梁 棟，劉光亮，石 屹，王樹聲，王程棟，王曉琳

（1. 三門峽市煙草公司盧氏縣分公司，河南 盧氏 472200；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院 煙草研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部煙草生物學與加工重點實驗室，山東 青島 266101）

油菜素內(nèi)酯（BRs）參與調(diào)控植物一系列生長發(fā)育過程，如胚根和胚軸的伸長、葉片伸展、開花和結(jié)果、細胞程序性死亡等，其中最典型的作用就是調(diào)控細胞的伸長和分裂[1-2]，且參與植物抵御非生物脅迫過程[3-4]。BRs作用于根系時調(diào)控根細胞伸長和根系發(fā)育，如根毛形成、側(cè)根起始、根細胞分裂和根分生組織原生韌皮部的分化[5-6]。以往研究表明，BRs可以促進煙草種子萌發(fā)，增強煙株抗逆性[7-9]，提高煙草植株的根系活力，促進煙株體內(nèi)碳氮代謝[10-12]，因而BRs 能夠通過改善根系狀態(tài)提高煙葉品質(zhì)。然而，BRs 如何調(diào)控煙草根系發(fā)育的相關(guān)研究報道還較少。

栽培煙草沒有明顯的主根系，生育前期根系的總根長和側(cè)根數(shù)目對煙草后期的生長影響很大，直接關(guān)系到煙葉產(chǎn)量的穩(wěn)定和品質(zhì)的提高[13]，因而，研究BRs 如何調(diào)控煙草前期側(cè)根生長具有重要的生產(chǎn)和實踐意義。在小麥中的研究表明，BRs 可以通過調(diào)控生長素分布進而影響側(cè)根的生長發(fā)育[6]。因而推測BRs 可能通過生長素調(diào)控煙草側(cè)根發(fā)育，進而影響根系功能。外源添加植物激素是研究激素作用的一種常用方法[14]，為驗證這一假設(shè)，采用人工合成的油菜素內(nèi)酯類似物2，4-表油菜素內(nèi)酯（2，4-epibrassinolide，EBR）和油菜素內(nèi)酯合成抑制劑BRZ，通過水培的方法，檢測煙草幼苗根系表型以及生長素的變化，以期解析BRs 在煙草根系發(fā)育中的調(diào)控功能，為BRs在煙草中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料與試驗設(shè)計

試驗于2019—2020 年在中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所溫室[（25±0.5）℃，濕度40%～60%，光暗周期為16 h∶8 h）]進行。供試材料為煙草品種農(nóng)大202和煙草轉(zhuǎn)基因DR5::GUS材料，均由國家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺煙草種質(zhì)資源子平臺（中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所）提供。

將供試煙草材料的種子消毒后播種到基質(zhì)（泥炭和蛭石比例為1∶1）中，發(fā)芽1 周后選取長勢一致的幼苗，移栽于含營養(yǎng)液（營養(yǎng)液均為1/4 霍格蘭營養(yǎng)液，pH 值為5.5）的周轉(zhuǎn)箱（3 L）中生長，發(fā)育至二葉一心時，挑選9 株長勢一致的幼苗繼續(xù)培養(yǎng)在含營養(yǎng)液的周轉(zhuǎn)箱（3 L）中，緩苗2 d 后移至含營養(yǎng)液的周轉(zhuǎn)箱（3 L）中進行處理：CK（不添加EBR 和BRZ）、EBR 處理（0.1、0.5、1、5、10、100 nmol/L EBR）和BRZ處理（100、500 nmol/L BRZ），處理時間為9：00。

EBR（上海麥克林公司）用無水乙醇配成10 mmol/L 的母液，根據(jù)需要按一定的比例用1/4 霍格蘭營養(yǎng)液稀釋配成不同濃度的EBR 處理使用液；BRZ（上海阿拉丁公司）用DMSO 配制成0.1 mol/L 的母液，再配制成濃度為100 nmol/L 和500 nmol/L 的BRZ 處理使用液。試驗重復3 次，且溫室生長條件均一致。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 根系數(shù)量性狀測定 對處理3 d 后的農(nóng)大202 根系進行取樣，采用LA1600+根系掃描儀成像，測定總根長和根系平均直徑。采用計數(shù)法測定一級側(cè)根數(shù)量，并用刻度尺測量其長度。一級側(cè)根均長即為一級側(cè)根總長度除以一級側(cè)根數(shù)，二級側(cè)根密度為每條一級側(cè)根上的二級側(cè)根數(shù)除以一級側(cè)根長度。

1.2.2 根尖橫截面顯微觀察 在處理3 d 后的農(nóng)大202 二級側(cè)根根尖距最下端1 cm 處進行取樣，每個處理取8株幼苗，參照陸彥等[15]的方法用掃描電子顯微鏡VEGA3（TESCAN）進行根尖橫截面顯微觀察。

1.2.3 根系GUS（β-葡萄糖苷酸酶）組織表達分析 將處理3 d 后的煙草轉(zhuǎn)基因DR5::GUS材料的根系置于裝有GUS染液的離心管中，恒溫37 ℃染色2 h，然后在SZX2-ILLK 體視鏡下觀察，再用LEICADC100（Olympus，Tokyo，Japan）拍照。

1.2.4 根系生長素（IAA）含量測定 剪取處理3 d后的煙草轉(zhuǎn)基因DR5∶∶GUS材料側(cè)根置于液氮保存，參照龔曉崇等[16]的方法，用安捷倫（Agilent）1290高效液相色譜儀串聯(lián)AB Sciex QTRAP 6500+質(zhì)譜儀測定煙草側(cè)根中內(nèi)源性激素IAA含量。

1.2.5 煙草根系生長素運輸基因表達分析 在NCBI 上搜索煙草生長素運輸基因Nt PIN1S（KC347302.1）、Nt PIN1T（KC460399.1）、Nt PIN3aT（KC425459.1）、Nt PIN3bS（KC438370.1）、Nt PIN3bT（KC433529.1）和Nt PIN11T（KC433528.1）以及煙草內(nèi)參基因Nt L25（L18908.1）[17]。由于Nt PIN基因家族彼此間相似性太高，不能直接設(shè)計出引物，故首先選擇差異比較大的位點，然后再用Primer 5 軟件設(shè)計引物，最后再進行實時熒光定量PCR 驗證。表1 為最終設(shè)計的引物序列。對處理9、24、48 h 后的煙草側(cè)根進行取樣。

表1 實時熒光定量PCR 引物Tab.1 The list of real-time PCR primers

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用WPS Office 2018 進行整理、分析和作圖，并用SAS 9.4（中文版）進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度EBR及BRZ處理對煙草根系構(gòu)型的影響

不同濃度EBR 處理后，煙草總根長、一級側(cè)根數(shù)、一級側(cè)根均長、二級側(cè)根密度和根系平均直徑均呈現(xiàn)差異。與CK 相比，低濃度（0.1 nmol/L）EBR會使煙草總根長顯著增加，增幅達到了29.0%；高濃度EBR（≥1 nmol/L）處理后煙草總根長顯著降低，1、5、10、100 nmol/L EBR 處 理 下 分 別 降 低14.5%、17.3%、22.3%、35.2%（表2）；極高濃度（100 nmol/L）EBR 處理導致一級側(cè)根數(shù)顯著降低（P＜0.05），其他處理間并無顯著差異。低濃度（0.1 nmol/L）EBR 處理，一級側(cè)根均長顯著升高，但當處理濃度升高到0.5 nmol/L 后，一級側(cè)根均長開始顯著降低，在0.5、1、5、10、100 nmol/L EBR 處理下，一級側(cè)根均長較CK 分別降低4.6%、9.6%、18.5%、29.6%、36.9%。EBR 濃度在0.1～10 nmol/L 時，二級側(cè)根密度不斷增加，與CK（1.74 條/cm）相比，從1.81 條/cm 上升到2.67 條/cm，而在100 nmol/L EBR 處理下顯著降低，與CK 差異不顯著。根系平均直徑隨著EBR 濃度增大而降低，當EBR 濃度達到100 nmol/L 時，根系平均直徑較CK下降21.7%（表2）。

表2 不同濃度EBR和BRZ處理對煙草根系構(gòu)型的影響Tab.2 Effects of different concentrations of EBR and BRZ on root phenotypes of tobacco

CK 以及100、500 nmol/L BRZ 處理下，煙草總根長、一級側(cè)根數(shù)和二級側(cè)根密度無顯著差異。500 nmol/L BRZ 處理下，一級側(cè)根均長較CK 顯著下降，而100、500 nmol/L BRZ 處理下，根系平均直徑較CK均顯著增加（P＜0.05），分別增加27.5%、24.6%。

觀察不同EBR 和BRZ 處理下根系構(gòu)型變化發(fā)現(xiàn)，當EBR 濃度為10 nmol/L 時，煙草二級側(cè)根密度增幅最大，當BRZ濃度為100、500 nmol/L時，根系平均直徑顯著增大，因此，以下選取CK、10 nmol/L EBR、500 nmol/L BRZ 3個處理做進一步分析。

2.2 EBR及BRZ處理后煙草二級側(cè)根掃描電鏡觀察結(jié)果

圖1 表明，與CK 相比，EBR 處理下煙草二級側(cè)根直徑減小，而BRZ 處理下煙草二級側(cè)根直徑增加；10 nmol/L EBR 處理下根中細胞總數(shù)目減少，而500 nmol/L BRZ處理下根中細胞總數(shù)目增加。

圖1 煙草幼苗二級側(cè)根根尖的橫切掃描電子顯微鏡圖像Fig.1 Transverse scanning electron microscope images of the root tips of secondary lateral roots of tobacco seedlings

進一步分析表明，10 nmol/L EBR 處理下煙草二級側(cè)根橫切直徑為125.62 μm，較CK 顯著減少32.5%；中 柱 直 徑 為33.77 μm，較CK 顯 著 減 小25.0%。而500 nmol/L BRZ 處理下煙草二級側(cè)根橫切直徑為220.14 μm，較CK 顯著增加了18.3%；中柱直徑達到57.43 μm，較CK顯著增加27.5%（表3）。

表3 EBR和BRZ處理對煙草二級側(cè)根直徑的影響Tab.3 Effects of EBR and BRZ treatments on thediameter of tobacco secondary lateral roots

綜上結(jié)果可知，BRs 處理能夠使煙草二級側(cè)根細胞數(shù)目、橫切直徑和中柱直徑發(fā)生顯著變化，從而引起煙草二級側(cè)根直徑發(fā)生變化。

2.3 EBR及BRZ處理對煙草側(cè)根生長素空間分布的影響

采用煙草轉(zhuǎn)基因DR5::GUS材料可以反映生長素的空間分布[18]。GUS 染色結(jié)果（圖2）顯示，與CK相比，10 nmol/L EBR 處理煙草側(cè)根原基、二級側(cè)根和根尖上均出現(xiàn)明顯的深藍色，表明DR5::GUS表達水平明顯升高，這些部位生長素含量高；而500 nmol/L BRZ 處理側(cè)根原基上藍色小點明顯增多，二級側(cè)根變深，表明這些部位DR5::GUS表達水平明顯升高，生長素含量高，而根尖與CK 相比無明顯差別。

圖2 煙草側(cè)根GUS染色結(jié)果（比例尺為1 mm）Fig.2 GUS staining results of lateral roots of tobacco（Bar=1 mm）

2.4 EBR及BRZ處理對煙草側(cè)根生長素含量的影響

為了探究是否是因為生長素含量變化導致DR5::GUS表達水平升高，在處理3 d 后檢測煙草根系的IAA 含量。與CK 相比，10 nmol/L EBR 處理下煙草IAA 含量顯著下降7.1%，而500 nmol/L BRZ 處理后IAA含量與CK無顯著差異（圖3）。

圖3 EBR和BRZ對根中IAA含量的影響Fig.3 The effect of EBR and BRZ on the content of IAA in roots

2.5 EBR及BRZ處理后煙草根系生長素轉(zhuǎn)運Nt PIN家族基因表達差異

從圖4 可以看出，10 nmol/L EBR 處理后，煙草根系生長素轉(zhuǎn)運基因家族中PIN3aT、PIN3bS、PIN3bT和PIN11T表達水平明顯上調(diào)，而PIN1S和PIN1T表達水平變化不顯著。從圖5 可以看出，500 nmol/L BRZ 處理下運輸基因家族中PIN1S、PIN3aT、PIN3bS、PIN3bT和PIN11T的表達水平均有不同程度上調(diào)，其中PIN3bS表達水平上調(diào)最為顯著。這表明EBR 和BRZ 處理均會影響生長素轉(zhuǎn)運基因的表達，進而影響生長素在側(cè)根中的分布，最終反饋到根系的生長上。

圖4 10 nmol/L EBR處理9、24、48 h后煙草根系Nt P1N家族基因相對表達量Fig.4 Relative expression of Nt PIN family genes in tobacco roots after 10 nmol/L EBR treatment for 9 h，24 h and 48 h

圖5 500 nmol/L BRZ處理9、24、48 h后煙草根系Nt P1N家族基因相對表達量Fig.5 Relative expression of Nt P1N family genes in tobacco roots after 500 nmol/L BRZ treatment for 9 h，24 h and 48 h

3 結(jié)論與討論

根系是植物吸收水分和養(yǎng)分的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其形態(tài)結(jié)構(gòu)會隨著環(huán)境而變化。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度BRs 顯著增加了煙草幼苗總根長，而高濃度BRs 抑制根系伸長，促進根生長的最適BRs 濃度為0.1 nmol/L。超過該濃度時，根伸長受抑制，同時會造成根系形態(tài)異常和出現(xiàn)不對稱發(fā)育，這與BRs 在其他作物中的研究報道基本一致[19-20]。根部可將外源EBR 運輸?shù)降厣喜縖21]，本試驗結(jié)果表明，高濃度（＞1 nmol/L）EBR 會導致煙草葉柄伸長、煙葉卷曲，顯著降低總根長，而BRZ 對煙草總根長無明顯影響；極高濃度（100 nmol/L）EBR 顯著抑制煙草一級側(cè)根數(shù)，其他濃度EBR 對煙草一級側(cè)根數(shù)無顯著影響，而不同濃度BRZ 對于一級側(cè)根數(shù)均沒有明顯影響；隨EBR 濃度的增加，煙草二級側(cè)根密度顯著增加，但當濃度為100 nmol/L 時，與CK 相比無顯著差異，這與在擬南芥上的報道一致[22]；根系平均直徑隨著EBR 濃度增大而降低，當EBR 濃度達到100 nmol/L 時，平均直徑較CK 下降21.7%，而在100 nmol/L 和500 nmol/L BRZ 處理下，根系平均直徑分別增加27.5%和24.6%。

分生區(qū)細胞的分裂和伸長區(qū)細胞的擴張是植物根系伸長的主要驅(qū)動力[23]，本研究用掃描電子顯微鏡觀察了煙草二級側(cè)根橫截面，發(fā)現(xiàn)10 nmol/L EBR 處理下側(cè)根直徑減小，細胞總數(shù)目減少，而500 nmol/L BRZ 處理下側(cè)根直徑增加，細胞總數(shù)目明顯增多；EBR 處理下二級側(cè)根橫切直徑減少32.5%，中柱直徑減小25.0%，而BRZ 處理二級側(cè)根橫切直徑增加18.3%，中柱直徑增大27.5%。說明BRs在煙草根徑細胞平周分裂過程中發(fā)揮重要的功能。EBR會影響根細胞的生長發(fā)育，這與侯立江[24]在小麥幼苗側(cè)根中的研究結(jié)果基本一致。

生長素的局部積累和再分配在植物器官形成過程中至關(guān)重要[25-27]。植物通過調(diào)控生長素的極性運輸調(diào)控側(cè)根的生長發(fā)育[28]。合成啟動子DR5對生長素敏感，且呈劑量依賴性[29]，其活性反映了某些組織尤其是根中內(nèi)源性生長素的水平[17]。本研究對煙草轉(zhuǎn)基因DR5::GUS材料進行染色發(fā)現(xiàn)，與CK 相比，10 nmol/LEBR 處理下煙草側(cè)根原基、二級側(cè)根和根尖均呈現(xiàn)出更加明顯的深藍色，表明DR5::GUS表達水平顯著升高，說明EBR 可以調(diào)控根中不同部位生長素的水平，進而促進二級側(cè)根密度增加。有研究表明，BRs 可能通過正向調(diào)控一種絲氨酸羧肽酶BRS1 使植物側(cè)根原基更容易突破根皮層，側(cè)根原基生長速率增快，從而使植物的二級側(cè)根數(shù)顯著增加[30]，而500 nmol/L BRZ 處理后，煙草側(cè)根原基和二級側(cè)根上的藍色也明顯加深，但是二級側(cè)根密度并未增加。這表明EBR 能夠顯著促進側(cè)根原基突破表皮形成側(cè)根，而外源BRZ 不能促進側(cè)根原基突破表皮形成二級側(cè)根，這與張愛華[31]在小麥中的研究一致。通過對根中IAA 含量進行檢測發(fā)現(xiàn)，10 nmol/LEBR 處理后IAA 含量并未增加，甚至有所降低，這表明EBR 處理使DR5::GUS表達量升高是因為EBR 調(diào)控了根中生長素的分布，而非生長素含量升高。

生長素極性運輸依賴于內(nèi)輸載體AUX/LAX 家族、外輸載體PIN 蛋白家族和ABCB/PGP 蛋白家族[32]。其中，PIN1介導生長素向根尖的運輸[33]。PIN3基因主要參與植物的向性生長[34]、促進生長素在根兩側(cè)的不對稱運輸，使根產(chǎn)生向重力彎曲[35]。通過對煙草根系中生長素運輸基因表達量進行分析可知，10 nmol/L EBR 處理生長素轉(zhuǎn)運基因家族中PIN3aT、PIN3bS、PIN3bT和PIN11T起重要作用，而500 nmol/L BRZ 處理生長素轉(zhuǎn)運基因家族中PIN1S、PIN3aT、PIN3bS、PIN3bT和PIN11T起重要作用，表明EBR 和BRZ 均會使Nt PIN家族基因上調(diào)，從而調(diào)控根中生長素的分布，形成更多的側(cè)根原基，與本研究中GUS 染色結(jié)果相一致。但是EBR能夠顯著促進側(cè)根原基突破表皮形成側(cè)根，而外源BRZ 不能促進側(cè)根原基突破表皮形成二級側(cè)根，這是表型差異的原因。

本研究通過油菜素內(nèi)酯類似物EBR 及抑制劑BRZ 研究了油菜素內(nèi)酯對煙草根長、根系直徑與側(cè)根數(shù)量的影響，并且通過激素及基因表達研究探討了油菜素內(nèi)酯影響根系構(gòu)型的可能機制。低濃度EBR（0.1 nmol/L）處理使煙草總根長增加，EBR＞0.5 nmol/L 時對根系伸長有顯著抑制作用；EBR 和BRZ主要通過調(diào)控根層細胞的大小和數(shù)目來影響煙草幼苗二級側(cè)根的發(fā)育，EBR會降低其平均直徑，BRZ促進二級側(cè)根直徑增大。側(cè)根原基、二級側(cè)根和根尖中DR5::GUS表達水平及生長素極性運輸?shù)鞍譔t PINS基因家族有關(guān)基因表達量的研究表明，油菜素內(nèi)酯通過影響生長素在根中的分布調(diào)控二級側(cè)根發(fā)育，而不是影響生長素的總含量。以上研究結(jié)果為煙草幼苗側(cè)根構(gòu)型的激素調(diào)控及培育優(yōu)質(zhì)煙苗提供了理論支持。