王慶美等

摘要：以轉AtNDPK2基因甘薯植株為試材，根據(jù)其生理指標及表型變化來鑒定轉基因甘薯的耐鹽性。室內(nèi)鑒定結果表明：在100、150 mmol/L NaCl脅迫下，轉基因株系JN1～JN6的根長顯著高于對照。田間鑒定結果表明：在50 mmol/L NaCl脅迫下，轉基因株系JN1～JN6生長正常，而對照10 d后出現(xiàn)黃葉及枯萎等癥狀；在100 mmol/L NaCl脅迫下，對照植株和JN2～JN6在處理4 d后出現(xiàn)枯萎，而JN1生長正常。

關鍵詞：甘薯；轉基因；AtNDPK2；根長；耐鹽性

中圖分類號：S531.034文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）02-0029-03

甘薯是重要的糧食作物及新型能源作物，我國甘薯種植面積占世界甘薯種植總面積的69%，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的85%。在甘薯生產(chǎn)中，各種環(huán)境脅迫和病蟲害對其產(chǎn)量和品質(zhì)危害很大。世界范圍內(nèi)，適宜耕作的土地已經(jīng)不足10%，很多作物包括甘薯都種植在干旱、鹽漬、低溫等逆境環(huán)境中，隨著耕地的不斷減少和能源壓力的不斷增大，培育出能夠在逆境生長且品質(zhì)優(yōu)良的甘薯品種成為甘薯育種工作者的重要任務。

雖然常規(guī)甘薯育種技術在品種改良中發(fā)揮了重要作用，但由于種質(zhì)基礎日益狹窄，甘薯種內(nèi)、種間雜交不親和性等因素[1]，使常規(guī)育種受到限制。利用植物基因工程技術能夠克服常規(guī)育種中存在的物種隔離和基因連鎖等妨礙，對甘薯品種選育和生產(chǎn)具有潛在的推動意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為濟薯21試管苗，由山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所提供。轉基因植株為轉AtNDPK2基因的濟薯21再生苗。將再生的轉基因小植株切下，MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為（27±1）℃、光照13 h/d。每2個月繼代1次。

1.2再生苗的分子鑒定

甘薯總 DNA 的提取方法按照 Saghai-Maroof 等（1984）[2]的方法。模板 DNA 為被檢測擬轉基因植株總DNA、非轉基因植株總 DNA（陰性對照）和pCAMB2300-AtNDPK2質(zhì)粒（陽性對照）。AtNDPK2基因的引物序列為：5′-GTTGGCCGCATTTCGTCCTCA-3′；5′-CCACTTGCATAGCTCGCCCTC-3′，預計擴增片段長度 1 205 bp。NPTII基因引物為5′-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3′；5′-ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-3′，預計擴增片段長度 750 bp左右。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，60℃（NPTII和AtNDPK2）復性1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外成像儀中觀察并拍照。

1.3轉基因植株的室內(nèi)鑒定

選取均勻一致的轉基因植株JN1～JN6及對照，切取莖尖頂端2～3 cm，分別轉接到含0、50、100、150 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基上，28℃、16 h/d光照條件下培養(yǎng)20 d，測定根長。每個處理5株，重復3次。

1.4轉基因植株的田間鑒定

選取均勻一致的轉基因植株JN1～JN6及對照，轉移到育苗基質(zhì)中，25℃、1 000 lx、16 h/d光照條件下培養(yǎng)6周后，用0、50、100 mmol/L的NaCl溶液進行澆灌，每個處理5盆，重復3次。每隔24 h觀察植株表型變化。

2結果與分析

2.1轉基因植株的PCR檢測

PCR檢測結果（圖1）表明，有11個擬轉基因植株及陽性對照擴增出1 205 bp的條帶，初步證明這些植株為轉基因植株，陽性率達到84.6%。NPTII基因的擴增結果與AtNDPK2結果類似。

2.2轉基因植株的室內(nèi)鑒定

根長結果（圖2）顯示，正常條件下（NaCl濃度為零），轉基因植株與對照的根均能夠很好的生長。隨著NaCl濃度的提高，根的生長受到抑制，但轉基因植株的根長始終大于非轉基因植株，在 100、150 mmol/L NaCl 脅迫下，轉基因植株的根長顯著高于對照。

3結論與討論

鹽脅迫條件下，植物細胞內(nèi)自由基代謝平衡被破壞而有利于自由基的產(chǎn)生，大多數(shù)植物體內(nèi)的游離脯氨酸含量都異常升高。臧寧等（2008）[3]將從擬南芥中克隆的SOS基因導入甘薯栽培品種徐薯 18和栗子香中，獲得了具有一定耐鹽性的轉基因植株。袁莉（2009）[4]通過農(nóng)桿菌介導法將LOS5基因轉入甘薯品種栗子香中，提高了轉基因植株對田間鹽脅迫的抵抗能力。Lim 等（2007）[5]構建了在葉綠體中特異誘導表達的包含CuZnSOD和APX 兩個基因的載體，采用基因槍法將目的基因導入甘薯中，提高了甘薯對氧化和冷脅迫的抗性；在甲基紫精的氧化脅迫誘導下，轉基因甘薯葉綠體中的CuZnSOD和APX表達水平均高于對照約15倍；轉基因植株在冷脅迫誘導下光合活性的降低顯著低于對照，并且轉基因植株能在脅迫后恢復光合活性。這些結果說明表達CuZnSOD和APX基因的甘薯，其抗逆性有所提高。王欣等（2011）[6]將Cu/ZnSOD和APX基因轉入甘薯，通過增強NaCl脅迫下甘薯清除活性氧的能力，提高了甘薯的耐鹽性。

本試驗通過轉AtNDPK2基因甘薯植株的耐鹽性鑒定，證明AtNDPK2能提高甘薯的耐鹽性，為甘薯常規(guī)耐鹽型育種提供新種質(zhì)，為鹽堿地的利用以及生態(tài)環(huán)境的改善提供技術儲備。

參考文獻：

[1]陸漱韻. 甘薯育種學[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社， 1998， 50-54.

[2]Saghai-Maroof M A， Soliman K M， Jorgensen R A， et al. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley： Mendelian inheritance， chromosomal location， and population dynamics [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1984， 81（24）：8014-8018.

[3]臧寧， 張美彥， 翟紅， 等. 根癌農(nóng)桿菌介導的抗除草劑轉基因甘薯植株的獲得[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術學報， 2008， 16（1）：103-107.

[4]袁莉. 表達LOS5基因的轉基因甘薯植株的獲得及耐鹽性鑒定[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學， 2009.

[5]Lim S， Kim Y H， Kim S H， et al. Enhanced tolerance of transgenic sweetpotato plants that express both CuZnSOD and APX in chloroplasts to methyl viologen-mediates oxidative stress and chilling[J]. Mol. Breeding， 2007， 19（3）：227-239.

[6]王欣， 邊曉明， 李強， 等. 轉逆境誘導型啟動子SWPA2驅動Cu/ZnSOD和APX基因甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]耐鹽性[J]. 分子植物育種， 2011， 9（6）：754-759.

摘要：以轉AtNDPK2基因甘薯植株為試材，根據(jù)其生理指標及表型變化來鑒定轉基因甘薯的耐鹽性。室內(nèi)鑒定結果表明：在100、150 mmol/L NaCl脅迫下，轉基因株系JN1～JN6的根長顯著高于對照。田間鑒定結果表明：在50 mmol/L NaCl脅迫下，轉基因株系JN1～JN6生長正常，而對照10 d后出現(xiàn)黃葉及枯萎等癥狀；在100 mmol/L NaCl脅迫下，對照植株和JN2～JN6在處理4 d后出現(xiàn)枯萎，而JN1生長正常。

關鍵詞：甘薯；轉基因；AtNDPK2；根長；耐鹽性

中圖分類號：S531.034文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）02-0029-03

甘薯是重要的糧食作物及新型能源作物，我國甘薯種植面積占世界甘薯種植總面積的69%，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的85%。在甘薯生產(chǎn)中，各種環(huán)境脅迫和病蟲害對其產(chǎn)量和品質(zhì)危害很大。世界范圍內(nèi)，適宜耕作的土地已經(jīng)不足10%，很多作物包括甘薯都種植在干旱、鹽漬、低溫等逆境環(huán)境中，隨著耕地的不斷減少和能源壓力的不斷增大，培育出能夠在逆境生長且品質(zhì)優(yōu)良的甘薯品種成為甘薯育種工作者的重要任務。

雖然常規(guī)甘薯育種技術在品種改良中發(fā)揮了重要作用，但由于種質(zhì)基礎日益狹窄，甘薯種內(nèi)、種間雜交不親和性等因素[1]，使常規(guī)育種受到限制。利用植物基因工程技術能夠克服常規(guī)育種中存在的物種隔離和基因連鎖等妨礙，對甘薯品種選育和生產(chǎn)具有潛在的推動意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為濟薯21試管苗，由山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所提供。轉基因植株為轉AtNDPK2基因的濟薯21再生苗。將再生的轉基因小植株切下，MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為（27±1）℃、光照13 h/d。每2個月繼代1次。

1.2再生苗的分子鑒定

甘薯總 DNA 的提取方法按照 Saghai-Maroof 等（1984）[2]的方法。模板 DNA 為被檢測擬轉基因植株總DNA、非轉基因植株總 DNA（陰性對照）和pCAMB2300-AtNDPK2質(zhì)粒（陽性對照）。AtNDPK2基因的引物序列為：5′-GTTGGCCGCATTTCGTCCTCA-3′；5′-CCACTTGCATAGCTCGCCCTC-3′，預計擴增片段長度 1 205 bp。NPTII基因引物為5′-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3′；5′-ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-3′，預計擴增片段長度 750 bp左右。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，60℃（NPTII和AtNDPK2）復性1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外成像儀中觀察并拍照。

1.3轉基因植株的室內(nèi)鑒定

選取均勻一致的轉基因植株JN1～JN6及對照，切取莖尖頂端2～3 cm，分別轉接到含0、50、100、150 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基上，28℃、16 h/d光照條件下培養(yǎng)20 d，測定根長。每個處理5株，重復3次。

1.4轉基因植株的田間鑒定

選取均勻一致的轉基因植株JN1～JN6及對照，轉移到育苗基質(zhì)中，25℃、1 000 lx、16 h/d光照條件下培養(yǎng)6周后，用0、50、100 mmol/L的NaCl溶液進行澆灌，每個處理5盆，重復3次。每隔24 h觀察植株表型變化。

2結果與分析

2.1轉基因植株的PCR檢測

PCR檢測結果（圖1）表明，有11個擬轉基因植株及陽性對照擴增出1 205 bp的條帶，初步證明這些植株為轉基因植株，陽性率達到84.6%。NPTII基因的擴增結果與AtNDPK2結果類似。

2.2轉基因植株的室內(nèi)鑒定

根長結果（圖2）顯示，正常條件下（NaCl濃度為零），轉基因植株與對照的根均能夠很好的生長。隨著NaCl濃度的提高，根的生長受到抑制，但轉基因植株的根長始終大于非轉基因植株，在 100、150 mmol/L NaCl 脅迫下，轉基因植株的根長顯著高于對照。

3結論與討論

鹽脅迫條件下，植物細胞內(nèi)自由基代謝平衡被破壞而有利于自由基的產(chǎn)生，大多數(shù)植物體內(nèi)的游離脯氨酸含量都異常升高。臧寧等（2008）[3]將從擬南芥中克隆的SOS基因導入甘薯栽培品種徐薯 18和栗子香中，獲得了具有一定耐鹽性的轉基因植株。袁莉（2009）[4]通過農(nóng)桿菌介導法將LOS5基因轉入甘薯品種栗子香中，提高了轉基因植株對田間鹽脅迫的抵抗能力。Lim 等（2007）[5]構建了在葉綠體中特異誘導表達的包含CuZnSOD和APX 兩個基因的載體，采用基因槍法將目的基因導入甘薯中，提高了甘薯對氧化和冷脅迫的抗性；在甲基紫精的氧化脅迫誘導下，轉基因甘薯葉綠體中的CuZnSOD和APX表達水平均高于對照約15倍；轉基因植株在冷脅迫誘導下光合活性的降低顯著低于對照，并且轉基因植株能在脅迫后恢復光合活性。這些結果說明表達CuZnSOD和APX基因的甘薯，其抗逆性有所提高。王欣等（2011）[6]將Cu/ZnSOD和APX基因轉入甘薯，通過增強NaCl脅迫下甘薯清除活性氧的能力，提高了甘薯的耐鹽性。

本試驗通過轉AtNDPK2基因甘薯植株的耐鹽性鑒定，證明AtNDPK2能提高甘薯的耐鹽性，為甘薯常規(guī)耐鹽型育種提供新種質(zhì)，為鹽堿地的利用以及生態(tài)環(huán)境的改善提供技術儲備。

參考文獻：

[1]陸漱韻. 甘薯育種學[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社， 1998， 50-54.

[2]Saghai-Maroof M A， Soliman K M， Jorgensen R A， et al. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley： Mendelian inheritance， chromosomal location， and population dynamics [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1984， 81（24）：8014-8018.

[3]臧寧， 張美彥， 翟紅， 等. 根癌農(nóng)桿菌介導的抗除草劑轉基因甘薯植株的獲得[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術學報， 2008， 16（1）：103-107.

[4]袁莉. 表達LOS5基因的轉基因甘薯植株的獲得及耐鹽性鑒定[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學， 2009.

[5]Lim S， Kim Y H， Kim S H， et al. Enhanced tolerance of transgenic sweetpotato plants that express both CuZnSOD and APX in chloroplasts to methyl viologen-mediates oxidative stress and chilling[J]. Mol. Breeding， 2007， 19（3）：227-239.

[6]王欣， 邊曉明， 李強， 等. 轉逆境誘導型啟動子SWPA2驅動Cu/ZnSOD和APX基因甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]耐鹽性[J]. 分子植物育種， 2011， 9（6）：754-759.

摘要：以轉AtNDPK2基因甘薯植株為試材，根據(jù)其生理指標及表型變化來鑒定轉基因甘薯的耐鹽性。室內(nèi)鑒定結果表明：在100、150 mmol/L NaCl脅迫下，轉基因株系JN1～JN6的根長顯著高于對照。田間鑒定結果表明：在50 mmol/L NaCl脅迫下，轉基因株系JN1～JN6生長正常，而對照10 d后出現(xiàn)黃葉及枯萎等癥狀；在100 mmol/L NaCl脅迫下，對照植株和JN2～JN6在處理4 d后出現(xiàn)枯萎，而JN1生長正常。

關鍵詞：甘薯；轉基因；AtNDPK2；根長；耐鹽性

中圖分類號：S531.034文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）02-0029-03

甘薯是重要的糧食作物及新型能源作物，我國甘薯種植面積占世界甘薯種植總面積的69%，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的85%。在甘薯生產(chǎn)中，各種環(huán)境脅迫和病蟲害對其產(chǎn)量和品質(zhì)危害很大。世界范圍內(nèi)，適宜耕作的土地已經(jīng)不足10%，很多作物包括甘薯都種植在干旱、鹽漬、低溫等逆境環(huán)境中，隨著耕地的不斷減少和能源壓力的不斷增大，培育出能夠在逆境生長且品質(zhì)優(yōu)良的甘薯品種成為甘薯育種工作者的重要任務。

雖然常規(guī)甘薯育種技術在品種改良中發(fā)揮了重要作用，但由于種質(zhì)基礎日益狹窄，甘薯種內(nèi)、種間雜交不親和性等因素[1]，使常規(guī)育種受到限制。利用植物基因工程技術能夠克服常規(guī)育種中存在的物種隔離和基因連鎖等妨礙，對甘薯品種選育和生產(chǎn)具有潛在的推動意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為濟薯21試管苗，由山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所提供。轉基因植株為轉AtNDPK2基因的濟薯21再生苗。將再生的轉基因小植株切下，MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為（27±1）℃、光照13 h/d。每2個月繼代1次。

1.2再生苗的分子鑒定

甘薯總 DNA 的提取方法按照 Saghai-Maroof 等（1984）[2]的方法。模板 DNA 為被檢測擬轉基因植株總DNA、非轉基因植株總 DNA（陰性對照）和pCAMB2300-AtNDPK2質(zhì)粒（陽性對照）。AtNDPK2基因的引物序列為：5′-GTTGGCCGCATTTCGTCCTCA-3′；5′-CCACTTGCATAGCTCGCCCTC-3′，預計擴增片段長度 1 205 bp。NPTII基因引物為5′-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3′；5′-ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-3′，預計擴增片段長度 750 bp左右。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，60℃（NPTII和AtNDPK2）復性1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外成像儀中觀察并拍照。

1.3轉基因植株的室內(nèi)鑒定

選取均勻一致的轉基因植株JN1～JN6及對照，切取莖尖頂端2～3 cm，分別轉接到含0、50、100、150 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基上，28℃、16 h/d光照條件下培養(yǎng)20 d，測定根長。每個處理5株，重復3次。

1.4轉基因植株的田間鑒定

選取均勻一致的轉基因植株JN1～JN6及對照，轉移到育苗基質(zhì)中，25℃、1 000 lx、16 h/d光照條件下培養(yǎng)6周后，用0、50、100 mmol/L的NaCl溶液進行澆灌，每個處理5盆，重復3次。每隔24 h觀察植株表型變化。

2結果與分析

2.1轉基因植株的PCR檢測

PCR檢測結果（圖1）表明，有11個擬轉基因植株及陽性對照擴增出1 205 bp的條帶，初步證明這些植株為轉基因植株，陽性率達到84.6%。NPTII基因的擴增結果與AtNDPK2結果類似。

2.2轉基因植株的室內(nèi)鑒定

根長結果（圖2）顯示，正常條件下（NaCl濃度為零），轉基因植株與對照的根均能夠很好的生長。隨著NaCl濃度的提高，根的生長受到抑制，但轉基因植株的根長始終大于非轉基因植株，在 100、150 mmol/L NaCl 脅迫下，轉基因植株的根長顯著高于對照。

3結論與討論

鹽脅迫條件下，植物細胞內(nèi)自由基代謝平衡被破壞而有利于自由基的產(chǎn)生，大多數(shù)植物體內(nèi)的游離脯氨酸含量都異常升高。臧寧等（2008）[3]將從擬南芥中克隆的SOS基因導入甘薯栽培品種徐薯 18和栗子香中，獲得了具有一定耐鹽性的轉基因植株。袁莉（2009）[4]通過農(nóng)桿菌介導法將LOS5基因轉入甘薯品種栗子香中，提高了轉基因植株對田間鹽脅迫的抵抗能力。Lim 等（2007）[5]構建了在葉綠體中特異誘導表達的包含CuZnSOD和APX 兩個基因的載體，采用基因槍法將目的基因導入甘薯中，提高了甘薯對氧化和冷脅迫的抗性；在甲基紫精的氧化脅迫誘導下，轉基因甘薯葉綠體中的CuZnSOD和APX表達水平均高于對照約15倍；轉基因植株在冷脅迫誘導下光合活性的降低顯著低于對照，并且轉基因植株能在脅迫后恢復光合活性。這些結果說明表達CuZnSOD和APX基因的甘薯，其抗逆性有所提高。王欣等（2011）[6]將Cu/ZnSOD和APX基因轉入甘薯，通過增強NaCl脅迫下甘薯清除活性氧的能力，提高了甘薯的耐鹽性。

本試驗通過轉AtNDPK2基因甘薯植株的耐鹽性鑒定，證明AtNDPK2能提高甘薯的耐鹽性，為甘薯常規(guī)耐鹽型育種提供新種質(zhì)，為鹽堿地的利用以及生態(tài)環(huán)境的改善提供技術儲備。

參考文獻：

[1]陸漱韻. 甘薯育種學[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社， 1998， 50-54.

[2]Saghai-Maroof M A， Soliman K M， Jorgensen R A， et al. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley： Mendelian inheritance， chromosomal location， and population dynamics [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1984， 81（24）：8014-8018.

[3]臧寧， 張美彥， 翟紅， 等. 根癌農(nóng)桿菌介導的抗除草劑轉基因甘薯植株的獲得[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術學報， 2008， 16（1）：103-107.

[4]袁莉. 表達LOS5基因的轉基因甘薯植株的獲得及耐鹽性鑒定[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學， 2009.

[5]Lim S， Kim Y H， Kim S H， et al. Enhanced tolerance of transgenic sweetpotato plants that express both CuZnSOD and APX in chloroplasts to methyl viologen-mediates oxidative stress and chilling[J]. Mol. Breeding， 2007， 19（3）：227-239.

[6]王欣， 邊曉明， 李強， 等. 轉逆境誘導型啟動子SWPA2驅動Cu/ZnSOD和APX基因甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]耐鹽性[J]. 分子植物育種， 2011， 9（6）：754-759.