王炫凱，趙彤，岳揚，王侯宇，曲寶成*，熊玉宇，張玉鳳

(1.設施漁業(yè)教育部重點實驗室(大連海洋大學)，遼寧 大連 116023；2.大連市檢驗檢測認證技術服務中心，遼寧 大連 116630)

重金屬是一種具有毒性、持久性、不可降解性和生物累積性的環(huán)境污染物，當人體接觸重金屬劑量超過安全閾值時，重金屬會對健康產(chǎn)生重大風險。有研究表明，Pb、Cd、Hg可能影響神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和男性生殖系統(tǒng)并擾亂骨骼造血功能，Cr6+對人類也有致癌毒性[1]，這些非必需重金屬即使在低濃度下也可能是有毒的。必需重金屬對生物體而言是必不可少的，但在高濃度時也可能具有毒性，如Zn、Cu的高攝入量可能對人體神經(jīng)產(chǎn)生毒性[2]。長期以來，重金屬的毒性安全廣受關注。

魚類等水產(chǎn)品因含有豐富的氨基酸、維生素和必需礦物質(zhì)而深受消費者喜愛。為滿足日益增長的人類消費需求，水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量快速增長，2020年中國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量為5 224.20萬t，已達捕撈產(chǎn)量(1 324.82萬t)的3.94倍[3]。然而，高產(chǎn)量的水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品長期依賴于飼料、抗生素、殺蟲劑和其他方面的投入[4],也造成了諸多不利影響，導致重金屬等污染物在水產(chǎn)品中積累，進而通過食物鏈進行放大和轉(zhuǎn)移，對人類健康產(chǎn)生威脅[5]。

目前，關于水產(chǎn)品重金屬污染特征及健康風險的研究主要集中在淺海養(yǎng)殖、網(wǎng)箱養(yǎng)殖、池塘養(yǎng)殖等傳統(tǒng)養(yǎng)殖領域。循環(huán)水養(yǎng)殖模式(recirculating aquaculture system，RAS)作為一種新興的水產(chǎn)養(yǎng)殖方式，通過系統(tǒng)中各單元間的高效配合與管理，可大大提高水資源的利用率，也促進了對水體污染物的管理與營養(yǎng)物質(zhì)的重復利用[6]。然而，由于其封閉管理的特征，隨之而來的便是水交換率的降低，一旦污染物隨源水進入該系統(tǒng)便較難再排出，最終將直接影響到水產(chǎn)品質(zhì)量安全。目前，有關RAS養(yǎng)殖模式的研究，主要集中在養(yǎng)殖系統(tǒng)水處理工藝過程的改進提升、生物濾器載體填料的選擇和系統(tǒng)病害的防治等方面，關于該系統(tǒng)養(yǎng)殖產(chǎn)品中重金屬等污染物的研究鮮有報道。

紅鰭東方鲀Takifugurubripes是中國北方重要的經(jīng)濟魚類之一，其肌肉潔白如霜、滑膩似脂、滋味腴美、營養(yǎng)豐富，深受消費者的喜愛。然而，野生紅鰭東方鲀無法滿足消費者的需求，無毒、美味的紅鰭東方鲀才是消費者的理想佳肴[7]，但目前尚不清楚循環(huán)水養(yǎng)殖紅鰭東方鲀重金屬等污染物的濃度水平及其對消費者是否存在健康風險。本研究中，以大連市某循環(huán)水養(yǎng)殖企業(yè)的主要水產(chǎn)品紅鰭東方鲀作為研究對象，對不同養(yǎng)殖階段紅鰭東方鲀體內(nèi)Pb、Cd、Hg、Cu、Cr 5種重金屬的含量變化及重金屬污染狀況進行評價，并通過計算預計日攝入量、非致癌風險和致癌風險等健康風險評價指標，對循環(huán)水養(yǎng)殖紅鰭東方鲀的重金屬污染狀況及健康風險進行研究與評價，以期為循環(huán)水養(yǎng)殖模式優(yōu)化和科學管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用魚：2021年5月14日，在大連市某循環(huán)水養(yǎng)殖企業(yè)隨機挑選不同養(yǎng)殖階段，發(fā)育正常、體質(zhì)健康的紅鰭東方鲀14 尾，具體規(guī)格見表1。同時，取飼喂不同養(yǎng)殖階段紅鰭東方鲀所用的福星牌飼料若干。

表1 試驗用不同養(yǎng)殖階段紅鰭東方鲀樣本Tab.1 Sample of tiger puffer Takifugu rubripes at different stages

儀器：電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS 7500a，安捷倫科技有限公司)；ETHOS大微波消解萃取系統(tǒng)和VB24 Plus趕酸器(均為北京萊伯泰科儀器股份有限公司)。

試劑：重金屬標準溶液購于中國環(huán)境保護部標準樣品研究所；HNO3(體積分數(shù)65%，優(yōu)級純)購于天津市科密歐化學試劑有限公司；H2O2(質(zhì)量分數(shù)30%，優(yōu)級純)購于上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 將采集的樣品放入潔凈的聚乙烯塑料袋后轉(zhuǎn)移至低溫保溫箱中，帶回實驗室冷藏保存。將魚體用水清洗，再用高純水淋洗后，待魚體表面自然陰干后取樣。稚魚整體取樣，幼魚和成魚解剖后取肝臟、皮膚、肌肉、性腺、鰓組織部位，均質(zhì)后置入-20 ℃冰箱中保存待測。稱取0.5 g樣品置入微波消解罐，加入4 mL體積分數(shù)為65%的HNO3、1.5 mL質(zhì)量分數(shù)為30%的H2O2，加蓋靜置過夜后放入微波消解儀中消解90 min(溫度為180 ℃)，冷卻后取出，緩慢打開罐蓋將氣體排出，轉(zhuǎn)至趕酸儀趕酸60 min，趕酸溫度為150 ℃，當溶液澄清近干且冒出白煙時將其從趕酸儀中取出并冷卻至室溫，用去離子水定容至50 mL。飼料樣品處理參考魚樣做適當調(diào)整。

1.2.2 重金屬測定

1)測定方法。樣品消解后，采用ICP-MS儀測定樣品中Pb、Cd、Hg、Cu、Cr 5種重金屬的含量，測定方法參照《食品安全國家標準食品中多元素的測定》(GB 5009.268—2016)。按逐級稀釋法配制成標準溶液，空白溶液為體積分數(shù)2%的稀硝酸。在測定過程中完成標準曲線的制作，并依據(jù)標準曲線計算得出樣本中的重金屬含量，結(jié)果均以濕質(zhì)量計。

2)質(zhì)量控制。利用重金屬標準溶液進行質(zhì)量控制，標準曲線相關性系數(shù)>0.99，重復建立標準曲線，兩次響應斜率誤差均<5%后開始對樣品進行測試，每分析10個樣品加1個標樣測定，用于標準曲線校準，要求回收率為85%～120%。同時，每10個樣品帶2個空白試劑和1個基質(zhì)加標，基質(zhì)加標回收率為95.5%～110.0%。每個樣品均設3個平行樣，平行樣濃度間的相對標準偏差<25%。每個樣品重復測定3次，相對標準偏差<10%。

1.2.3 評價方法

1)污染狀況評價。采用單因子污染指數(shù)法[8]和內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)法[9]進行魚體重金屬污染狀況評價。計算公式分別為

Pi=Ci/Si。

(1)

其中：Pi為重金屬i的污染指數(shù)；Ci為重金屬i的實測值(mg/kg)；Si為重金屬i的評價標準值(mg/kg)。當Pi<0.2時，為1級，無污染；當0.2≤Pi<0.6時，為2級，輕度污染；當0.6≤Pi<1.0時，為3級，中度污染；當Pi≥1.0時，為4級，重度污染。

(2)

其中：Pin為重金屬的內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)；Pi,mean為各種重金屬單因子污染指數(shù)的平均值；Pi,max為各種重金屬單因子污染指數(shù)的最大值。當Pin≤1時，為1級，無污染；當13時，為4級，重度污染。

2)人體健康風險評估。本研究中主要進行預計日攝入量評估[10]、非致癌風險評估和致癌風險評估[11]。評價指標計算公式為

EDI=(Ci×Im)/W×10-3。

(3)

其中： EDI為重金屬預計日攝入量[mg/(kg·d)]；Ci為重金屬i的實測值(mg/kg)；Im為水產(chǎn)品的日均攝入率(g/d);W為平均體質(zhì)量(kg);10-3為換算系數(shù)。Pb、Cd、Hg、Cu、Cr的允許日攝入量分別為1.50×10-3、8.00×10-4、4.00×10-2、5.00×10-1、4.30×10-3mg/kg[12]。

THQnon=(Fe×te×Im×Ci)/(Rf×W×ta)×10-3，

(4)

THQ=(Fe×te×Im×Ci×CSF)/(W×ta)×10-3。

(5)

其中： THQnon為非致癌風險的目標危害商數(shù)；Fe為暴露頻率(365 d/a)；te為暴露持續(xù)時間(70 a或6 a)；Im為水產(chǎn)品的日均攝入率(g/d)；Ci為重金屬i的實測值(mg/kg)；Rf為重金屬口服參考劑量，Pb、Cd、Hg、Cu、Cr的口服參考劑量分別為4.0×10-3、1.0×10-3、1.0×10-4、4.0×10-2、1.5 mg/(kg·d)[12]；W為平均體質(zhì)量(kg)；ta為非致癌物效應的平均暴露時間(te×365 d/a)；10-3為換算系數(shù)。依據(jù)美國環(huán)保署相關標準，當THQnon<1時，表明兒童、成人均不存在非致癌風險；當THQnon≥1時，表明兒童、成人均存在潛在的非致癌風險[13]。THQ為致癌風險的目標危害商數(shù)；CSF為致癌斜率因子，其中Pb、Cd的致癌斜率因子分別為8.50×10-3、3.80×10-1mg/(kg·d)[14]。依據(jù)美國環(huán)保署相關標準，當THQ≤1×10-6時，表明兒童、成人均不存在致癌風險；當 1×10-61×10-4時，表明兒童、成人均存在不可接受的致癌風險[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 26軟件對不同養(yǎng)殖階段、樣品類型的重金屬含量進行雙因素方差分析，用Duncan法進行組間多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同養(yǎng)殖階段紅鰭東方鲀飼料中重金屬平均含量

從表2可見,不同養(yǎng)殖階段,紅鰭東方鲀飼料中重金屬平均含量依次為Cu>Pb>Cr>Cd>Hg，各種重金屬含量均未超標，符合《飼料衛(wèi)生標準》(GB 13078—2017)中的規(guī)定。

表2 不同養(yǎng)殖階段紅鰭東方鲀飼料中重金屬平均含量

2.2 不同養(yǎng)殖階段紅鰭東方鲀體內(nèi)重金屬平均含量及變化

從表3可見：在稚魚、幼魚和成魚中，5種重金屬平均含量依次為Cu>Cr>Hg>Cd>Pb；在幼魚和成魚各組織中，Pb在皮膚中平均含量最高(分別為0.025、0.025 mg/kg)，Cd在肝臟中平均含量最高(分別為0.018、0.031 mg/kg)，Hg在肌肉、肝臟中平均含量最高(分別為0.028、 0.022 mg/kg)，Cu在肝臟中平均含量最高(分別為1.526、1.162 mg/kg)，Cr在肌肉中平均含量最高(分別為0.270、0.138 mg/kg)；隨著養(yǎng)殖過程的推進，魚體中各種重金屬含量呈先上升后下降趨勢，在幼魚出現(xiàn)峰值。在所檢測的不同樣品中，各種重金屬含量均未超標，符合《食品安全國家標準食品中污染限量》(GB 2762—2017)、《無公害食品水產(chǎn)品中有毒有害物質(zhì)限量》(NY 5073—2006)規(guī)定。

雙因素方差分析表明：不同養(yǎng)殖階段對Cd、Hg、Cu、Cr含量無顯著性影響(P>0.05)，Pb因檢出樣本過少，無結(jié)果；不同樣品類型對Cd、Hg、Cu含量有顯著性影響(P<0.05)，但對Cr含量無顯著性影響(P>0.05), Pb因檢出樣本過少，無結(jié)果；養(yǎng)殖階段與樣品類型的交互作用對Cd、Hg、Cu、Cr含量無顯著性影響(P>0.05)，Pb因檢出樣本過少，無結(jié)果(表3)。在幼魚和成魚階段，皮膚、肌肉、性腺、鰓中Cd的含量無顯著性差異(P>0.05)，但均顯著低于肝臟中Cd含量(P<0.05)；肝臟、肌肉中Hg的含量無顯著性差異(P>0.05)，但均顯著高于其他組織(P<0.05)；肝臟和性腺中Cu的含量顯著高于其他組織(P<0.05)。此外，稚魚、幼魚、成魚的全魚中Cd、Hg、Cu、Cr的含量均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 不同養(yǎng)殖階段紅鰭東方鲀體內(nèi)重金屬平均含量Tab.3 Average contents of heavy metals in tiger puffer Takifugu rubripes at different breeding stages

2.3 不同養(yǎng)殖階段紅鰭東方鲀體內(nèi)重金屬單因子污染指數(shù)、內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)計算結(jié)果

單因子污染指數(shù)計算結(jié)果顯示，3個養(yǎng)殖階段相比，Cu、Hg在稚魚階段污染指數(shù)最高(分別為0.009、0.016)，Cd、Cr在幼魚階段污染指數(shù)最高(分別為0.074、0.090)，Pb在成魚階段污染指數(shù)最高(0.052)(圖1(a))。內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)計算結(jié)果由高至低依次為幼魚(0.07)>成魚(0.05)>稚魚(0.03)(圖1(b))。

圖1 不同養(yǎng)殖階段紅鰭東方鲀體內(nèi)重金屬的單因子污染指數(shù)、內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)Fig.1 Single factor pollution index and the Nemerow comprehensive pollution index of heavy metals in the body of tiger puffer Takifugu rubripes at different breeding stages

2.4 不同養(yǎng)殖階段紅鰭東方鲀體內(nèi)重金屬預計日攝入量、非致癌風險、致癌風險評價

2.4.1 預計日攝入量評價 不同養(yǎng)殖階段紅鰭東方鲀體內(nèi)重金屬預計日攝入量評價結(jié)果見表4。由于兒童、成人體質(zhì)量差異，其預計日攝入量也呈現(xiàn)出不同結(jié)果，成人對不同養(yǎng)殖階段魚體內(nèi)各種重金屬的預計日攝入量均低于兒童。但不論成人還是兒童，對各種重金屬的預計日攝入量均低于各自的允許日攝入量1～4個數(shù)量級。

表4 不同養(yǎng)殖階段紅鰭東方鲀體內(nèi)重金屬預計日攝入量(EDI)評價結(jié)果Tab.4 Estimated daily intake of heavy metals(EDI) by tiger puffer Takifugu rubripes at different stages of culture

2.4.2 非致癌風險評價 不同養(yǎng)殖階段紅鰭東方鲀體內(nèi)重金屬非致癌風險評價結(jié)果見表5。據(jù)此評價結(jié)果，不同養(yǎng)殖階段魚體內(nèi)各種重金屬對成人造成的非致癌健康風險均低于兒童，但各種重金屬對成人、兒童的非致癌風險THQnon<1，表明均不存在非致癌風險。

表5 不同養(yǎng)殖階段紅鰭東方鲀體內(nèi)重金屬非致癌風險(THQnon)評價結(jié)果Tab.5 Non-carcinogenic risk assessment of heavy metals(THQnon) in tiger puffer Takifugu rubripes at different stages of culture

2.4.3 致癌風險評價 按照美國環(huán)保署綜合風險信息系統(tǒng)的分類信息，本研究中僅對Pb和Cd進行致癌風險評價。不同養(yǎng)殖階段紅鰭東方鲀體內(nèi)重金屬致癌風險評價結(jié)果見表6。將評估結(jié)果和美國環(huán)保署推薦標準比較后發(fā)現(xiàn)，不同養(yǎng)殖階段魚體內(nèi)的Pb對成人、兒童的致癌風險THQ≤1×10-6，表明均不存在致癌風險；成魚體內(nèi)的Cd對成人不會造成致癌風險，其他養(yǎng)殖階段魚體內(nèi)的Cd對成人和兒童均表現(xiàn)出可接受的致癌風險，且對兒童造成的致癌風險要高于成人。

表6 不同養(yǎng)殖階段紅鰭東方鲀體內(nèi)重金屬致癌風險(THQ)評價結(jié)果Tab.6 Cancer risk assessment of heavy metal(THQ) in tiger puffer Takifugu rubripes at different stages of culture

3 討論

3.1 不同養(yǎng)殖階段紅鰭東方鲀體內(nèi)重金屬富集規(guī)律

Cu作為一種必需金屬，對促進魚類新陳代謝具有重要作用[16]，因此，Cu較易被魚類吸收，另外，Cu還是飼料添加劑的主要成分之一[17]。本研究顯示，在稚魚、幼魚和成魚中，5種重金屬平均含量依次為Cu>Cr>Hg>Cd>Pb。魚飼料中Cu的平均含量為(0.588±0.359)mg/kg，相對較高，這可能是造成魚體內(nèi)Cu含量較高的原因。魚類不同器官對各種重金屬的富集能力差異較大。楊妙峰等[18]研究發(fā)現(xiàn)，鱸Lateolabrax皮膚中Pb含量顯著高于其他部位；晏翰林等[19]研究發(fā)現(xiàn),鯽Carassiusauratus肌肉中Hg含量相對較高；曾歡等[20]等研究發(fā)現(xiàn)，鲇Silurusasotus肝臟中Cd、Cu含量高于鰓和肌肉；馬千里等[21]研究發(fā)現(xiàn)，大眼鱖SinipercakneriGarman肌肉中Cr含量相對較高(0.211 mg/kg)，本研究結(jié)果與之類似。本研究中幼魚和成魚肝臟中Cd與Cu含量、肌肉中Hg含量顯著高于其他組織，皮膚中Pb含量、肌肉中Cr含量高于其他組織。Fernandes等[22]研究表明，鯔Lizasaliens肝臟、性腺具有代謝活性，有較強的重金屬富集能力。徐承香等[23]對黃顙魚Pelteobagrusfulvidraco、草魚Ctenopharyngodonidella研究發(fā)現(xiàn)，部分重金屬元素是通過體表滲透進入魚體內(nèi)，所以部分魚皮膚中重金屬含量高于其他組織。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖初期魚體內(nèi)重金屬的富集速率會隨體長、體質(zhì)量的迅速增加而增加，后期含量有所降低，可能與生理代謝過程有關，隨著體長、體質(zhì)量的不斷增加，重金屬在體內(nèi)被稀釋，濃度呈現(xiàn)下降趨勢，閆海魚等[24]對花鰱Aristichthysnobilis的研究也得到了類似的結(jié)果。魚體器官中部分重金屬含量隨年齡的增長而不斷增加，這與Farkas等[25]對Abramisbrama的研究結(jié)果大體一致，可能是由于魚類等水生生物含有豐富的巰基蛋白質(zhì)，降解周期較長，能夠使Cu、Cd等重金屬離子在魚體內(nèi)穩(wěn)定存在，從而出現(xiàn)生物蓄積的現(xiàn)象[26]。

3.2 不同養(yǎng)殖階段紅鰭東方鲀體內(nèi)重金屬污染評價

單因子污染指數(shù)、內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)分別用于對魚體單一、復合重金屬污染狀況進行評價，是衡量魚體重金屬污染狀況的重要指標。本研究表明，在養(yǎng)殖的3個階段，紅鰭東方鲀幼魚體內(nèi)重金屬的內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)最高，陳海剛等[27]對近江牡蠣Ostrearivularis的研究中發(fā)現(xiàn)，在養(yǎng)殖初期，重金屬濃度會隨體質(zhì)量的增加而增加，而后重金屬濃度下降，可能與稀釋效應有關。本研究中，綜合單因子污染指數(shù)、內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)評價結(jié)果，不同養(yǎng)殖階段紅鰭東方鲀體內(nèi)重金屬含量均處于無污染范圍。綜上，該循環(huán)水養(yǎng)殖企業(yè)的紅鰭東方鲀體內(nèi)的重金屬污染狀況在安全范圍內(nèi)，但仍需對該系統(tǒng)進行監(jiān)測管理與日常維護。此外，本研究中還發(fā)現(xiàn)，Cr在不同養(yǎng)殖階段的單因子污染指數(shù)始終最高，對內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)貢獻最大，雖處于安全范圍，但仍需引起重視。

3.3 紅鰭東方鲀體內(nèi)重金屬的健康風險

興起于美國國家科學院和美國環(huán)保署的人體健康風險評價包括預計日攝入量評價、非致癌風險評價和致癌風險評價等內(nèi)容，可預測重金屬等污染物對人體健康的不利影響[28]。本研究中，根據(jù)預計日攝入量、非致癌風險、致癌風險評價結(jié)果，兒童對各種重金屬表現(xiàn)出相對較高的健康風險，這意味著兒童對重金屬的敏感程度要高于成人,更易受到重金屬的威脅，因此，應予以高度重視。有研究表明，Pb、Cd等非必需金屬會導致兒童生長畸形、發(fā)育障礙[29]。本研究中，綜合健康風險評價結(jié)果，各種重金屬對成人和兒童造成的健康風險均在可接受范圍內(nèi)，即適量食用該循環(huán)水養(yǎng)殖企業(yè)的紅鰭東方鲀的健康風險較低，比較安全。

4 結(jié)論

1)循環(huán)水養(yǎng)殖的紅鰭東方鲀體內(nèi)Cd、Cu、Hg在肝臟中的富集程度較高，Cr在肌肉中富集程度較高，但各種重金屬含量均未超過GB 2762—2017、NY 5073—2006規(guī)定的安全標準。

2)Cd、Hg、Cu、Cr含量在紅鰭東方鲀不同養(yǎng)殖階段無顯著性差異(P>0.05)，Cd、Hg、Cu含量在紅鰭東方鲀不同組織部位有顯著性差異(P<0.05)，肝臟、肌肉是重金屬的主要富集器官。

3)魚體重金屬的單因子污染指數(shù)、內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)均處于無污染范圍。根據(jù)健康風險評價結(jié)果，預計日攝入量對健康風險的貢獻較小，兒童、成人的致癌風險均處于可接受范圍，非致癌風險可忽略不計，但兒童的健康風險總體略高于成人。

綜上，采用循環(huán)水養(yǎng)殖模式，紅鰭東方鲀的重金屬含量水平能夠保持在安全范圍之內(nèi)，但仍需對該養(yǎng)殖體系進行長期監(jiān)測管理。