圖; C：分子功能富集氣泡圖

2.7 關(guān)鍵靶點的分子對接驗證

采用AutoDock Vina軟件將牛膝、補骨脂主要成分與TNF、AKT1、ESR1、JUN進行分子對接，結(jié)合能越小，成分與靶點蛋白結(jié)合越好。TNF與山奈酚結(jié)合能為-34.3 kJ/mol(見圖6A)、AKT1與β-脫皮甾酮為-32.5 kJ/mol(見圖6B)、ESR1與黃芩素為-31.4 kJ/mol(見圖6C)，JUN與槲皮素為-22.7 kJ/mol(見圖6D)。

注：A：TNF與山奈酚；B：AKT1與β-脫皮甾酮；C：ESR1與黃芩素；D：JUN與槲皮素

3 討論

既往研究顯示，牛膝和補骨脂兩藥配合使用，增強藥效，可在多層面、多途徑及多靶點上發(fā)揮益精填髓、補腎強骨之功效[7]。網(wǎng)絡藥理學可整體、系統(tǒng)地分析藥物治療疾病的機制?；诰W(wǎng)絡藥理學方法，研究發(fā)現(xiàn)牛膝、補骨脂治療PMOP的活性成分有β-脫皮甾酮(beta-ecdysterone)、黃芩素(baicalein)、補骨脂查爾酮(bavachalcone)、山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)。其中β-蛻皮甾酮具有促進蛋白質(zhì)合成、抗疲勞、促增殖、調(diào)節(jié)免疫的作用。β-蛻皮甾酮通過干擾破骨細胞的活性來抑制骨吸收，誘導間充質(zhì)干細胞的成骨分化，減少其凋亡，并通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的信號通路減輕骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展[8]。黃芩素通過破壞Wnt/β-catenin通路，降低破骨細胞的骨吸收活性并抑制破骨細胞分化，進而促進破骨細胞凋亡和自由基清除作用[9]。山奈酚通過調(diào)節(jié)雌激素受體，抑制脂肪生成和氧化應激，從而調(diào)節(jié)破骨細胞自噬和成骨細胞凋亡[10]。槲皮素通過抗氧化、抗炎，抑制破骨細胞生成的同時促進成骨[11]。補骨脂查爾酮具有延緩衰老的作用，通過干擾細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和AKt通路抑制前體細胞向破骨細胞分化[12]。

通過PPI網(wǎng)絡構(gòu)建以及拓撲分析后，我們認為AKT1、TNF、ESR1及JUN等可能是“牛膝-補骨脂”藥對治療PMOP的核心靶點基因。ERK調(diào)節(jié)細胞增殖和分化，活化PI3K磷酸化下游信號蛋白可減少破骨細胞自噬。腫瘤壞死因子的增加可促進Rankl表達，影響骨質(zhì)流失并在骨骼重建中發(fā)揮重要作用[13]。雌激素受體是一種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)激素。軟骨細胞中的雌二醇通過靶向激活ESR1，抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Erk2)的磷酸化活化，從而增加自噬通量并調(diào)節(jié)細胞增殖和分化，減少軟骨細胞凋亡[14]。應激活化蛋白激酶直接與特定的靶DNA序列相互作用，調(diào)節(jié)基因表達，通過激活c-Fos/c-Jun通路促進Rankl介導的破骨細胞形成和骨吸收，并誘導去卵巢小鼠的骨質(zhì)流失[15]。

GO與KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，本研究主要涉及化學致癌作用受體激活、糖尿病AGE-RAGE信號通路、癌癥蛋白多糖、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化等通路?；瘜W致癌作用-受體激活通路主要發(fā)揮抗腫瘤活性、改善葡萄糖代謝、減少圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后潮熱，以及調(diào)節(jié)抗氧化作用[16]。糖尿病AGE-RAGE信號通路具有增加成骨的功能。AGEs不僅通過上調(diào)RANKL誘導破骨細胞生成，還可通過抑制細胞生長、促進細胞凋亡和下調(diào)分化來影響成骨細胞[17]。癌癥中的蛋白多糖存在于基底膜和細胞外基質(zhì)中，充當基質(zhì)支架、生長因子庫和組織屏障[18]。脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路可誘導炎癥細胞因子、腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1的產(chǎn)生增加，加上衰老誘導氧化應激，更年期性激素產(chǎn)生減少，導致核因子κB配體受體激活劑水平增加，這可能參與骨質(zhì)流失和血管鈣化，導致鈣從骨骼轉(zhuǎn)移到血管壁[19]。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡藥理學發(fā)現(xiàn)牛膝-補骨脂治療PMOP的主要活性成分有脫皮甾酮、黃芩素、補骨脂查耳酮、山奈酚及槲皮素等。這些成分有可能是通過多種信號通路和多個途徑作用于蛋白激酶、腫瘤壞死因子、雌激素受體及應激活化蛋白激酶等多個核心靶點基因，發(fā)揮抗炎、抗衰老及抗氧化的作用，同時抑制破骨細胞活性，促進成骨細胞分化，從而達到骨代謝的動態(tài)平衡。通過網(wǎng)絡藥理學方法，建立可視化網(wǎng)絡，從多角度分析“牛膝-補骨脂”治療PMOP的藥理機制，為其臨床應用提供了更多的理論支撐。但本研究也顯示了很多未知的分子通路及作用機制，因此需要更進一步的實驗研究來探討牛膝-補骨脂治療PMOP的其它作用機制。