陳玉北 王覓柱

1.包頭醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古包頭 014031

結(jié)直腸癌是較常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)生率及病死率呈上升趨勢，分別居于第3 位和第5位。在亞太地區(qū)，我國結(jié)直腸癌的發(fā)生率處于首位，發(fā)病年齡逐漸年輕化，且有研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)生率城市高于農(nóng)村。該疾病嚴(yán)重威脅我國民眾的健康，有研究表明大部分的結(jié)直腸癌病例由結(jié)直腸腺瘤惡變引發(fā)，結(jié)直腸腺瘤已是公認(rèn)的癌前病變。結(jié)直腸腺瘤惡變的機(jī)制極其復(fù)雜，研究其分子機(jī)制具有重大意義。分化抑制因子1（differentiation inhibition factor 1，Id1）可抑制下游基因表達(dá)，起到抑制細(xì)胞分裂的作用，β–聯(lián)蛋白（β–catenin）是Wnt 通路的重要組成部分，在多種腫瘤中均存在Wnt 通路上調(diào)的情況。細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）可調(diào)控細(xì)胞周期，其高表達(dá)可引發(fā)細(xì)胞周期失控，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展。本研究通過檢測結(jié)直腸癌組織、癌旁組織、結(jié)直腸腺瘤中的Id1、β–catenin、cyclin D1 表達(dá)情況，分析其臨床意義并探討其可能的調(diào)控機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2021 年5 月至2021 年10 月包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心結(jié)直腸鏡下取病理的結(jié)直腸癌癌旁組織、結(jié)直腸腺瘤組織、結(jié)直腸癌組織各30 例，用于蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)。同時(shí)收集相應(yīng)組織的存檔蠟塊，用于免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。本研究全部病例均經(jīng)過病理確診，臨床資料完整。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未進(jìn)行任何抗腫瘤治療，未進(jìn)行放療和化療；癌旁組織距離腫瘤>5cm。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前經(jīng)過放療、化療等抗腫瘤治療；癌旁組織距腫瘤<5cm。

1.2 主要試劑

兔抗人Id1 多克隆抗體IgG（英國Abcam 公司，稀釋度為1∶50）；兔抗人β–catenin 單克隆抗體IgG（美國Proteintech 公司，稀釋度為1∶700）；兔抗人cyclinD1 單克隆抗體IgG（美國Proteintech 公司，稀釋度為1∶100）；酶標(biāo)山羊抗兔IgG 聚合物（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；BCA 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法

待測組織研磨后加入0.4ml 蛋白酶抑制劑和蛋白裂解液，12000 轉(zhuǎn)/min 離心10min，蛋白質(zhì)印跡法測上清液蛋白濃度，加樣到SDS–PAGE 中電泳，濃縮膠和分離膠電壓分別為80V、120V，時(shí)間分別為30min、70min。恒流400mA，轉(zhuǎn)膜2h，奶粉封閉后孵育一抗過夜，孵育二抗后顯影和曝片，Bio–rad 掃描條帶，ImageJ 測灰度值，所測灰度值進(jìn)行歸一化處理（除以內(nèi)參灰度），最終獲得相對蛋白表達(dá)量。內(nèi)參蛋白選取β–actin。

1.4 免疫組織化學(xué)法

蠟塊切片固定于載玻片，烤片后脫蠟，水化后修復(fù)，加入過氧化物酶阻斷劑，孵育10min，加入一抗過夜，加入二抗孵育20min，加入DAB 顯色液，顯色后馬上放入蒸餾水，復(fù)染、反藍(lán)、脫水后封片，顯微鏡下觀察。主要觀察指標(biāo)為染色強(qiáng)度及陽性率，強(qiáng)度評分：陰性為0 分、弱陽性為1 分、中陽性為2分、強(qiáng)陽性為3 分。陽性率評分：0 分，陰性；1 分，陽性率1%～33%；2 分，陽性率34%～66%；3 分，陽性率67%～100%。免疫組織化學(xué)評分由以上兩部分評分相加得出。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果

Id1 主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，β–catenin 主要表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，cyclin D1 主要表達(dá)于細(xì)胞核，陽性表達(dá)呈現(xiàn)棕黃色染色，見圖1。腺瘤組織中的Id1、β–catenin、cyclin D1 免疫組織化學(xué)評分均顯著高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），結(jié)直腸癌組織中的Id1、β–catenin、cyclin D1 免疫組織化學(xué)評分均顯著高于腺瘤組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05)，見圖2。Spearman 相關(guān)分析結(jié)果顯示，Id1 與β–catenin表達(dá)呈正相關(guān)（=0.399，<0.01），β–catenin 與cyclin D1 表達(dá)呈正相關(guān)（=0.440，<0.01）。

圖1 Id1、β-catenin、cyclinD1 免疫組織化學(xué)染色情況（×200）

圖2 3 種組織免疫組織化學(xué)評分比較

2.2 蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果表明Id1、β–catenin、cyclin D1在癌旁組織、結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌組織中均有表達(dá)，見圖3。腺瘤組織中的Id1、β–catenin、cyclin D1表達(dá)均顯著高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），結(jié)直腸癌組織中的Id1、β–catenin、cyclinD1 表達(dá)均顯著高于腺瘤組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），見圖4。Pearson 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)Id1與β–catenin 表達(dá)呈正相關(guān)（=0.306，<0.05）；β–catenin與cyclin D1 表達(dá)呈正相關(guān)（=0.367，<0.01）。

圖3 Id1、β-catenin、cyclin D1 的蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果

圖4 3 種組織中的Id1、β-catenin、cyclin D1 相對表達(dá)量比較

3 討論

近年來，隨著生活水平的提高，人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，高脂肪、高蛋白質(zhì)類食物攝入過多，結(jié)直腸癌患病人數(shù)明顯上升，2020 年結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)位居所有腫瘤的第3 位，死亡病例數(shù)位居第2位。研究表明，結(jié)直腸癌大多都經(jīng)歷由腺瘤發(fā)展到癌的典型病理過程，該過程一般需5～10 年，為早診斷、早治療提供了時(shí)間窗。臨床上，腺瘤惡變所引發(fā)的結(jié)直腸癌在全部病例中占比很高。因此，深入研究結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制十分重要。

Id1 屬于分化抑制因子（differentiation inhibition factor，Id）家族，在多種腫瘤中均表達(dá)升高，但仍無研究證明Id 基因突變及異常擴(kuò)增存在于腫瘤中，因此有學(xué)者將Id 稱為準(zhǔn)原癌基因。研究表明，Id1在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，尤其是低分化癌，其表達(dá)上調(diào)更為明顯。設(shè)法降低Id1 表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增生能力減弱、侵襲力下降，抑制Id1 表達(dá)，可抑制cyclin D1 表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期，降低S 期細(xì)胞比例，抑制細(xì)胞分裂。增加Id1 表達(dá)，則可增加結(jié)直腸癌組織新生血管密度。因此，Id1 在結(jié)直腸癌中起到十分重要的促進(jìn)作用，但關(guān)于Id1 在結(jié)直腸腺瘤惡變中的研究仍較少。本研究表明，Id1 在癌旁組織、腺瘤組織、結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)逐漸升高，這也許說明，Id1 在從腺瘤到癌這個(gè)典型的過程中發(fā)揮重要作用，Id1 有望成為新的腫瘤標(biāo)志物，用于結(jié)直腸腺瘤惡變的早期篩查，同時(shí)Id1 也有望成為治療的新靶點(diǎn)，通過抑制Id1 表達(dá)，抑制從腺瘤到癌的病理過程，阻斷結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

Wnt/β–catenin 通路的上調(diào)在多種腫瘤中均有腫瘤促進(jìn)作用。該通路的激活在結(jié)直腸癌中普遍存在，其調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的研究也較為廣泛，如下調(diào)結(jié)直腸癌中的該通路，可抑制c–Myc、T 細(xì)胞因子– 4 表達(dá)，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增生能力。該通路的下調(diào)也可降低腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。β–catenin 蛋白是通路中主要的信號分子，對該通路意義重大。Cyclin D1 是該通路下游分子，cyclin D1 激活可導(dǎo)致細(xì)胞周期失去原有節(jié)律，加快細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。Cyclin D1已被證實(shí)為原癌基因，cyclinD1 在正常組織細(xì)胞中呈恒量表達(dá)，在諸多腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，與腫瘤關(guān)系密切。本研究表明，β–catenin 及cyclin D1 在癌旁組織、結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌中的表達(dá)呈逐漸上升趨勢，提示在從結(jié)直腸腺瘤到結(jié)直腸癌的過程中，β–catenin 及cyclin D1 起到重要作用，有望成為新的腫瘤標(biāo)志物，應(yīng)用于結(jié)直腸腺瘤惡變的早期篩查中，同時(shí)也有望成為治療的新靶點(diǎn)，通過抑制其表達(dá)，從而阻斷結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

β–catenin 及cyclin D1 在癌旁組織、結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌中的表達(dá)呈依次上升趨勢，相關(guān)分析證明，二者的表達(dá)呈正相關(guān)性，這充分佐證cyclin D1 作為Wnt/β–catenin 通路的下游分子，受到通路的調(diào)節(jié)。有研究表明，結(jié)直腸癌細(xì)胞中的Id1 可通過激活PI3k/Akt 通路上調(diào)cyclin D1 表達(dá)。本研究證明Id1與β–catenin 呈正相關(guān)，這也許說明在結(jié)直腸腺瘤惡變過程中，Id1 也可能通過激活Wnt/β–catenin 通路進(jìn)而調(diào)控cyclin D1 表達(dá)，從而起到促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。由于結(jié)直腸腺瘤惡變過程中的分子生物學(xué)機(jī)制十分復(fù)雜，且本研究僅通過蛋白質(zhì)印跡法及免疫組織化學(xué)法進(jìn)行，若能進(jìn)一步通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)對該結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析及驗(yàn)證，則能進(jìn)一步闡釋該過程中的分子生物學(xué)機(jī)制，有望為早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療結(jié)直腸癌提供新的理論依據(jù)及分子生物學(xué)基礎(chǔ)。