王鶴，王文豪，黃華，劉曉丹，張麗文，楊濤，胡樂(lè)彬，李戰(zhàn)軍

(1.煙臺(tái)市海洋經(jīng)濟(jì)研究院，山東 煙臺(tái) 264006；2.煙臺(tái)宗哲海洋科技有限公司，山東 煙臺(tái) 264006；3.山東省漁業(yè)發(fā)展和資源養(yǎng)護(hù)總站，山東 煙臺(tái) 264003)

大菱鲆Scophthalmusmaximus隸屬于鰈形目Pleuronectiformes鰈亞目Pleuronectoidei鲆科Bothidae菱鲆屬Scophthalmus，原產(chǎn)于大西洋，是底棲型冷水魚(yú)類(lèi)[1]。自1992年中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所從英國(guó)將其引入中國(guó)后，隨著規(guī)模化苗種繁育技術(shù)的突破與工廠化養(yǎng)殖模式的創(chuàng)建，大菱鲆養(yǎng)殖在黃渤海三省一市沿岸迅速發(fā)展，大菱鲆亦被譽(yù)為中國(guó)海水養(yǎng)殖良種引進(jìn)的典范[2]。但隨著集約化養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，細(xì)菌性病害日益嚴(yán)重，給大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道，可感染大菱鲆發(fā)病的病原菌主要有鰻弧菌[3]、哈維氏弧菌[4]、嗜水氣單胞菌[5]、遲緩愛(ài)德華氏菌[6]和副乳房鏈球菌[7]等，可引起大菱鲆體表潰瘍、皮下及肌肉充血出血、腹水、器官壞死等病征。

癤瘡病(furunculosis)是養(yǎng)殖鮭鱒常見(jiàn)的細(xì)菌病，病原為氣單胞菌科Aeromonadaceae氣單胞菌屬Aeromonas的殺鮭氣單胞菌Aeromonassalmonicida。殺鮭氣單胞菌是一種嗜冷、無(wú)動(dòng)力和兼性厭氧革蘭氏陰性菌，廣泛分布于海、淡水中[8]，該菌除感染鮭鱒魚(yú)類(lèi)外，還可感染鯉科Cyprinidae、鰻鱺科Anguillidae[9]、鰨科Pleuronectidae[10]和鲆科[11]等魚(yú)類(lèi)。自1992年首次從西班牙養(yǎng)殖大菱鲆中分離到殺鮭氣單胞菌以來(lái)[12]，該菌感染大菱鲆的報(bào)道日漸增多[13-14]，中國(guó)也有大菱鲆感染引起癤瘡病的相關(guān)報(bào)道[11,15]。目前，已得到公認(rèn)的殺鮭氣單胞菌有5個(gè)亞種[16]：殺鮭亞種A.salmonicidasubsp.salmonicida、殺日本鮭亞種A.salmonicidasubsp.masoucida、無(wú)色亞種A.salmonicidasubsp.achromogenes、史氏亞種A.salmonicidasubsp.smithia和溶果膠亞種A.salmonicidasubsp.pectinolytica。在中國(guó)，引起大菱鲆癤瘡病的病原多為殺鮭氣單胞菌無(wú)色亞種，尚未見(jiàn)殺日本鮭亞種感染養(yǎng)殖大菱鲆發(fā)病的報(bào)道。

2020年，在對(duì)山東省煙臺(tái)市大菱鲆主產(chǎn)區(qū)常規(guī)病害監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)，某養(yǎng)殖場(chǎng)大菱鲆有體色發(fā)黑、腹部膨大的患病個(gè)體，解剖發(fā)現(xiàn)，患病個(gè)體腹腔有淡紅色腹水、腸腫脹、脾腫大和腎壞死。本研究中，以自然發(fā)病大菱鲆為試驗(yàn)材料，分離純化獲得一株優(yōu)勢(shì)菌BHAS-1，通過(guò)臨床癥狀觀察、生理生化鑒定和序列比對(duì)分析等方法，鑒定其為殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種。本研究中首次報(bào)道了中國(guó)殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種對(duì)養(yǎng)殖大菱鲆的自然感染致病，通過(guò)對(duì)分離菌株開(kāi)展毒力基因檢測(cè)、藥敏試驗(yàn)等，以期為該菌引起的非典型癤瘡病的有效防控提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用無(wú)典型癤瘡病癥狀的大菱鲆樣品于2020年10月采自山東省煙臺(tái)市某深井海水室內(nèi)流水養(yǎng)殖車(chē)間，養(yǎng)殖水溫為17 ℃左右，患病個(gè)體體質(zhì)量為83.4～433.3 g，平均體質(zhì)量為248.3 g。試驗(yàn)用健康大菱鲆購(gòu)自煙臺(tái)宗哲海洋科技有限公司。

水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(muller hinton，MH)、腦心浸液培養(yǎng)基(brian heart infusion，BHI)、革蘭氏染色試劑盒和生理生化鑒定管等均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑購(gòu)自寶生物(大連)有限公司；試驗(yàn)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化 取有典型病征的瀕死個(gè)體，首先進(jìn)行體表、鰓等組織的寄生蟲(chóng)檢查，然后用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇擦拭腹部，用無(wú)菌工具解剖，取肝、腎、脾等組織。經(jīng)無(wú)菌水沖洗、研磨后，在BHI瓊脂平板劃線，28 ℃下倒置培養(yǎng)24～48 h，觀察記錄菌落形態(tài)特征，取優(yōu)勢(shì)菌純化2～3次后，用終體積分?jǐn)?shù)為40%的甘油保種，-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株鑒定 采用革蘭氏染色法對(duì)菌株染色觀察，并應(yīng)用生理生化鑒定管測(cè)定菌株生理生化特性。按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒要求提取純化菌株DNA。分別使用16S rRNA通用引物(27F:5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3′，1 492R:5′GG- TTACCTTGTTACGACTT 3′)、DNA促旋酶B亞基基因(gyrase B，gyrB)特異性引物(F: 5′TCCGGCGGTCTGCACGGCGT 3′，R: 5′TTGTCCGGGTTGTACTCGTC 3′)和毒力陣列蛋白基因(又稱A層蛋白基因，virulence array protein A,vapA)特異性引物(F: 5′ACAGTGCACCGAAGGTTGAT 3′，R: 5′ACGGCAGAGCTTGTCTACCT 3′)進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.3 人工回歸感染試驗(yàn) 將保存?zhèn)溆玫姆蛛x株活化后在BHI平板培養(yǎng)24～48 h，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的滅菌生理鹽水洗脫純培養(yǎng)物制成菌懸液，平板計(jì)數(shù)。將菌懸液分別制成4.1×107、4.1×108、4.1×109、4.1×1010CFU/mL 4個(gè)梯度濃度。選擇個(gè)體大小與患病個(gè)體接近的健康大菱鲆作為回歸感染對(duì)象，在車(chē)間暫養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，每組10尾，每尾腹腔注射梯度菌懸液0.1 mL，對(duì)照組注射相同體積的無(wú)菌生理鹽水。人工感染后養(yǎng)殖水溫為(17±0.5)℃，每天換水30%并記錄發(fā)病、死亡情況，取瀕死病魚(yú)的內(nèi)臟器官再次分離鑒定病原菌。按照改良寇氏法[17]計(jì)算半致死濃度。

1.2.4 毒力基因檢測(cè) 用PCR檢測(cè)分離菌株的氣溶素(aer)、封閉條帶毒素(zot)、DNA酶(dna)、絲氨酸蛋白酶(ser)、磷脂酶(lip)、S層蛋白(sp)、熱不穩(wěn)定性細(xì)胞興奮性腸毒素(alt)、細(xì)胞毒性腸毒素(act)、熱穩(wěn)定性細(xì)胞興奮性腸毒素(ast)、胞外蛋白酶(epa)、鞭毛蛋白(fla)和彈性蛋白酶(ahyB)等12個(gè)毒力相關(guān)基因的攜帶情況[18]，各毒力基因引物序列、退火溫度及目的片段大小見(jiàn)表1。PCR體系同“1.2.2節(jié)”，采用10 g/L瓊脂糖電泳檢測(cè)，紫外凝膠成像拍照后，將與預(yù)期目的片段大小一致的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

表1 各毒力基因PCR引物、退火溫度和目的產(chǎn)物長(zhǎng)度Tab.1 Primer sequence, annealing temperature and product sizes of virulence genes

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 參照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)推薦的紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer, K-B)操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗生素藥物敏感性測(cè)試。按照麥?zhǔn)媳葷岱▽⒎蛛x株制成濃度為1.0×108CFU/mL的菌懸液，均勻涂布于MH平板后，貼藥敏紙片，28 ℃下培養(yǎng)24 h后,根據(jù)菌落生長(zhǎng)情況測(cè)定抑菌圈。測(cè)試用抗生素共計(jì)10類(lèi)22種，每種藥物設(shè)置3個(gè)重復(fù)。依據(jù)CLSI[19]標(biāo)準(zhǔn)判定藥物敏感性，標(biāo)準(zhǔn)未涵蓋部分參照楊移斌等[20]的判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離鑒定

2.1.1 病原菌分離與形態(tài)學(xué)觀察 在瀕死病魚(yú)體表、鰓和內(nèi)臟處均未觀察到寄生蟲(chóng)感染。在內(nèi)臟組織中分離獲得多株形態(tài)、大小一致的優(yōu)勢(shì)菌，取脾組織獲得的優(yōu)勢(shì)菌命名為BHAS-1。該菌株在BHI平板上形成圓形、細(xì)小、白色的微隆起菌落，生長(zhǎng)速度較為緩慢，菌落表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊，直徑為0.6～1.0 mm；在5%羊血(體積分?jǐn)?shù)，下同)平板上菌落略大，24 h未發(fā)生溶血(圖1A)，72 h左右可見(jiàn)明顯的β溶血環(huán)(圖1B)；革蘭氏染色后顯微鏡檢為紅色、桿狀細(xì)菌(圖1C)。

A—5%羊血培養(yǎng)基中菌落形態(tài)(24 h，未發(fā)生溶血)；B—5%羊血培養(yǎng)基中菌落形態(tài)(72 h，β溶血)；C—革蘭氏染色顯微觀察。A—colony morphology cultured with 5% sheep blood plate, no hemolysis occurred after 24 h; B—colony morphology cultured in 5% sheep blood plate in 72 h with β hemolysis; C—observation with microscope.圖1 分離株BHAS-1的菌落形態(tài)及革蘭氏染色形態(tài)Fig.1 Colony morphology and micro-morphology of stain in strains BHAS-1

2.1.2 生理生化反應(yīng) 該菌株在6.5%的NaCl中不能生長(zhǎng)，無(wú)運(yùn)動(dòng)性，氧化酶反應(yīng)、VP反應(yīng)(Voges Proskauer,VP)、甲基紅反應(yīng)呈陽(yáng)性，不產(chǎn)生吲哚，不能利用鳥(niǎo)氨酸、賴氨酸脫羧，精氨酸雙水解呈陽(yáng)性，不能利用苯丙氨酸脫氨，可以利用葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、鼠李糖、山梨糖、蜜二糖、蔗糖和木糖產(chǎn)酸，具β-半乳糖苷酶活性，可以還原硝酸鹽，不能利用甘露糖、阿拉伯糖、阿拉伯醇、肌醇、枸櫞酸和苦杏仁苷，不能水解七葉靈和尿素。該菌株與殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種、殺鮭亞種和無(wú)色亞種的部分生理生化指標(biāo)見(jiàn)表2。

表2 BHAS-1的生理生化特性Tab.2 Physiological biochemical characteristics of BHAS-1

2.2 分子特征鑒定

擴(kuò)增菌株BHAS-1的16S rRNA、gyrB和vapA基因，分別獲得1 452、1 073、1 652 bp的序列。

在線BLAST比對(duì)結(jié)果顯示：BHAS-1的16S rRNA序列與A.salmonicidasubsp.salmonidaATCC 33658株及A.salmonicidasubsp.masoucidaNBRC 13784株的同源性較高，一致性分別為99.84%和99.65%；BHAS-1的gyrB序列與A.salmonicidasubsp.masoucidaRFAS1株及A.salmonicidasubsp.salmonidaSL1株的同源性較高，一致性分別為99.62%和99.53%；BHAS-1的vapA序列與A.salmonicidasubsp.masoucidaRZ6S-1株同源性最高，一致性為99.63%，與其他亞種一致性均低于99%。分別基于殺鮭氣單胞菌不同亞種、溫和氣單胞菌A.sobria、中間氣單胞菌A.media、嗜水氣單胞菌A.hydrophila等菌株的16S rRNA、gyrB、vapA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示，在16S rRNA和gyrB系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，BHAS-1與殺鮭氣單胞菌不同亞種聚為一支，而在vapA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，該菌株與殺日本鮭亞種單獨(dú)聚為一支，而殺鮭亞種則另外聚為一支(圖2)。

圖2 基于16S rRNA、gyrB和vapA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strains BHAS-1 based on 16S rRNA,gyrB and vapA genes sequence

2.3 人工回歸感染試驗(yàn)

人工感染2 d后，部分大菱鲆出現(xiàn)體表及鰭間紅斑潰瘍、腹部膨大和肛門(mén)紅腫等癥狀，解剖可見(jiàn)部分病魚(yú)腹水、肝充血、腸腫脹、脾腫大和腎壞死且內(nèi)有乳白色膿液等癥狀，與自然感染發(fā)病個(gè)體的癥狀相似，發(fā)病個(gè)體典型癥狀見(jiàn)圖3。最高濃度組注射后第3天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，死亡高峰在第5～7天，第9天時(shí)全部死亡；次高濃度組第4天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，第14天時(shí)累計(jì)死亡率為90%，對(duì)照組無(wú)死亡，各濃度組累計(jì)死亡情況詳見(jiàn)圖4。根據(jù)各濃度組死亡情況，采用改良寇氏法計(jì)算LD50為1.62×108CFU/mL。從人工感染發(fā)病魚(yú)體再次分離病原菌，可得到與BHAS-1形態(tài)、生理生化結(jié)果一致的菌株，因此，認(rèn)為分離株BHAS-1是引起大菱鲆上述癥狀的致病菌。

用線支撐連接其墻板頂部、框架梁，把已經(jīng)預(yù)留好的U型插口，選擇鋼筋從上部?jī)?nèi)側(cè)插入，同時(shí)連接好鋼筋和梁，選擇現(xiàn)澆混凝土。架起梁主筋，以柱箍筋為支撐，并且套住已經(jīng)掰開(kāi)的箍筋，依據(jù)自下而上的方式。此方式操作方便快捷、施工簡(jiǎn)單，可以確保構(gòu)件滿足抗震需求，上端錨起到固定連接作用，下端只是用來(lái)限位連接。

A—鰭間紅斑潰瘍；B—腸腫脹；C—肛門(mén)紅腫；D—脾、腎腫大。A—body surface scabies; B—intestinal enlargement; C—red and swollen anus; D—enlarged kidney and spleen.圖3 人工感染BHAS-1菌大菱鲆主要癥狀Fig.3 Main symptoms of challenged with BHAS-1 turbots

圖4 人工回歸感染累計(jì)死亡曲線Fig.4 Accumulative death number of turbot experimentally infected with strains BHAS-1

2.4 分離菌株的毒力基因型

經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)，BHAS-1攜帶的毒力基因片段長(zhǎng)度全部與目的片段長(zhǎng)度一致，毒力基因型為aer+-zot+-dna+-ser+-lip+-sp+-alt+-act+-ast+-epa+-fla+-ahyB+(圖5)。

M—DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～12分別為aer、zot、dna、ser、lip、sp、alt、act、ast、epa、fla、ahyB基因。M—DNA marker; 1-12，aer，zot，dna，ser，lip，sp，alt,act,ast,epa,fla and ahyB genes.圖5 分離株BHAS-1毒力基因的PCR檢測(cè)Fig.5 PCR products of the virulence genes from the isolated strains BHAS-1

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

菌株BHAS-1對(duì)10類(lèi)22種測(cè)試抗生素的敏感性存在差異，對(duì)頭孢曲松、頭孢拉定、頭孢哌酮、慶大霉素、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、四環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素、紅霉素、多黏菌素B和呋喃唑酮等7大類(lèi)13種抗生素類(lèi)藥物敏感，僅從測(cè)試抗生素來(lái)看，藥物敏感率為59.09%；對(duì)青霉素、卡那霉素、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、萬(wàn)古霉素、利福平和氯霉素等6類(lèi)7種抗生素耐藥，耐藥率為31.82%；對(duì)氨芐西林和鏈霉素2種抗生素中度敏感，中介率為9.09%(表3)。

表3 分離株BHAS-1對(duì)10類(lèi)22種抗生素的敏感性Tab.3 Sensitivity of strains BHAS-1 to 22 kinds of antimicrobial drugs

3 討論

3.1 殺鮭氣單胞菌亞種的鑒定

氣單胞菌是一類(lèi)水生革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于海水和淡水動(dòng)物及其環(huán)境中。其中，嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌是重要的水生動(dòng)物致病菌[21]。殺鮭氣單胞菌是已知的最古老的病原菌之一，自1984年作為一個(gè)雜交組從嗜水氣單胞菌復(fù)合物中分離以來(lái)，陸續(xù)有5個(gè)亞種被認(rèn)定，其中包括4個(gè)嗜冷亞種(殺鮭亞種、殺日本鮭亞種、無(wú)色亞種、史氏亞種)及1個(gè)嗜常溫亞種(溶果膠亞種)[22]。不同亞種的形態(tài)學(xué)和生理生化特性略有差異，根據(jù)色素產(chǎn)生能力、溶血性和能否發(fā)酵糖等亞種特性，通常將無(wú)性系種群——?dú)Ⅴq亞種稱為典型株(typical)，其他亞種及不符合亞種特征的菌株稱為非典型株(atypical)[23]。

根據(jù)Gulla等[24]提出的以發(fā)生溶血，在色氨酸酵母培養(yǎng)基中可產(chǎn)生棕色水溶性色素，產(chǎn)生吲哚反應(yīng)，水解明膠、七葉靈，可利用阿拉伯糖、甘露糖等作為殺鮭氣單胞菌典型株的判定標(biāo)準(zhǔn)，本研究中分離獲得的BHAS-1株不能同時(shí)具備上述特征，系非典型株。與典型株的高度同質(zhì)化不同，非典型株種類(lèi)較多且異質(zhì)化程度高，亞種特性差異較大[25]。本研究中，分離株的吲哚反應(yīng)、甘露糖發(fā)酵兩項(xiàng)結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果不同，推測(cè)出現(xiàn)偏差可能與宿主來(lái)源、菌株變異和環(huán)境適應(yīng)等因素有關(guān)。分離株生理生化指標(biāo)出現(xiàn)與模式株不同結(jié)果的報(bào)道較多[10-11,17]，僅依靠生理生化特性不能對(duì)殺鮭氣單胞菌非典型株進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，需要其他手段輔助。

不少學(xué)者嘗試通過(guò)擴(kuò)增各類(lèi)基因鑒別殺鮭氣單胞菌不同亞種。呂俊超等[11]應(yīng)用16S rRNA對(duì)分離的殺鮭氣單胞菌鑒定時(shí)，分離株與無(wú)色亞種聚成一個(gè)分支，確定分離株為殺鮭氣單胞菌無(wú)色亞種。但更多學(xué)者分離的菌株與多個(gè)亞種聚在一起[10,17,20]，無(wú)法通過(guò)該基因直接鑒定到亞種水平，需結(jié)合其他測(cè)試結(jié)果綜合判斷，gyrB[11]、ropD[10]、fstA[26]、dnaJ[27]和recA[27]等基因亦是如此。由此可見(jiàn)，上述基因在殺鮭氣單胞菌種內(nèi)高度保守，不能直接用于亞種鑒別，僅可作參考。本研究中得到與上述結(jié)論一致的結(jié)果，分離株BHAS-1在以16S rRNA和gyrB序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中與多個(gè)亞種聚為一支，只能得出與殺日本鮭亞種、殺鮭亞種和無(wú)色亞種最為接近的結(jié)論。近年來(lái)，應(yīng)用vapA對(duì)殺鮭氣單胞菌進(jìn)行亞種分類(lèi)的報(bào)道漸多，除溶果膠亞種外，其他亞種均具有明顯不同的A層結(jié)構(gòu)[24]，許氏平鲉[27]、大菱鲆[28]、鱖魚(yú)[29]來(lái)源的分離株均應(yīng)用該基因?qū)崿F(xiàn)了亞種水平的有效鑒別。本研究中，擴(kuò)增測(cè)序了分離株的vapA基因片段并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分離株與殺日本鮭亞種單獨(dú)聚為一支，通過(guò)該系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以判斷分離株系殺日本鮭亞種。vapA在殺鮭氣單胞菌種內(nèi)的高度變異，使得快速、準(zhǔn)確鑒別不同亞種或非典型株成為可能，且該基因表現(xiàn)出一定的宿主特異性[24]。

3.2 殺鮭氣單胞菌非典型株感染的臨床癥狀與感染途徑

有研究認(rèn)為，殺鮭氣單胞菌典型株一般以引起魚(yú)類(lèi)癤瘡為主要病征，而非典型株則以皮膚潰瘍或非典型癤瘡為主[30]，癥狀主要表現(xiàn)為鰓部、漿膜和鰭基部充血、敗血等[31]。在國(guó)外已有多種殺鮭氣單胞菌非典型株感染大菱鲆致病的報(bào)道[28,32]，國(guó)內(nèi)僅有無(wú)色亞種[1,11,15,33]感染報(bào)道。無(wú)色亞種感染大菱鲆表現(xiàn)為鰭基部、口周和鰓部出血，腹腔腹水，組織病理主要發(fā)生在鰓、皮膚、肌肉、腎臟、脾臟和心臟等組織，肝臟可檢出病原菌，但無(wú)明顯組織病變，腸無(wú)病變[32]。值得注意的是，該研究中，人工感染癥狀與自然感染并不完全一致，人工感染未觀察到自然感染發(fā)病大菱鲆出現(xiàn)的肝臟、腎臟充血[32]。中國(guó)報(bào)道的大菱鲆無(wú)色亞種感染則有皮下出血[11]、典型化膿癤瘡癥[15]和紅斑潰瘍癥[33]等不同表現(xiàn)。由此可見(jiàn)，殺鮭氣單胞菌非典型株致病臨床表現(xiàn)與病理特征存在差異，即使同一亞種感染亦有不同臨床癥狀，這可能與感染菌株毒力特征、宿主反應(yīng)等有關(guān)。本研究中,以自然感染發(fā)病大菱鲆為對(duì)象，從無(wú)典型癤瘡病癥的瀕死大菱鲆內(nèi)臟分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，經(jīng)生理生化和分子生物學(xué)鑒定，判定為殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種?；貧w感染試驗(yàn)中，急性死亡病例未出現(xiàn)明顯癤瘡，慢性感染死亡有體表、鰭間紅斑潰瘍的病例，病理特征主要表現(xiàn)為腸道腫脹、脾腫大和腎壞死。鑒于無(wú)色亞種感染的不同臨床表現(xiàn)，本研究中分離株感染出現(xiàn)的表觀特征是否是殺日本鮭亞種的主要感染癥狀，仍需更多數(shù)據(jù)支撐。

除此之外，不同感染方式下的臨床癥狀與半致死濃度均有差異。Han等[27]用殺日本鮭亞種人工感染許氏平鲉時(shí)發(fā)現(xiàn)，肌肉注射比腹腔注射癥狀更明顯且較嚴(yán)重，肌肉注射時(shí)注射部位出現(xiàn)明顯潰瘍，而腹腔注射部位僅發(fā)紅無(wú)潰瘍，腹腔注射的半致死濃度可高于肌肉注射10倍甚至100倍。浸泡感染所需濃度更高，且致死率低[34]，在確定腹腔注射半致死濃度為105CFU/mL時(shí)，用100倍濃度浸泡攻毒，并不能引起大菱鲆感染或死亡[32]。在本研究的人工感染預(yù)試驗(yàn)中，用1010CFU/mL的BHAS-1株浸泡大菱鲆24 h，受試動(dòng)物無(wú)發(fā)病和死亡，魚(yú)組織中不能分離到病原菌，用同樣濃度腹腔注射，24 h內(nèi)致死率為100%(數(shù)據(jù)未列出)，這說(shuō)明殺鮭氣單胞菌致病與感染途徑密切相關(guān)。研究表明，殺鮭氣單胞菌典型株可通過(guò)體表?yè)p傷、鰓和腸上皮細(xì)胞3條途徑入侵魚(yú)體[35]。Du等[34]研究殺日本鮭亞種對(duì)大西洋鮭感染的致病機(jī)理時(shí)得出類(lèi)似結(jié)論，認(rèn)為上述3條途徑亦是殺日本鮭亞種最有可能的感染途徑，致病菌通過(guò)鰓、皮膚、腸道進(jìn)入魚(yú)體定植后，通過(guò)血液循環(huán)或鰓、皮膚、腸上皮進(jìn)入脾、肝和腎等器官，引發(fā)全身感染。值得注意的是，該研究中，在人工感染后未發(fā)病存活的魚(yú)體內(nèi)仍能檢出細(xì)菌的存在[34]，提示在環(huán)境惡化時(shí)，致病菌可能會(huì)再次迅速繁殖，引起魚(yú)體感染或死亡。

3.3 殺鮭氣單胞菌的毒力基因與致病力

細(xì)菌的毒力因子是決定其致病力的重要因素之一，殺鮭氣單胞菌的毒力因子按功能可分為外毒素、胞外酶、黏附因子、抗藥基因、分泌系統(tǒng)、鐵攝取系統(tǒng)和群體效應(yīng)7大類(lèi)[17,23]。外毒素是某些細(xì)菌繁殖過(guò)程中分泌到菌體外的細(xì)菌毒素，常見(jiàn)的外毒素有氣溶素、溶血素和腸毒素等[36]。蛋白酶、脂肪酶和甘油磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶等蛋白類(lèi)胞外產(chǎn)物在殺鮭氣單胞菌致病性中也發(fā)揮著重要作用，這些酶能夠幫助細(xì)菌破壞并溶解宿主蛋白，導(dǎo)致宿主結(jié)構(gòu)損傷，一些酶之間還可能產(chǎn)生協(xié)同作用[37]。氣單胞菌的主要黏附因子分為菌毛黏附素和非菌毛黏附素兩類(lèi)，許多黏附因子的毒性由其外膜蛋白產(chǎn)生，如脂多糖、鞭毛蛋白和S層蛋白等[38]。本研究中，選取外毒素、黏附因子和胞外酶3類(lèi)毒力因子，檢測(cè)到分離株BHAS-1攜帶5種外毒素(alt、act、ast、aer、zot)、5種胞外酶(epa、lip、dna、ser、alyB)和2種黏附因子(fla和sp)。

鑒于毒力基因數(shù)量、類(lèi)型與致病力間的關(guān)系[39]，提示本研究中的分離株BHAS-1具有較強(qiáng)的致病力，但實(shí)際上BHAS-1的半致死濃度為1.62×108CFU/mL，并未表現(xiàn)出強(qiáng)毒株的致病能力。有研究證實(shí)，僅依據(jù)毒力因子的存在不足以預(yù)測(cè)殺鮭氣單胞菌在大菱鲆中的致病力，毒力基因不能作為決定毒力的唯一因素[40]，菌株致病能力除與毒力基因的種類(lèi)數(shù)量有關(guān)外，還可能與其他因素有關(guān)，如溫度。溫度是影響致病力的重要因素，Wang等[28]通過(guò)28 ℃下連續(xù)傳代培養(yǎng)，獲得殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種野生株R26S-1的衍生突變株R26S，衍生突變株LD50是野生株的10 000倍以上，毒力明顯減弱。通過(guò)基因組測(cè)序進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，衍生突變株毒力減弱可能與T3SS(type three secretion system)分泌系統(tǒng)相關(guān)質(zhì)粒缺失有關(guān)。該系統(tǒng)在殺鮭氣單胞菌等革蘭氏陰性菌的毒力發(fā)揮中起重要作用[41]，結(jié)構(gòu)蛋白在高溫應(yīng)激下發(fā)生堿基缺失或插入重排，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌種群中選擇衍生出弱毒株[42]。本研究中的分離純化均在28 ℃下進(jìn)行，分離株BHAS-1是否因連續(xù)高溫傳代導(dǎo)致了某些基因突變，進(jìn)而衍生為弱毒株，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

此外，對(duì)細(xì)菌毒力因子開(kāi)展深入研究對(duì)于細(xì)菌檢測(cè)及病害防控具有重要意義。Beaz-Hidalgo等[26]和Keeling等[22]分別依據(jù)殺鮭氣單胞菌fstA和vapA兩種特異性靶基因，建立了PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法；Chapela等[43]建立了殺鮭氣單胞菌、鰻弧菌V.anguillarum和海洋屈撓桿菌Tenacibaculummaritimum多重PCR，上述方法對(duì)殺鮭氣單胞菌的檢測(cè)最高靈敏度可達(dá)(5±0) fg，實(shí)現(xiàn)了基于保守毒力基因的病原菌快速檢測(cè)；缺少Ⅲ型分泌系統(tǒng)的弱毒株則可作為減毒活疫苗的候選[29]。

3.4 殺鮭氣單胞菌的藥物敏感性與病害防控策略

國(guó)內(nèi)曾有學(xué)者對(duì)不同來(lái)源的殺鮭氣單胞菌分離株進(jìn)行抗生素敏感性測(cè)試，結(jié)果略有差異。呂俊超等[11]曾對(duì)2007年分離獲得的大菱鲆源殺鮭氣單胞菌無(wú)色亞種db14進(jìn)行30種抗生素的耐藥測(cè)試，分離株對(duì)23種抗生素耐藥，對(duì)其中16種具有完全抗性；楊移斌等[20]對(duì)來(lái)源于斑點(diǎn)叉尾鮰的無(wú)色亞種ry01的藥敏結(jié)果顯示，該分離株對(duì)測(cè)試19種抗生素中的11種高度敏感，僅對(duì)磺胺異惡唑、利福平等7種藥物耐受；周紅霞等[10]測(cè)試來(lái)源于半滑舌鰨的殺鮭氣單胞菌對(duì)環(huán)丙沙星和恩諾沙星、諾氟沙星等8種藥物敏感，對(duì)利福平、氟苯尼考和硫酸新霉素等6種抗生素耐藥。盡管致病菌分離來(lái)源不同，但殺鮭氣單胞菌對(duì)喹諾酮類(lèi)和β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物表現(xiàn)較為敏感，對(duì)磺胺類(lèi)和利福霉素類(lèi)藥物普遍耐受。本研究中也得到一致的結(jié)論，分離株對(duì)22種抗生素耐藥表現(xiàn)不一致，整體耐藥率低于35%，對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)藥物較為敏感。在殺鮭氣單胞菌病防控中推薦交替使用鹽酸多西環(huán)素和恩諾沙星，謹(jǐn)防長(zhǎng)期單一用藥產(chǎn)生耐藥。

盡管對(duì)分離株的藥物敏感性試驗(yàn)可以較為直觀地確定敏感藥物，但對(duì)口服給藥來(lái)說(shuō)，藥物代謝受其他多種因素影響，具體劑量仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。De Ocenda等[44]研究了靜脈注射和口服兩種給藥方式下大菱鲆對(duì)氟苯尼考的藥代動(dòng)力學(xué)，提出針對(duì)殺鮭氣單胞菌感染的最佳給藥方案：口服，初始劑量為30 mg/kg，而后調(diào)整劑量為18 mg/kg并持續(xù)給藥6次。在疫苗研究應(yīng)用中，對(duì)大菱鲆接種鮭鱒魚(yú)商品化多價(jià)疫苗13周后,大菱鲆并未出現(xiàn)明顯免疫保護(hù)效果[32]。盡管在大菱鲆中該疫苗可以誘導(dǎo)殺鮭氣單胞菌細(xì)胞產(chǎn)生顯著的抗體反應(yīng)，但對(duì)胞外產(chǎn)物并無(wú)作用，病原菌仍可對(duì)養(yǎng)殖大菱鲆構(gòu)成潛在威脅，鮭鱒疫苗并不能對(duì)大菱鲆產(chǎn)生同樣的免疫保護(hù)作用，需針對(duì)不同對(duì)象開(kāi)發(fā)專用疫苗。Yan等[45]基于殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種研制了大菱鲆專用疫苗，12、24周時(shí)免疫保護(hù)率均可達(dá)84%以上，效果顯著，但該研究指出，此疫苗可能對(duì)其他亞種無(wú)效。經(jīng)過(guò)抗生素選擇，長(zhǎng)期單一用藥可能導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥，甚至多重耐藥，在生產(chǎn)中應(yīng)有針對(duì)性地選擇敏感藥物，注重交替使用，重點(diǎn)研發(fā)并應(yīng)用大菱鲆專用疫苗、中草藥類(lèi)免疫增強(qiáng)劑等綠色防治手段，從源頭減低病害發(fā)生率。

4 結(jié)論

1)本研究從患非典型疥瘡病大菱鲆脾臟獲得一株無(wú)運(yùn)動(dòng)能力、β溶血的殺鮭氣單胞菌非典型株。

2)在分子鑒定中，對(duì)比16S rRNA、gyrB、vapA基因擴(kuò)增、BLAST序列比對(duì)結(jié)果，表明應(yīng)用vapA基因可有效鑒別殺鮭氣單胞菌不同亞種，據(jù)此確定分離株為殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種。

3)在殺鮭氣單胞菌引起的非典型疥瘡病防治中，推薦交替使用水產(chǎn)用鹽酸多西環(huán)素粉和恩諾沙星粉，并分別執(zhí)行750度日和500度日的休藥期。