鄧凱東, 潘文靜, 陸牡龍, 邊高瑞, 唐 倩, 陳玉華, 何曉芳

（金陵科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與食品工程學(xué)院, 江蘇南京 210038）

豆粕作為飼糧中蛋白質(zhì)的主要來源, 是畜禽養(yǎng)殖中應(yīng)用最普遍的植物性蛋白質(zhì)飼料, 因供求關(guān)系不平衡, 一些不法商販在利益驅(qū)使下, 會(huì)在豆粕中摻入其他成分, 以次充好、以假亂真, 擾亂飼料市場秩序, 危害畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn), 造成飼料安全和食品安全隱患。飼料摻假檢測多采用顯微鏡檢、化學(xué)分析等方法（陰正興等, 2008）, 但前者只能定性而不能定量分析, 后者測定繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、對操作人員和實(shí)驗(yàn)條件要求較高、存在化學(xué)試劑污染環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)等。近紅外光譜分析是近幾十年發(fā)展起來的一種新興技術(shù), 具有分析速度快、樣品適用范圍廣、樣品無需前處理、無需化學(xué)試劑、無環(huán)境污染、操作相對簡便等優(yōu)點(diǎn)。近紅外光是指波長介于780～2526 nm的電磁波, 照射物質(zhì)后會(huì)發(fā)生吸收、透射、散射和反射, 可反映物質(zhì)分子中含氫基團(tuán)（C—H、O—H、N—H、S—H等）的種類和數(shù)量, 因此, 近紅外反射（near-infrared reflectance；NIR）光譜適合于各種有機(jī)物的定性和定量分析, 已在畜禽飼料原料品質(zhì)檢測和質(zhì)量安全控制中廣泛應(yīng)用（徐淼等, 2019；李玉鵬等, 2017；劉帥等, 2016）, 在食品摻假（?en等, 2021；姚婉清等, 2020；張晶等, 2018；莫欣欣等, 2016；Cattaneo和Holroyd, 2013）和 飼 料 摻假（Rodionova等, 2021；孫丹丹等, 2015；孫丹丹等, 2014；Haughey等, 2013；石光濤等, 2009）的定性鑒別和定量分析中亦具有高度準(zhǔn)確性。豆粕中摻雜棉籽粕的NIR光譜分析方法尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬研究豆粕中摻雜棉籽粕的NIR特征光譜, 通過化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立、優(yōu)化和評價(jià)棉籽粕摻假率的NIR預(yù)測模型, 為豆粕摻假定量檢測提供新途徑和新方法。

1 材料與方法

1.1 樣品制備 豆粕和棉籽粕樣品采自江蘇某飼料廠, 用高速旋風(fēng)式粉碎機(jī)（FS-ll, 浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司）粉碎, 使之全部通過1 mm篩, 再用精密天平（準(zhǔn)確至0.001 g）稱取豆粕和棉籽粕, 按質(zhì)量百分比在豆粕中分別摻入0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%棉籽粕, 每個(gè)摻假水平各制備樣品30個(gè), 隨機(jī)選取20個(gè)樣品作為建模集、10個(gè)作為驗(yàn)證集, 各摻假樣品充分混合均勻后, 密封保存于塑料樣品袋中備用。

1.2 NIR光譜模型建立 通過傅里葉變換近紅外光譜儀（Tensor II, Bruker公司, 德國）獲取樣品的NIR光譜, 附件選用漫反射積分球（IntegratIR, PIKE Technologies, Inc.）, 掃 描光譜波數(shù)范圍為10000～4000 cm-1（波長1000～2500 nm）, 以空白背景作為參比。樣品裝填至掃描石英管容積2/3處, 每個(gè)樣品平行掃描采集光譜3次。實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度為22℃, 近紅外光源預(yù)熱1 h后, 按照儀器操作規(guī)程檢測近紅外光源信號干涉峰強(qiáng)度和幅度正常后開始采集樣品NIR光譜。

樣品NIR光譜由儀器自帶的化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件OPUS（版本7.5；Bruker公司, 德國）自動(dòng)獲取和處理。建模集樣品共采集了420個(gè)NIR光譜數(shù)據(jù), 其中14個(gè)被OPUS軟件判別為異常值而被剔除, 其余406個(gè)數(shù)據(jù)用于建模。建模集樣品的NIR光譜通過OPUS軟件自動(dòng)擬合預(yù)測模型, 包括采用矢量歸一化（SNV）、多元散射校正（MSC）、減去一條直線、最小—最大歸一化、消除常數(shù)偏移量、線性補(bǔ)償差減法等方法對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理, 保證光譜數(shù)據(jù)和含量數(shù)據(jù)間良好的相關(guān)性, 再通過偏最小二乘法（PLS）擬合豆粕中棉籽粕摻假率的NIR光譜預(yù)測模型, 最后再經(jīng)過優(yōu)化和檢驗(yàn), 根據(jù)交叉驗(yàn)證均方根誤差（RMSECV；代表預(yù)測模型誤差）, 并結(jié)合決定系數(shù)（R2）和斜率, 確定最優(yōu)預(yù)測模型：RMSECV越接近0、R2和斜率越接近1, 預(yù)測模型越準(zhǔn)確。

1.3 NIR光譜模型驗(yàn)證 每個(gè)摻假水平的10個(gè)驗(yàn)證集樣品（共計(jì)60個(gè)）采用與上述相同的方法獲取NIR光譜, 帶入上述擬合的NIR預(yù)測模型中, 計(jì)算棉籽粕摻假率的預(yù)測值, 再與摻假率真值比較, 擬合預(yù)測值與真值回歸方程, 并計(jì)算預(yù)測值的絕對誤差和相對誤差, 用于驗(yàn)證NIR預(yù)測模型的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 NIR預(yù)測模型評價(jià) 純豆粕和摻雜5%～30%棉籽粕的豆粕NIR光譜見圖1。經(jīng)OPUS軟件判別, 摻雜棉籽粕的豆粕NIR特征光譜范圍為6102.3～4247.6 cm-1, 約為近紅外光譜的最后1/3范圍, 即棉籽粕摻假比例不同的豆粕NIR光譜在上述光譜范圍存在明顯差異；在其他譜區(qū), 則無差異。表1為利用OPUS軟件在不同維數(shù)下擬合的建模集豆粕中棉籽粕摻假率的NIR光譜預(yù)測模型評價(jià)參數(shù)。OPUS軟件根據(jù)R2、RMSECV、斜率和預(yù)測偏差等參數(shù)選擇最佳維數(shù), 確定最優(yōu)預(yù)測模型。豆粕摻假棉籽粕的NIR光譜預(yù)測模型的推薦維數(shù)是5, 最優(yōu)預(yù)測模型的R2為0.975、RMSECV為1.58, 斜率為0.974（圖2）。

圖1 純豆粕（上）和摻雜不同比例棉籽粕的豆粕（下）NIR光譜

圖2 建模集豆粕中棉籽粕摻假率的NIR模型預(yù)測值和真值關(guān)系

表1 不同維數(shù)下建模集豆粕中棉籽粕摻假率的NIR光譜預(yù)測模型評價(jià)參數(shù)

2.2 NIR預(yù)測模型驗(yàn)證 驗(yàn)證集豆粕中棉籽粕摻假率的NIR光譜模型預(yù)測值和真值回歸關(guān)系見圖3。驗(yàn)證集豆粕中棉籽粕摻假率預(yù)測值和真實(shí)值回歸方程R2為0.960。隨著豆粕中棉籽粕摻假比例由5%逐步增加至30%, NIR光譜模型預(yù)測值的相對誤差則由15.0%降低至0.87%（表2）。

圖3 驗(yàn)證集豆粕中棉籽粕摻假率的NIR光譜模型預(yù)測值和真值關(guān)系

表2 驗(yàn)證集豆粕中棉籽粕摻假率的NIR光譜模型預(yù)測值驗(yàn)證

3 討論

化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件OPUS鑒別出豆粕中棉籽粕不同摻假含量的NIR特征光譜范圍為6102.3～4247.6 cm-1, 說明摻入不同水平棉籽粕的豆粕NIR光譜在特定范圍內(nèi)出現(xiàn)差異, 也證實(shí)了以NIR光譜分析技術(shù)對棉籽粕摻假量進(jìn)行定量預(yù)測是可行的, 為定量分析棉籽粕摻假量提供了建模依據(jù)。Haughey等（2013）研究發(fā)現(xiàn), 豆粕中摻入0.1%～2.0%三聚氰胺的NIR特征光譜范圍為9000～4000 cm-1。孫丹丹等（2014）則報(bào)道, 豆粕中摻入3%三聚氰胺或尿素后, NIR特征光譜分別出現(xiàn)在5066 cm-1和6812 cm-1附近, 反映了兩種摻假物中含H集團(tuán)氨基（-NH2）的變化。豆粕中摻入5.00%尿素聚合物的NIR特征光譜范圍為7567～3695 cm-1區(qū)間, 反映了尿素聚合物中氨基（-NH2）和羥基（-OH）的變化（孫丹丹等, 2015）。此外, 魚粉中摻入0.1%～15.0%三聚氰胺的NIR特征光譜范圍包括7560.0～7058.5、6915.8～6098.1和4601.6～4246.7 cm-1三 段（劉小莉等, 2010）。石光濤等（2009）發(fā)現(xiàn), 魚粉中摻雜2%～50%豆粕的NIR特征光譜范圍為5882.4～5555.6 cm-1。魚粉中摻入1%～33%肉骨粉后, NIR光譜在5882.4 cm-1附近出現(xiàn)顯著差異, 這主要是由于魚粉和肉骨粉的蛋白質(zhì)和飽和脂肪酸含量差異所致（楊增玲等, 2009）。

豆粕中摻假棉籽粕含量的NIR光譜最優(yōu)預(yù)測模型的決定系數(shù)達(dá)到0.975（表1和圖2）, 表明NIR光譜預(yù)測模型的擬合性好, 預(yù)測準(zhǔn)確性高, 可以準(zhǔn)確定量預(yù)測豆粕中摻雜的棉籽粕含量。利用NIR光譜可以準(zhǔn)確檢驗(yàn)豆粕中摻入的三聚氰胺, 在去皮豆粕或烘烤豆粕中摻入0.1%～2.0%三聚氰胺的NIR光譜預(yù)測模型的R2介于0.89～0.99, RMSECV為0.081～0.276（Haughey等, 2013）。魚粉中摻雜0.1%～15.0%三聚氰胺的NIR光譜定量分析最優(yōu)模型的R2則為0.948（劉小莉等, 2010）。此外, 定量分析魚粉中摻假肉骨粉含量的NIR光譜預(yù)測模型R2分別達(dá)到了0.90（湛小梅等, 2009）、0.94（Murray等, 2001）和0.95（楊 增 玲等, 2009）。石光濤等（2009）擬合了魚粉中摻雜2%～50%豆粕的NIR光譜定量預(yù)測模型, 發(fā)現(xiàn)最優(yōu)預(yù)測模型的R2為0.989。本實(shí)驗(yàn)所擬合的豆粕中棉籽粕摻假量的NIR光譜預(yù)測模型的R2數(shù)值上高于上述報(bào)道的魚粉中摻假物含量的NIRS預(yù)測模型（劉小莉等, 2010；楊增玲等, 2009；湛小梅等, 2009；Murray等, 2001）, 這可能與實(shí)驗(yàn)材料、樣本含量、光譜儀器、建模軟件和建模方法等因素不同有關(guān)。此外, 綜合文獻(xiàn)結(jié)果和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出, 飼料中各種摻假物含量的NIR光譜預(yù)測模型R2普遍≥0.90, 說明NIR光譜模型的擬合性好, 可以準(zhǔn)確定量分析飼料中摻假物含量。

本研究將擬合的NIR定標(biāo)模型對驗(yàn)證集樣本的棉籽粕含量進(jìn)行預(yù)測, 以檢驗(yàn)NIR光譜定量分析模型的預(yù)測準(zhǔn)確度和可靠性。結(jié)果表明, 驗(yàn)證集的棉籽粕摻假率預(yù)測值和真實(shí)值間回歸方程的R2為0.960, 說明預(yù)測模型的準(zhǔn)確性較高（圖3）。姚婉清等（2020）報(bào)道, 通過NIR光譜模型預(yù)測的山茶油中玉米油和花生油摻假比例與摻假真值無顯著差異, 預(yù)測值相對誤差＜6%。NIR光譜技術(shù)還可以準(zhǔn)確區(qū)分甜蕎粉、苦蕎粉、小麥粉和燕麥粉, 在苦蕎粉中摻入10%、25%和50%小麥粉后, 通過NIR光譜模型預(yù)測的小麥粉含量的相對誤差為4.6%（張晶等, 2018）。孫丹丹等（2014）利用NIR光譜技術(shù)對豆粕中摻入0.1%～5.0%三聚氰胺或尿素進(jìn)行判別, 擬合的NIR光譜預(yù)測模型對摻入三聚氰胺樣品的驗(yàn)證集判別準(zhǔn)確率＞95.3%, 摻入尿素樣品的驗(yàn)證集判別準(zhǔn)確率＞94.2%。利用NIR光譜技術(shù)對豆粕中摻入0.08%～5.00%尿素聚合物進(jìn)行判別, 擬合的NIR光譜預(yù)測模型對摻入尿素聚合物樣品的最低檢測含量為1.00%, 判別準(zhǔn)確率＞99.0%（孫丹丹等, 2015）。

本實(shí)驗(yàn)的NIR光譜預(yù)測模型驗(yàn)證結(jié)果表明, 隨著豆粕中棉籽粕摻假率由5%增加至30%, NIR光譜定量分析模型預(yù)測值的相對誤差呈逐步降低趨勢, 由15.0%降至0.87%（表2）。當(dāng)棉籽粕摻假率≥10%時(shí), NIR光譜定量分析模型預(yù)測值的相對誤差＜2%, 說明豆粕中棉籽粕摻假比例=5%時(shí), 預(yù)測模型的準(zhǔn)確度有待提高；摻假比例為10%～30%, 預(yù)測模型的準(zhǔn)確性很高。楊增玲等（2009）擬合了魚粉中摻入1%～33%肉骨粉的NIR光譜預(yù)測模型（R2=0.95）, 對驗(yàn)證集魚粉中肉骨粉含量的總體正確判斷率為95.6%；當(dāng)肉骨粉摻入量≥5%時(shí), 正確判斷率提高至100%。劉小莉等（2010）擬合了魚粉中摻雜0.1%～15.0%三聚氰胺的NIR光譜定量分析模型發(fā)現(xiàn), 模型對三聚氰胺摻雜量居中者的預(yù)測誤差均低于摻雜量偏低和偏高者, 且針對0.1%～5.5%三聚氰胺模型的預(yù)測誤差亦低于0.1%～15.0%三聚氰胺模型, 由此推斷, 將較寬建模濃度范圍劃分為若干小范圍分別建立模型, 可能有利于提高NIR光譜模型的擬合能力和預(yù)測準(zhǔn)確度。今后尚需研究改善豆粕中低水平棉籽粕摻假率（～5%）的NIR光譜預(yù)測模型擬合度和準(zhǔn)確性的措施, 并確定利用NIR光譜技術(shù)定量檢測豆粕中摻假棉籽粕含量的最低檢測限。

4 結(jié)論

豆粕中摻假棉籽粕含量的NIR光譜預(yù)測模型R2為0.975, RMSECV為1.58, 表明NIR光譜定量分析模型擬合性好, 預(yù)測準(zhǔn)確性高。驗(yàn)證集豆粕中棉籽粕摻假比例的NIR光譜模型預(yù)測值與真值的回歸方程R2為0.960, 棉籽粕摻假比例為10%～30%時(shí), NIR光譜模型預(yù)測值的相對誤差為0.87%～1.87%。因此, NIR光譜預(yù)測模型可以準(zhǔn)確定量分析豆粕中棉籽粕摻假量, 為豆粕中摻假物鑒別提供了一種準(zhǔn)確、可靠的定量方法。