劉圣美，尚鳳芹，陳亞?wèn)|，常亞青，王秀利，仇雪梅，劉洋

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)作為一種高度保守的程序性細(xì)胞死亡(凋亡)的內(nèi)源性抑制劑[1]，最初在桿狀病毒中被發(fā)現(xiàn)[2-3]，后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)，IAPs廣泛存在于病毒、細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物中，對(duì)細(xì)胞凋亡有較強(qiáng)的抑制作用[4]。IAPs是一個(gè)多功能蛋白家族，除行使抗凋亡功能外，在受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂、銅代謝和泛素化蛋白質(zhì)等方面也發(fā)揮著重要作用[5-6]。IAPs家族蛋白結(jié)構(gòu)的共同特點(diǎn)是氨基端含有數(shù)量不等的桿狀病毒IAP重復(fù)序列(baculoviral IAP repeat，BIR)，羧基端不包含或包含1個(gè)RING(really interesting new gene)指環(huán)結(jié)構(gòu)。其中，BIR結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)介導(dǎo)蛋白質(zhì)間的相互作用，使得一些IAPs能夠直接結(jié)合并抑制半胱氨酸蛋白酶(Caspases)的催化活性，從而阻斷細(xì)胞凋亡進(jìn)程[7]。而IAPs羧基末端的RING指環(huán)結(jié)構(gòu)域則提供了E3泛素連接酶活性，可以將下游靶蛋白泛素化，進(jìn)而導(dǎo)致目標(biāo)蛋白被降解[8-10]。

X染色體連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)作為IAPs基因家族中重要的成員之一，該蛋白包含3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域和1個(gè)RING指環(huán)結(jié)構(gòu)域[11]。研究表明，XIAP的抗凋亡功能是通過(guò)BIRs與Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9活性位點(diǎn)的直接相互作用實(shí)現(xiàn)的[12-13]。此外，有研究表明，XIAP除具有抑制Caspase的催化活性外，還在NF-κB和MAPKs等炎癥信號(hào)通路中發(fā)揮作用[14-15]。有研究報(bào)道，相比于正常小鼠，XIAP缺陷小鼠在感染李斯特菌Listeria后其存活率顯著降低， XIAP的存在促進(jìn)了機(jī)體在感染李斯特菌時(shí)促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生[16]。Damgaard等[17]研究發(fā)現(xiàn)，XIAP的BIR2結(jié)構(gòu)域是X染色體連鎖的淋巴細(xì)胞增生綜合征2型(X-linked lymphoproliferative syndrome type-2, XLP2)錯(cuò)義突變的熱點(diǎn)，并證明XLP2-BIR2突變嚴(yán)重?fù)p害了來(lái)自XLP2患者的原代細(xì)胞和重組的XIAP缺陷細(xì)胞系中NOD1/2依賴(lài)性的免疫信號(hào)。XIAP作為凋亡抑制蛋白家族中最受關(guān)注的成員，其生物學(xué)功能在很大程度上還是歸因于其對(duì)細(xì)胞凋亡通路的抑制作用，然而，近年來(lái)的研究不斷發(fā)現(xiàn)，其在調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)和免疫方面均發(fā)揮著重要作用[18]。截至目前，有關(guān)XIAP的相關(guān)報(bào)道大多局限于哺乳動(dòng)物中，而在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中的研究非常缺乏。

蝦夷馬糞海膽Strongylocentrotusintermedius又稱(chēng)中間球海膽，原產(chǎn)于日本，1989年被引入中國(guó)，現(xiàn)已成為中國(guó)北方沿海地區(qū)重要的海膽?zhàn)B殖種類(lèi)。本研究中,對(duì)蝦夷馬糞海膽XIAP基因進(jìn)行了克隆，檢測(cè)了XIAP基因在不同組織中的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)了經(jīng)不同免疫刺激物刺激后體腔細(xì)胞中XIAP基因的表達(dá)情況，以期為蝦夷馬糞海膽天然免疫系統(tǒng)的研究提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用蝦夷馬糞海膽(2齡)取自大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，體質(zhì)量為40～80 g，海膽飼養(yǎng)于16～23 ℃海水中，每日投喂新鮮海帶，取樣前一日停止投喂。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物組織的獲取 選取8枚健康蝦夷馬糞海膽(雌、雄各4枚)，分別用注射器抽取體腔液，將收集到的體腔液在4 ℃下以5 000 r/min離心10 min，棄上清，收集體腔細(xì)胞，隨后解剖蝦夷馬糞海膽，依次獲取管足(tube foot)、圍口膜(peristomial membrane)、腸(intestine)、精巢(testis)和卵巢(ovary)等組織，將組織塊浸沒(méi)于RNAlater(ThermoFisher)中，并在4 ℃冰箱中浸泡過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于基因克隆和健康組織表達(dá)的實(shí)時(shí)定量分析。

在免疫刺激處理的過(guò)程中，選取強(qiáng)壯弧菌Vibriofortis(革蘭氏陰性菌)、葡聚糖(whole glucan particles, WGP)、肽聚糖(peptidoglycan， PGN)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid, Poly I:C)作為病原刺激物，以磷酸緩沖液(PBS)作為對(duì)照，分別對(duì)健康蝦夷馬糞海膽的體腔液進(jìn)行活體注射。選擇半致死劑量[19]的強(qiáng)壯弧菌進(jìn)行注射，注射劑量為1.8×105CFU/g，并注射50枚海膽，以防止海膽死亡導(dǎo)致試驗(yàn)樣本數(shù)量不足；其余4種免疫刺激物每組各注射20枚，注射劑量為100 μL/枚，免疫刺激物濃度分別為脂多糖2 mg/mL、肽聚糖200 μg/mL、聚肌胞苷酸2 μg/mL、葡聚糖600 μg/mL；對(duì)照組20枚,用磷酸緩沖液注射，注射劑量為100 μL/枚。分別在注射后0、6、12、24、48、72 h抽取海膽體腔液(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各抽取3枚海膽體腔液)，離心后棄上清液，收集體腔細(xì)胞浸沒(méi)于RNAlater中，于4 ℃冰箱中過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于組織基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量分析。

1.2.2 總RNA提取及cDNA第一鏈的合成 采用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)對(duì)蝦夷馬糞海膽各組織總RNA及免疫刺激后體腔細(xì)胞的總RNA進(jìn)行提取。采用核酸蛋白檢測(cè)儀與10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA濃度及完整性，將總RNA樣品保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。為減少個(gè)體差異及性別對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，精巢、卵巢各采用4枚雄性和4枚雌性海膽總RNA按濃度進(jìn)行等量混合，其余各組織均采用6枚海膽(雌、雄各3枚)的總RNA按濃度進(jìn)行等量混合，經(jīng)5種免疫刺激物刺激后的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)各提取3枚海膽的總RNA，然后將總RNA按濃度進(jìn)行等量混合，將混合后的總RNA分別采用cDNA第一鏈合成試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)合成cDNA第一鏈，得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3XIAP基因的cDNA克隆 基于從蝦夷馬糞海膽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[20]中篩選到的XIAP基因部分片段，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)RACE引物XIAP-3、XIAP-5(表1)，以體腔細(xì)胞總RNA合成的cDNA第一鏈為模板，采用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)進(jìn)行RACE克隆,分別用XIAP-3和XIAP-5與試劑盒中的UPM引物配對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系(共25 μL)：LA PCR buffer(10×)2.5 μL，cDNA 2 μL，dNTPs 2 μL，UPM 2 μL，XIAP-3 0.5 μL，XIAP-5 0.5 μL，LA Taq 0.25 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。采用以下程序進(jìn)行降落PCR反應(yīng)：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性30 s，72 ℃下退火與延伸3 min 30 s，共進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；94 ℃下變性30 s，70 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸3 min，共進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；94 ℃下變性30 s，65 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸3 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸7 min，4 ℃下保存。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物質(zhì)量。

表1 XIAP基因所用引物Tab.1 Primers for XIAP Gene

采用凝膠回收試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)回收目的條帶，將回收的cDNA片段連接到pEASY-T1載體(北京全式金生物技術(shù)有限公司)上，將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)中,再將細(xì)菌培養(yǎng)液均勻涂布于含氨芐西林、IPTG、X-gal的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)(37 ℃)12～16 h，挑取白色單菌落小量培養(yǎng)，采用M13通用引物進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，選取陽(yáng)性克隆菌液送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 采用NCBI在線(xiàn)工具BlastX(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對(duì)拼接后的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，得到的目標(biāo)序列提交到NCBI的ORF Finder (https://www.ncbi.nlm. nih.gov/orffinder/)查找其開(kāi)放閱讀框；采用在線(xiàn)工具ExPASy (https://www.expasy.org/resources)預(yù)測(cè)XIAP蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)，并提交到NCBI的Protein BLAST (https://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)，對(duì)所得氨基酸序列進(jìn)行同源性分析；采用MEGA 7.0軟件與其他物種的氨基酸序列相似性進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；使用DNASTAR軟件包中的MegAlign程序計(jì)算相似指數(shù)和分化指數(shù)，并采用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線(xiàn)工具預(yù)測(cè)XIAP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.5 組織表達(dá)特征分析 分別以“1.2.2節(jié)”中6種健康組織和經(jīng)5種免疫刺激物刺激體腔細(xì)胞后的6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)獲得的cDNA第一鏈為模板，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)XIAP基因在各健康組織，以及經(jīng)免疫刺激后在體腔細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量。內(nèi)參基因選取18S rRNA，根據(jù)GenBank中蝦夷馬糞海膽的18S rRNA序列設(shè)計(jì)(Accession：D14365)正、反向引物r18S-S、r18S-A(表1)。反應(yīng)體系(共20 μL)：2× SYBR Realting PCR Master Mix 10 μL，正、反向引物rXIAP-S、rXIAP-A(表1)各0.8 μL，cDNA模板2 μL，RNase free H2O 6.4 μL。PCR擴(kuò)增程序采用二步法：95 ℃下預(yù)變性30 s；95 ℃下變性5 s，60 ℃下退火34 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本均進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

采用2-ΔΔCt法計(jì)算XIAP基因在蝦夷馬糞海膽6種健康組織中的表達(dá)量，以及經(jīng)免疫刺激后XIAP基因在體腔細(xì)胞中的表達(dá)量。其中，經(jīng)免疫刺激后XIAP基因在體腔細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量是以注射PBS的對(duì)照組作為背景，數(shù)據(jù)表示為相對(duì)于基線(xiàn)水平(PBS 處理)的表達(dá)變化倍數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±S.E.)表示，利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列分析

將PCR、5′ RACE和3′ RACE獲得的3個(gè)片段拼接后得到長(zhǎng)度為4 894 bp的蝦夷馬糞海膽XIAPcDNA序列(圖1)。該序列包括459 bp的5′非編碼區(qū)(UTR)、2 331 bp開(kāi)放閱讀框(ORF)和2 104 bp的3′非編碼區(qū)(UTR)。序列已提交到GenBank(登錄號(hào)為OM209992)。蝦夷馬糞海膽XIAP基因的cDNA可編碼776個(gè)氨基酸，用ExPASy預(yù)測(cè)該蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為86 960,等電點(diǎn)為5.96，為酸性蛋白。將獲得的XIAP基因ORF序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)蝦夷馬糞海膽XIAP氨基酸序列與紫海膽XIAP序列的同源性最高，一致性為91.6%(表2)，確定該基因?yàn)槲r夷馬糞海膽X染色體連鎖凋亡蛋白抑制因子(X-linked inhibitor of apoptosis, XIAP)基因。SMART結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，蝦夷馬糞海膽XIAP蛋白具有3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域(84 aa～155 aa，241 aa～312 aa，375 aa～448 aa)和1個(gè)RING指環(huán)結(jié)構(gòu)域(729 aa～763 aa)(圖1)。

*表示終止密碼子；方框部分表示BIR結(jié)構(gòu)域；陰影方框部分表示RING指環(huán)結(jié)構(gòu)域。 Asterisk (*) indicates the stop codons；BIR domains are shown in blank box and the shadow box shows RING finger domain.圖1 蝦夷馬糞海膽XIAP基因cDNA序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig.1 Full-length cDNA sequence and predicted amino acid sequence of XIAP in sea urchin Strongylocentrotus intermedius

表2 不同物種間XIAP基因序列的距離Tab.2 Pair distances of XIAP nucleotide sequences among different species

2.2 同源性分析

用MEGA 7.0軟件對(duì)包括蝦夷馬糞海膽在內(nèi)的14個(gè)不同物種的XIAP氨基酸序列(表3)進(jìn)行同源性分析，用鄰位相接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap值設(shè)為1 000。結(jié)果顯示：進(jìn)化樹(shù)分為兩個(gè)分支，所有脊椎動(dòng)物均較好地聚集在一個(gè)分支中，而所有海洋無(wú)脊椎動(dòng)物均遠(yuǎn)離脊椎動(dòng)物單獨(dú)聚為一支；蝦夷馬糞海膽XIAP和紫海膽XIAP單獨(dú)聚為一小支(圖2)。這表明，蝦夷馬糞海膽的XIAP與紫海膽XIAP的親緣關(guān)系最近。

表3 系統(tǒng)發(fā)育分析所用XIAP氨基酸序列Tab.3 XIAP amino acid sequences used for phylogenetic analysis

圖2 基于XIAP氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on XIAP amino acid sequences

2.3 XIAP蛋白結(jié)構(gòu)域分析

利用SMART在線(xiàn)工具對(duì)包含蝦夷馬糞海膽、紫海膽和囊舌蟲(chóng)在內(nèi)的11個(gè)物種的XIAP蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖3)。其中，脊椎動(dòng)物(人、雞、非洲爪蟾和斑馬魚(yú))的XIAP蛋白包含3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域和1個(gè)RING指環(huán)結(jié)構(gòu)域，且第3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域和RING指環(huán)結(jié)構(gòu)域的距離相對(duì)較近；在蝦夷馬糞海膽、紫海膽、棘冠海星和囊舌蟲(chóng)的XIAP蛋白中同樣含3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域和1個(gè)RING指環(huán)結(jié)構(gòu)域，除囊舌蟲(chóng)外，其余物種的第3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域和RING指環(huán)結(jié)構(gòu)域距離相對(duì)較遠(yuǎn)；刺參、太平洋牡蠣和蝦夷扇貝XIAP蛋白的結(jié)構(gòu)域不同于其他物種。從結(jié)構(gòu)域的種類(lèi)、數(shù)量及位置可知，脊椎動(dòng)物的BIR結(jié)構(gòu)域排布更加緊密，而蝦夷馬糞海膽與紫海膽的結(jié)構(gòu)域在位置和種類(lèi)上極為相似，符合系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的分析結(jié)果。

圖3 基于XIAP氨基酸序列預(yù)測(cè)的蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)果比較Fig.3 Comparison of protein domain results based on XIAP amino acid sequence prediction

2.4 蝦夷馬糞海膽不同組織中XIAP基因的表達(dá)特征

采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析XIAP基因在蝦夷馬糞海膽選定組織中的相對(duì)表達(dá)情況。從圖4可見(jiàn)，XIAP基因在蝦夷馬糞海膽所有被檢測(cè)的組織中均有表達(dá)，但不同組織間的表達(dá)量有差異，XIAP基因在卵巢中表達(dá)量最高，且顯著高于其他組織(P<0.05)，在管足、圍口膜、體腔細(xì)胞、腸和精巢5種組織中的表達(dá)量均較低，且無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences.圖4 蝦夷馬糞海膽不同組織中XIAP基因的表達(dá)Fig.4 Expression level of XIAP gene in different tissues of sea urchin Strongylocentrotus intermedius

2.5 免疫刺激后體腔細(xì)胞中XIAP的表達(dá)特征

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，在5種免疫刺激物刺激蝦夷馬糞海膽體腔細(xì)胞后的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，XIAP基因在體腔細(xì)胞中均有表達(dá)(圖5)。經(jīng)LPS刺激后，XIAP基因在0、6、24、48、72 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量較低且無(wú)顯著性差異(P>0.05)，在12 h時(shí)表達(dá)量最高，且相較于0 h表達(dá)量顯著性提高了11倍(P<0.05)。經(jīng)PGN刺激后，0～12 h內(nèi)XIAP基因表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，12 h時(shí)表達(dá)量最高，12 h后表達(dá)量開(kāi)始下降，免疫刺激后的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量全部高于0 h表達(dá)量，僅12、6 h時(shí)的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。經(jīng)Poly I:C刺激后，體腔細(xì)胞中XIAP基因表達(dá)量在12～24 h時(shí)呈顯著性上升趨勢(shì)(P<0.05)，12 h時(shí)表達(dá)量最高，24 h時(shí)表達(dá)量略低于12 h，24～72 h時(shí)表達(dá)量逐漸下降至正常水平。經(jīng)WGP刺激后，XIAP基因表達(dá)量分別在24 h和48 h時(shí)顯著上調(diào)(P<0.05)，其余4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量較低，且無(wú)顯著性差異(P>0.05)。經(jīng)V.fortis刺激后，體腔細(xì)胞中XIAP基因表達(dá)量在6 h時(shí)顯著上調(diào)(P<0.05)，12 h后降為正常水平。

*表示同一種免疫刺激物刺激后XIAP基因在海膽體腔細(xì)胞中出現(xiàn)顯著性差異表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)。* indicates the time point at which the XIAP gene appears to be significantly differentially expressed in sea urchin coelomocytes after stimulation with the same immunostimulant (P<0.05).圖5 不同外源物刺激后XIAP基因在體腔細(xì)胞中的表達(dá)Fig.5 Expression of XIAP gene in coelomocyte after stimulation with different exogenous agents

綜上，5種免疫刺激物刺激蝦夷馬糞海膽體腔細(xì)胞后的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，XIAP基因表達(dá)量在體腔細(xì)胞中總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但不同免疫物刺激后XIAP基因的上調(diào)程度不同，最高表達(dá)量也有較大差異。在WGP、Poly I:C和V.fortis刺激后，XIAP基因在體腔細(xì)胞中最高點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量在3.0～5.2范圍內(nèi)，而經(jīng)PGN和LPS刺激后,XIAP基因在體腔細(xì)胞中最高點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量分別為16.5和11.25，且經(jīng)PGN和LPS刺激后，XIAP的最高表達(dá)量相較于0 h時(shí)分別上調(diào)了16倍和11倍。

3 討論

3.1 XIAP基因的功能分析

XIAP基因編碼的蛋白一般含有3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域和1個(gè)RING指環(huán)結(jié)構(gòu)域[21]。本研究中，克隆獲得的蝦夷馬糞海膽XIAP基因cDNA長(zhǎng)為4 894 bp，開(kāi)放閱讀框共編碼776個(gè)氨基酸，SMART蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，XIAP包含3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域和1個(gè)RING指環(huán)結(jié)構(gòu)域，符合XIAP此類(lèi)蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。此外，不同物種XIAP蛋白的BIR結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化上較為保守，該結(jié)構(gòu)域由富含半胱氨酸/組氨酸(Cysteine/Histidine)的70個(gè)氨基酸序列組成[22]。

目前，研究者共發(fā)現(xiàn)8個(gè)IAPs成員: NAIP、 c IAP1、c IAP2、XIAP、Survivin、Apollon、 ML IAP和ILP 2。在人類(lèi)IAP蛋白中，盡管其他IAP蛋白(NAIP、ML IAP、Survivin、ILP2和Apollon)也在細(xì)胞存活、細(xì)胞周期、炎癥和整體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[23]，但有關(guān)XIAP、c IAP1和c IAP2的研究相對(duì)較多。研究表明，XIAP在癌細(xì)胞中廣泛表達(dá)且表達(dá)量顯著增加。XIAP被確認(rèn)的第一個(gè)功能是其抗凋亡活性。然而，與不是Caspases直接抑制劑的 c IAP1和c IAP2相比，XIAP 是一種有效的程序性細(xì)胞死亡抑制劑，因?yàn)樗軌蛲ㄟ^(guò)其BIR2和BIR3結(jié)構(gòu)域直接阻斷Caspases 3/7/9的活性[5]。除了其抗凋亡功能外，XIAP還被證明參與了多種信號(hào)通路[24-25]。XIAP的這些功能大多依賴(lài)于其促進(jìn)蛋白質(zhì)泛素化的能力，它能通過(guò)其RING結(jié)構(gòu)域促進(jìn)蛋白質(zhì)泛素化，并能激活典型的NF-κB和MAPKs炎癥信號(hào)通路。

3.2 XIAP基因參與的免疫信號(hào)通路分析

XIAP蛋白是IAPs蛋白家族中的一員，XIAP蛋白除抑制細(xì)胞凋亡外，還能夠誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路和MAP激酶(促分裂原活化蛋白激酶)的激活[26]。MAP激酶級(jí)聯(lián)途徑在內(nèi)源、外源信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，該途徑可以調(diào)控細(xì)胞響應(yīng)各種外源信號(hào)，使機(jī)體對(duì)各種環(huán)境脅迫做出響應(yīng)。參與免疫反應(yīng)的早期和炎癥反應(yīng)各階段的許多分子也都受NF-κB的調(diào)控，另外一些抗炎及與細(xì)胞凋亡有關(guān)的分子也受NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控，其中就包括抗細(xì)胞凋亡蛋白IAPs。本研究中，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，蝦夷馬糞海膽的6種健康組織中均檢測(cè)到XIAP基因的轉(zhuǎn)錄本，其中，卵巢中的表達(dá)量最高，在精巢中也有表達(dá)，但表達(dá)量顯著低于卵巢。本試驗(yàn)取樣時(shí)正值海膽性腺成熟期，因此，筆者推測(cè)基因XIAP的高表達(dá)可能通過(guò)發(fā)揮免疫作用保護(hù)卵子免受病原體侵害。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的一個(gè)重要組成部分，通常在細(xì)菌裂解后釋放，其主要化學(xué)成分是脂多糖，作為細(xì)菌入侵生物體時(shí)的主要抗原分子，脂多糖的信號(hào)主要通過(guò)TLR 4實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)，并誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)[27]。本研究中，脂多糖刺激海膽體腔細(xì)胞后，蝦夷馬糞海膽XIAP在12 h時(shí)出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，表明XIAP在免疫刺激后參與了海膽TLR信號(hào)通路的調(diào)控。肽聚糖是NLR信號(hào)通路中的一個(gè)主要模式識(shí)別受體，NLR信號(hào)通路中肽聚糖的識(shí)別可以通過(guò)細(xì)胞凋亡抑制劑激活RIP2，然后激活NF-κB信號(hào)通路[28]。本研究中，當(dāng)海膽受到肽聚糖的刺激后，體腔細(xì)胞中XIAP表達(dá)量在12 h時(shí)顯著性上調(diào)，推測(cè)是肽聚糖在免疫刺激后被海膽NLR信號(hào)通路識(shí)別，此時(shí)XIAP蛋白發(fā)揮了細(xì)胞凋亡抑制劑的作用，激活了NF-κB信號(hào)通路，使海膽對(duì)外界刺激做出免疫應(yīng)答反應(yīng)。聚肌胞苷酸是一種合成型雙鏈RNA (dsRNA)的類(lèi)似物，一種病毒感染相關(guān)的分子模式，可部分模擬病毒感染的免疫激活機(jī)制。本研究中，以聚肌胞苷酸刺激海膽體腔細(xì)胞來(lái)模擬RNA病毒在RLR信號(hào)通路中識(shí)別的配體，在配體被識(shí)別后介導(dǎo)CARD 9復(fù)合體組裝，然后激活 NF-κB信號(hào)通路[29-30]，經(jīng)聚肌胞苷酸刺激后，體腔細(xì)胞中XIAP基因表達(dá)量在12～24 h時(shí)呈顯著性上調(diào)，推測(cè)XIAP基因參與了海膽的RLR信號(hào)通路。葡聚糖是真菌細(xì)胞壁基質(zhì)的主要成分，是CLR信號(hào)通路中的C型凝集素受體的配體[31]，當(dāng)葡聚糖作為配體被受體識(shí)別后，非受體酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase, TPK)被激活，然后介導(dǎo)CARD9復(fù)合體組裝，并激活NF-κB信號(hào)通路。本研究中，當(dāng)用葡聚糖對(duì)蝦夷馬糞海膽的體腔細(xì)胞進(jìn)行免疫刺激，XIAP基因表達(dá)量在刺激后的24 h時(shí)出現(xiàn)顯著性上調(diào)趨勢(shì)，這表明XIAP基因參與了海膽CLR信號(hào)通路的調(diào)控。強(qiáng)壯弧菌是蝦夷馬糞海膽的一種致病菌，本研究中，在海膽體腔細(xì)胞受到強(qiáng)壯弧菌刺激后的6 h時(shí)，XIAP基因表達(dá)量出現(xiàn)顯著性上調(diào)，隨后表達(dá)量開(kāi)始下降，直到72 h時(shí)降至正常水平，這表明XIAP基因參與了蝦夷馬糞海膽的免疫應(yīng)答，在海膽的免疫中發(fā)揮了作用。

NF-κB信號(hào)通路是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，調(diào)控細(xì)胞的多種基因表達(dá)，與細(xì)胞的增殖、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)有關(guān)。IAPs能夠通過(guò)調(diào)控NLR、TLR、RLR和CLR信號(hào)通路進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路，因此，在幾乎所有病原體刺激海膽體腔細(xì)胞時(shí)，XIAP基因表達(dá)量均出現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)，說(shuō)明XIAP在4種信號(hào)通路的上游信號(hào)向下游傳遞過(guò)程中可能起到至關(guān)重要的作用，且XIAP作為凋亡抑制因子可以保護(hù)細(xì)胞在病原入侵時(shí)不被降解[32]，因此,體腔細(xì)胞在經(jīng)多種病原菌處理后XIAP基因的表達(dá)量均有不同程度的變化。本研究中，克隆獲得了蝦夷馬糞海膽XIAP基因序列，并分析了其在不同外源物刺激后的表達(dá)量變化。結(jié)果顯示，該基因參與了NLR、TLR、RLR和CLR 4種信號(hào)通路，相較于RLR和CLR信號(hào)通路，XIAP基因?qū)LR和TLR信號(hào)通路的調(diào)控更強(qiáng)，因此推測(cè)，XIAP可能在NLR和TLR信號(hào)通路中發(fā)揮了更加重要的調(diào)節(jié)功能。

4 結(jié)論

1)同源性及遺傳進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，蝦夷馬糞海膽的XIAP氨基酸序列與紫海膽XIAP氨基酸序列的同源性最高，與太平洋牡蠣氨基酸序列的同源性最低，符合物種進(jìn)化規(guī)律。這表明，XIAP基因在海膽中具有一定的遺傳保守性。

2) 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，XIAP基因在蝦夷馬糞海膽的6種健康組織中均有不同程度的表達(dá)，其中，在卵巢中的表達(dá)量最高，且與其他5種組織的表達(dá)量之間存在顯著性差異。本試驗(yàn)取樣時(shí)正值海膽性腺成熟期，筆者推測(cè)，基因XIAP在卵巢中的高表達(dá)，可能是為了通過(guò)發(fā)揮免疫作用來(lái)保護(hù)卵子免受病原體侵害。

3) 5種免疫刺激物刺激蝦夷馬糞海膽體腔細(xì)胞后的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，XIAP基因在體腔細(xì)胞中的表達(dá)量總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但不同免疫物刺激后XIAP基因上調(diào)程度不同，最高表達(dá)量也有較大差異。這表明，XIAP基因在不同免疫物刺激后的不同時(shí)間點(diǎn)可能存在不同的調(diào)控作用，證實(shí)XIAP基因參與了蝦夷馬糞海膽的免疫應(yīng)答，并在海膽的天然免疫中發(fā)揮重要作用。