許榜田，方大樹，謝雨晴，楊曉蘭 4033 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院藥學(xué)部；40006 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性是化療失敗的主要原因，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(glutathione, GSH)系統(tǒng)是造成細(xì)胞毒性藥物作用失效的主要因素。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase, GST)是利用 GSH對各種內(nèi)源性和外源性非營養(yǎng)物質(zhì)(包括細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵二相代謝酶，當(dāng)其活性增強(qiáng)時(shí)藥物的代謝和排泄也隨之增加從而引發(fā)耐藥性。人胞質(zhì)GSTs有多種同工酶，分為π、μ(Mu)、α、ω、θ、ζ 6大類。GSTs已被證明在化療耐藥腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，其中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Mu(Glutathione-S-transferase Mu, GSTM)與卵巢癌、肺癌等耐藥密切相關(guān)。GSTs作為腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)藥物的作用靶點(diǎn)，其抑制劑可逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥而提高腫瘤化療藥物治療指數(shù)。

已報(bào)道多種GST抑制劑，如依他尼酸、肉桂醛、谷胱甘肽類似物等。HANSSON等發(fā)現(xiàn)在耐苯丙酸氮芥的人黑色素瘤細(xì)胞中GST水平升高，依他尼酸可以逆轉(zhuǎn)對苯丙酸氮芥的耐藥。黃玲萍等研究證實(shí)依他尼酸可通過抑制 GST 活性和β-catenin水平，發(fā)揮抑制肺癌A549細(xì)胞球增殖和干性，促進(jìn)其凋亡。依他尼酸與替塞派合用治療晚期腫瘤曾進(jìn)入Ⅰ期臨床，因其嚴(yán)重的耳毒性，并伴隨高血糖、低鈣和低鎂血癥等副作用，制約了其臨床應(yīng)用。GST是具有2個(gè)亞基的同二聚體結(jié)構(gòu)，每個(gè)亞基含有1個(gè)活性中心，由可結(jié)合還原型谷胱甘肽的G位點(diǎn)和結(jié)合疏水底物的H位點(diǎn)組成；2個(gè)H位點(diǎn)通過狹縫相連。GST的G位點(diǎn)只能結(jié)合GSH，H位點(diǎn)可結(jié)合多種疏水底物或配體。當(dāng)1個(gè)化合物與酶的1個(gè)活性中心相結(jié)合發(fā)揮抑制作用，稱為單價(jià)抑制劑，若同時(shí)與二聚體酶兩個(gè)活性中心結(jié)合發(fā)揮抑制作用，則為二價(jià)抑制劑；理論上二價(jià)抑制劑親和力比單價(jià)抑制劑高。同樣，當(dāng)一個(gè)疏水底物可與GSH 反應(yīng)且生成的產(chǎn)物能同時(shí)結(jié)合到G位點(diǎn)和H 位點(diǎn)時(shí)，產(chǎn)物的親和力比疏水底物的親和力高，此時(shí)疏水底物稱為潛抑制劑，而產(chǎn)物稱為抑制劑。因此，針對GST二聚體，設(shè)計(jì)潛抑制劑和二價(jià)抑制劑是提高抑制劑親和力的有效策略，同時(shí)也要盡可能降低化合物的細(xì)胞毒性。前期本課題組利用依他尼酸合成的GST抑制劑雙依他尼酰丁二胺、雙依他尼酸乙醇胺等，對GSTM的抑制常數(shù)可達(dá)到納摩爾(nmol/L)級。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，雙依他尼酰己二胺對耐順鉑卵巢癌有明顯逆轉(zhuǎn)作用，但對正常細(xì)胞有較大毒性，該毒性可能來自于依他尼酸的α,β-不飽和酮結(jié)構(gòu)及其2,3-二氯苯酚結(jié)構(gòu)。 因此，本研究以依他尼酸為先導(dǎo)化合物，保留或不保留α,β-不飽和酮結(jié)構(gòu)、去掉氯取代基，設(shè)計(jì)合成苯氧乙酸類系列化合物，通過表征其對GSTM的抑制能力，揭示其與GSTM之間的構(gòu)效關(guān)系，為腫瘤化療藥物增敏劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

苯氧乙酸、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)、N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(dicyclohexylcarbodiimide, DCC)、70%乙胺水溶液、1,4-丁二胺、丙酰氯、丙烯酰氯、無水三氯化鋁購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；還原型GSH購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene, CDNB)購自美國ICN Biomedicals公司。Esquire 6000型液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(德國，Bruker公司)；Avance DRX-500MHz型核磁譜儀(德國，Bruker公司)； UV-1600型紫外可見分光光度計(jì)(日本，島津公司)；Agilent Cary Eclipse型熒光分光光度計(jì)(美國，安捷倫公司)； Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國，安捷倫公司)。

1.2 苯氧乙酸類系列化合物的合成

按照圖1路線合成對丙烯酰苯氧乙酰乙胺(Ⅰ a)、對丙酰苯氧乙酰乙胺(Ⅰb)、N,N’-(4-(丙烯?；?苯氧乙?；?丁二胺(Ⅱa)、N,N’-(4-(丙?；?苯氧乙?；?丁二胺(Ⅱb)，對化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。使用高效液相色譜法測定化合物純度，色譜柱：Thermo Sycronis C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)；保護(hù)柱：Agilent Zorbax C18填料(12.5 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相A：純化水，流動(dòng)相B：甲醇；A∶B=10∶90；檢測波長：265 nm；柱溫：30 ℃。

圖1 苯氧乙酸系列化合物的合成路線

1.2.1 化合物Ⅰa、Ⅰb的合成 將丙烯?；窖跻宜?0.70 g, 3.3 mmol)和NHS(0.40 g, 3.4 mmol)溶于四氫呋喃(70 mL)，冰浴下滴加完含有DCC(0.75 g, 3.5 mmol)的四氫呋喃(10 mL)后室溫?cái)嚢柽^夜，濾去不溶物后緩慢鼓入過量的干燥乙胺氣體(乙胺水溶液加熱，過氫氧化鈉干燥管)，反應(yīng)4 h后真空旋干溶劑得白色固體。用30 mL二氯甲烷溶解后依次用5%碳酸氫鈉溶液(2次)、0.5 mol/L鹽酸溶液(2次)和飽和食鹽水洗滌，真空濃縮后得粗品0.56 g。用硅膠柱(乙酸乙酯∶石油醚=3∶2)純化，得到淺黃色固體Ⅰa 0.31 g (34%)，純度為94.5%。用對丙?；窖跻宜釣樵贤傻没衔铫馼 (41%)，純度為98.6%。化合物Ⅰa：H NMR (500 MHz, DMSO-

d

6) δ 8.19 (s, 1H), 8.01 (d,

J

=8.5 Hz, 2H), 7.40 (dd,

J

=16.9, 10.4 Hz, 1H), 7.08 (d,

J

=8.7 Hz, 2H), 6.31 (d,

J

=16.9 Hz, 1H), 5.92 (d,

J

=10.5 Hz, 1H), 4.57 (s, 2H), 3.15 (p,

J

=6.9 Hz, 3H), 1.03 (t,

J

=7.2 Hz, 4H);C NMR (125 MHz, DMSO-

d

6) δ 188.17, 166.86, 161.83, 132.18, 130.95, 130.16, 129.58, 114.94, 67.04, 33.35, 14.79. HRMS[M+H]: CHNO,理論分子量為234.1130, 實(shí)測分子量為234.1133?；衔?Ⅰ b：H NMR (400 MHz, DMSO-

d

6) δ 8.15 (s, 1H), 7.99-7.83(m, 2H), 7.10-6.88 (m, 2H), 4.52 (s, 2H), 3.12 (d,

J

=6.8 Hz, 2H), 2.95 (q,

J

=7.2 Hz, 2H), 1.02 (dt,

J

=10.2, 7.2 Hz, 6H);C NMR (100 MHz, DMSO-

d

6) δ 199.29, 167.18, 161.76, 130.43, 114.96, 67.34, 33.63, 31.26, 15.18, 8.69. HRMS[M+H]: CHNO, 理論分子量為236.128 7, 實(shí)測分子量為236.128 2。1.2.2 化合物Ⅱa、Ⅱb的合成 將對丙烯?；窖跻宜?0.70 g, 3.3 mmol)和NHS(0.40 g, 3.4 mmol)溶于四氫呋喃(10 mL)，冰浴下滴加完含有DCC(0.70 g, 3.4 mmol)的四氫呋喃(10 mL)后室溫?cái)嚢柽^夜，濾去不溶物后室溫下慢速逐滴加入已用四氫呋喃(5 mL) 稀釋的1,4-丁二胺(0.16 g, 1.8 mmol)，期間用薄層色譜板監(jiān)測。室溫反應(yīng)完后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得淺黃色固體。用二氯甲烷溶解此固體后依次用5%碳酸氫鈉水溶液、0.5 mol/L鹽酸水溶液和飽和食鹽水反復(fù)洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干，得到白色固體用硅膠柱(乙酸乙酯∶三乙胺=20∶1) 純化即得Ⅱa 0.43 g (28%)，純度為95.5%。用對丙?；窖跻宜釣樵贤傻没衔铫騜 (35%)，純度為97.2%?；衔铫騛：H NMR (500 MHz, DMSO-

d

6) δ 8.18 (t,

J

=5.9 Hz, 2H), 8.02 (d,

J

= 7.6 Hz, 4H), 7.41 (dd,

J

=16.9, 10.4 Hz, 2H), 7.08 (d,

J

=7.7 Hz, 4H), 6.31 (d,

J

=16.9 Hz, 2H), 5.92 (s, 2H), 4.59 (s, 4H), 3.13 (q,

J

=5.7 Hz, 4H), 1.42 (s, 4H);C NMR (125 MHz, DMSO-

d

6) δ 187.96, 166.87, 161.76, 132.10, 130.83, 130.05, 129.39, 114.82, 66.95, 38.02, 26.50. HRMS [M+H]: CHNO, 理論分子量為465.202 6, 實(shí)測分子量為465.201 4?；衔铫騜：H NMR (400 MHz, DMSO-

d

6) δ 8.15 (t,

J

=5.9 Hz, 2H), 8.00-7.83 (m, 4H), 7.11-6.94 (m, 4H), 4.53 (s, 4H), 3.09 (d,

J

=5.7 Hz, 4H), 2.95 (q,

J

=7.2 Hz, 4H), 1.03 (t,

J

=7.2 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-

d

6) δ 199.30, 167.38, 161.77, 130.43, 114.96, 67.32, 38.43, 31.27, 26.95, 8.70. HRMS [M+H]: CHNO,理論分子量為469.233 9, 實(shí)測分子量為469.234 5。

1.3 紫外光譜法表征苯氧乙酸系列化合物對GSTM的抑制能力

1.3.1 GSTM的表達(dá)純化及表征 根據(jù)之前的方法進(jìn)行GSTM的制備。用Bradford法測定蛋白含量。按照Habig法連續(xù)跟蹤GSTM催化顯色底物CDNB和GSH反應(yīng)測定活性。初速度法測定GSTM對底物CDNB和GSH的米氏常數(shù)(Michaelis constant,

K

)。

1.3.2 監(jiān)測化合物Ⅰa、Ⅱa與GSH反應(yīng)生成產(chǎn)物過程 在1.0 mL 反應(yīng)體系中，加入終濃度為 60.0 μmol/L的化合物Ⅱa和150.0 μmol/L的 GSH，每間隔1.5 min掃描200～500 nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜變化。在最大吸收峰272 nm波長下監(jiān)測60.0 μmol/L的Ⅱa與150.0 μmol/L的 GSH 分別同0、50.0、100.0 nmol/L 3個(gè)濃度GSTM作用下吸光度隨時(shí)間的變化。用Ⅰa與過量 GSH反應(yīng)，經(jīng)處理后得到GSH加合物，利用高分辨質(zhì)譜驗(yàn)證GSH加合物結(jié)構(gòu)。

1.3.3 初速度法表征苯氧乙酸類系列化合物對GSTM的半數(shù)抑制濃度(50% inhibiting concentration,

IC

) 直接測定苯氧乙酸類系列化合物

IC

：在1.2 mL的反應(yīng)體系中，先加入終濃度為4.0 nmol/L GSTM、1.0 mmol/L CDNB和不同濃度梯度的苯氧乙酸類化合物到反應(yīng)體系中，然后加入終濃度為1.0 mmol/L GSH啟動(dòng)反應(yīng)，測定在340 nm波長下紫外光吸收隨時(shí)間的變化曲線。苯氧乙酸類系列化合物與GSH預(yù)孵育測定產(chǎn)物

IC

：在1.2 mL的反應(yīng)體系中，將終濃度為4.0 nmol/L GSTM、1.0 mmol/L GSH和不同濃度梯度的苯氧乙酸類化合物孵育10 min，再加入終濃度為1.0 mmol/L CDNB到反應(yīng)體系中，測定340 nm波長下紫外光吸收隨時(shí)間的變化曲線。設(shè)不加抑制劑為對照組。根據(jù)初速度確定抑制率，公式為

IC

=(對照組-處理組)/(對照組) ×100%。1.3.4 測定苯氧乙酸類系列化合物對GSTM的抑制常數(shù)(inhibition constant,

K

) 初速度法測定在不同濃度抑制劑下GSTM對底物GSH、CDNB的表觀

K

。配制不同梯度濃度苯氧乙酸類系列化合物的N,N-二甲基亞酰胺儲備液，為減少有機(jī)試劑的干擾，應(yīng)使N,N-二甲基亞酰胺在反應(yīng)體系的終濃度<2%。在25 ℃條件下將GSTM、GSH和苯氧乙酸類化合物孵育10 min后加入CDNB啟動(dòng)反應(yīng)，延遲15 s后每10秒間隔記錄監(jiān)測340 nm吸收變化，共記錄2 min。固定GSH濃度為1.0 mmol/L，變化CDNB濃度(變化范圍是此抑制劑濃度作用下表觀

K

的0.4～2.5倍)，雙倒數(shù)作圖得到在不同抑制劑濃度下的

K

和最大反應(yīng)速率

V

。以抑制劑濃度為橫坐標(biāo)，分別以1/

K

、1/

V

為縱坐標(biāo)作圖，計(jì)算截距與斜率的比值即得抑制劑對GSTM的

K

和

K

；固定CDNB濃度為1.0 mmol/L，變化GSH濃度(變化范圍是此抑制劑濃度作用下表觀

K

的0.4～2.5倍)，雙倒數(shù)作圖后，利用上述方法判斷抑制劑相對于底物GSH對GSTM的

K

和

K

。通過

K

與

K

比值可判斷抑制劑對GSTM的抑制類型：當(dāng)比值<2時(shí)判定為反競爭性抑制劑，當(dāng)比值介于2～5時(shí)判定為混合性抑制劑，當(dāng)比值>5時(shí)判定為競爭性或非競爭性抑制劑。

1.4 熒光光譜法表征目標(biāo)化合物對GSTM的親和力

采用Agilent熒光分光光度計(jì)掃描發(fā)射光譜圖：在3.0 mL pH 7.4濃度為100 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，固定GSTM濃度為0.5 μmol/L，加入不同濃度梯度的Ⅱa，280 nm激發(fā)，掃描發(fā)射光譜圖，觀察熒光信號的變化，其中激發(fā)和發(fā)射狹縫/帶寬設(shè)置為10 nm，光電倍增管的電壓調(diào)節(jié)到“中”；在同樣狹縫、電壓條件下，280 nm激發(fā)測定340 nm熒光信號：固定GSTM濃度為0.5 μmol/L，分別加入不同濃度梯度的苯氧乙酸類系列化合物，測定各化合物的熒光滴定曲線，按靜態(tài)熒光猝滅模型公式Eq.1計(jì)算化合物與GSTM的結(jié)合常數(shù)

K

及解離常數(shù)(dissociation constant,

K

)。Eq.1推導(dǎo)如下：GST酶(E)與抑制劑(I)之間形成不發(fā)光的基態(tài)配合物可表示為E+IEI；配合物的結(jié)合常數(shù)

K

= [EI]/[E][I]，解離常數(shù)

K

=1/

K

；熒光強(qiáng)度和抑制劑濃度之間的關(guān)系：[E]=[E]+[EI]，(

F

-

F

)/

F

=([E]-[E])/[E]=[EI]/[E]=

K

[I]，Eq.1即

F

/

F

=1+

K

[I]。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)≥2次，數(shù)據(jù)以表示；采用GraphPad Prism 8.0非配對

t

檢驗(yàn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析，

P

<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苯氧乙酸類化合物與GSH反應(yīng)形成加合物的過程監(jiān)測

苯氧乙酸類化合物Ⅰa、Ⅱa均含有烯酮式結(jié)構(gòu)，可自發(fā)地與GSH的巰基發(fā)生麥克爾加成反應(yīng)。通過紫外分光光度法可監(jiān)測Ⅱa與GSH形成加合物的反應(yīng)過程。Ⅱa在286 nm處有最大吸收峰，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，最大吸收峰藍(lán)移至272 nm處，吸收增大 (圖2A)。雖然Ⅱa與GSH可自發(fā)反應(yīng)，但GSTM可催化該反應(yīng)。272 nm波長下自發(fā)反應(yīng)16 min內(nèi)的吸光度變化為，0.081在100 nmol/L GSTM催化下吸光度變化達(dá)到0.120(圖2B)。然而 Ⅱb與GSH孵育，未監(jiān)測到吸收光譜的變化。同樣，Ⅰa也可與GSH發(fā)生反應(yīng)，最終形成GSH加合物，HRMS[M+H]: CHNOS, 理論分子量為541.196 8,實(shí)測分子量為541.194 4 (圖2C)。

A：化合物Ⅱa(60 μmol/L)與GSH(150 μmol/L)反應(yīng)光譜變化圖；B：在272 nm波長下監(jiān)測化合物Ⅱa(60 μmol/L) 與GSH(150 μmol/L)被梯度濃度GSTM(0、50、100 nmol/L)催化的吸收變化；C：化合物Ⅰa與GSH形成加合物的高分辨質(zhì)譜圖圖2 化合物Ⅰa、Ⅱa與GSH形成加合物的反應(yīng)監(jiān)測

2.2 苯氧乙酸類系列化合物對GSTM的IC50值

在GSTM催化下，不同濃度化合物Ⅰa、Ⅱa與過量GSH 10 min內(nèi)可基本反應(yīng)完全(圖2B)。如圖3所示，經(jīng)GSH預(yù)孵育前后，測得Ⅱa的

IC

值分別為(0.21±0.03) μmol/L、(0.10±0.02) μmol/L，結(jié)果存在明顯的差異(

P

<0.05)，即初步說明GSH預(yù)孵育后生成的產(chǎn)物有較強(qiáng)的抑制作用，所以Ⅰa和Ⅱa是潛抑制劑。但因GSH也是GSTM的底物，可與Ⅰa和Ⅱa形成加合物，所以未孵育直接測定Ⅰa、Ⅱa自身對GSTM的

IC

值會被產(chǎn)物所干擾。為消除干擾，我們測定了不含烯酮式結(jié)構(gòu)的Ⅰb、Ⅱb對GSTM的

IC

值，結(jié)果如表1所示，在可溶解范圍內(nèi)Ⅰb、Ⅱb對GSTM無明顯抑制作用。

表1 苯氧乙酸系列化合物對GSTM的表征

半數(shù)抑制濃度IC50(μmol/L)抑制常數(shù)Ki(μmol/L)化合物解離常數(shù)Kd(μmol/L)未孵育直接測定GSH預(yù)孵育Kik(GSH)Kik(CDNB)Ⅰa161±1567±6a19.9±1.69.1±0.741.5±1.8eⅡa0.21±0.030.10±0.02b0.063±0.005c0.079±0.006d18.0±0.9f,gⅠb>500>500>500>50038.9±1.7Ⅱb>500>500>500>50019.5±1.0hCDNB////67.6±2.9

a: <0.05，與Ⅰa的未孵育直接測定值比較; b: <0.05，與Ⅱa的未孵育直接測定值比較； c: <0.05，與Ⅰa的比較; d: <0.05，與Ⅰa的比較; e: >0.05，與Ⅰb的比較; f: >0.05，與 Ⅱ b 的比較 ; g: <0.05，與Ⅰa的比較; h: <0.05，與Ⅰb的比較

圖3 化合物Ⅱa與GSH孵育前后對GSTM半抑制濃度比較

2.3 苯氧乙酸類系列化合物對GSTM的Ki值

由于Ⅰa、Ⅱa是具有烯醇式結(jié)構(gòu)的潛抑制劑，與GSH形成加合物之后才具有更強(qiáng)抑制作用，因此在測定抑制常數(shù)時(shí)采用了將Ⅰa、Ⅱa與GSH、GSTM預(yù)孵育10 min再加入CDNB啟動(dòng)反應(yīng)的方法。如圖4所示，固定CDNB濃度、改變GSH濃度時(shí)，Ⅰ a對GSTM的

K

和

K

分別為(19.9±1.6) μmol/L和超過150 μmol/L，

K

/

K

值>5，相對于GSH為競爭性抑制劑；Ⅱa對GSTM的

K

和

K

分別為(0.063±0.005) μmol/L和(0.028±0.002) μmol/L，

K

/

K

值介于2～5，相對于GSH為混合性抑制劑。固定GSH濃度、改變CDNB濃度時(shí)，Ⅰ a 對GSTM的

K

和

K

分別為(9.1±0.7) μmol/L和超過100 μmol/L，

K

/

K

值>5，相對CDNB為競爭性抑制劑；Ⅱa對GSTM的

K

和

K

分別為(0.079±0.006) μmol/L和超過0.5 μmol/L，

K

/

K

值>5，相對CDNB為競爭性抑制劑?？梢姠騛較Ⅰa的

K

值低(

P

<0.05)。同法測定了Ⅰb、Ⅱb對GSTM的抑制常數(shù)，在化合物可溶解范圍內(nèi)無法測出。

A：固定CDNB濃度，測定Ⅰa相對GSH的Ki；B：固定GSH濃度，測定Ⅰa相對CDNB的Ki；C：固定CDNB濃度，測定Ⅱa相對GSH的Ki；D：固定GSH濃度，測定Ⅱa相對CDNB的Ki圖4 雙倒數(shù)作圖法測定化合物Ⅰa、Ⅱa對GSTM的Ki值

2.4 苯氧乙酸類系列化合物對GSTM的Kd值

當(dāng)化合物結(jié)合到GSTM的活性位點(diǎn)，可靜態(tài)猝滅GSTM中色氨酸在340 nm熒光。如圖5A所示，在280 nm激發(fā)下，隨著Ⅱa濃度增加，GSTM的熒光響應(yīng)曲線逐漸下降。為考察各化合物對GSTM的熒光猝滅能力，我們檢測了Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb、CDNB、GSH對GSTM在340 nm的猝滅作用。根據(jù)結(jié)果(圖5B)可知，除GSH無猝滅作用外，其他疏水化合物均能不同程度猝滅GSTM的熒光。對各化合物的熒光滴定曲線按靜態(tài)熒光猝滅模型公式Eq.1作圖(圖5C)，可得各化合物對GSTM的解離常數(shù)

K

。計(jì)算可知Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb、CDNB的

K

分別為(41.5±1.8) μmol/L、(38.9±1.7) μmol/L、(18.0±0.9) μmol/L、(19.5±1.0) μmol/L、(67.6±2.9) μmol/L?？梢姠馻與Ⅰb、Ⅱa與Ⅱb之間的

K

無顯著差異(

P

>0.05)，而Ⅱa較Ⅰa、Ⅱb較Ⅰb的

K

低(

P

<0.05)。

A：在280 nm的激發(fā)光下掃描不同濃度梯度的Ⅱa對GSTM的熒光發(fā)射光譜圖；B：在280 nm激發(fā)光下滴定各化合物對GSTM在340 nm發(fā)射光的熒光淬滅信號；C：以化合物濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)0/F為縱坐標(biāo)作圖，按Eq.1公式計(jì)算各化合物的Kd圖5 熒光光譜法表征化合物與GSTM的親和力

3 討論

以依他尼酸為先導(dǎo)化合物、以苯氧乙酸為基本母核設(shè)計(jì)合成了4個(gè)化合物，主要考察丙烯酮結(jié)構(gòu)對GSTM抑制作用的影響，以及單價(jià)抑制劑與二價(jià)抑制劑對酶抑制能力的差異。Ⅰa、Ⅱa結(jié)構(gòu)中的α,β-不飽和酮可與GSH自發(fā)地發(fā)生親電加成反應(yīng)，并可被GSTM催化。事實(shí)上，依他尼酸也可在GSTM催化下與GSH發(fā)生親電加成反應(yīng)，但難以自發(fā)發(fā)生反應(yīng)。說明經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造后，Ⅰa、Ⅱa的丙烯酮結(jié)構(gòu)受到的空間位阻較依他尼酸的更低，使得Ⅰa、Ⅱa的丙烯酮結(jié)構(gòu)更加活潑。

我們用紫外光譜法分別測定了化合物對GSTM的

IC

值和表觀抑制常數(shù)。數(shù)據(jù)顯示不同的加樣方法對

IC

值測定結(jié)果有顯著的影響：將Ⅰa、Ⅱa與GSTM、GSH預(yù)孵后測得的

IC

值更低，表明Ⅰa、Ⅱa為潛抑制劑，與GSH形成加合物具有更強(qiáng)的抑制作用；而Ⅰb、Ⅱb在可溶解范圍內(nèi)對GSTM均無抑制作用，驗(yàn)證了丙烯酮結(jié)構(gòu)是必須官能團(tuán)。與GSH預(yù)孵育后Ⅱa的

IC

值較Ⅰa的

IC

值低約670倍，且表觀抑制常數(shù)低三個(gè)數(shù)量級。所以二價(jià)抑制劑比單價(jià)抑制劑的抑制作用更強(qiáng)。在GST的活性中心，G位點(diǎn)對 GSH親和力通常比 H 位點(diǎn)對其常見的疏水底物的親和力更強(qiáng)，使?jié)撘种苿┥僧a(chǎn)物親和力大大提高；二價(jià)抑制劑可結(jié)合兩個(gè)活性位點(diǎn)使親和力進(jìn)一步提高。

為了進(jìn)一步解釋Ⅰa 和Ⅱa 的親和力和抑制作用差異， 參照文獻(xiàn)[24]，采用Discovery Studio 2019將靶蛋白GSTM(PDB：1XW5) 分別對Ⅰa 和Ⅱa 進(jìn)行對接發(fā)現(xiàn)，Ⅱa 容易達(dá)到經(jīng)二聚體狹縫與兩個(gè)活性中心的H位點(diǎn)的結(jié)合狀態(tài)(圖6A)，而Ⅰa則在一個(gè)亞基的H 位點(diǎn)但結(jié)合取向可變(圖6B)。當(dāng)生成產(chǎn)物后，可以明顯地看到Ⅰa和Ⅱa 都存在GS 部分與G 位點(diǎn)的錨定結(jié)合，且Ⅱa 是兩個(gè)活性中心的結(jié)合(圖6C、D)。

A：對接在GSTM中的 Ⅱ a 的結(jié)合模式；B：對接在GSTM中的Ⅰa 的結(jié)合模式；C：對接在GSTM中的 Ⅱ a 與GSH加合產(chǎn)物的結(jié)合模式；D：對接在GSTM中的Ⅰa 與GSH加合產(chǎn)物的結(jié)合模式圖6 Ⅰa、Ⅱa 及其GSH加合物與GSTM結(jié)合模式對比

由于紫外光譜法表征化合物抑制性能需要依賴底物，而GSTM的雙底物模式和化合物的產(chǎn)物型抑制特點(diǎn)大大增加了紫外光譜法的表征難度和效率。因此，我們使用了不依賴底物的熒光光譜法對化合物進(jìn)行表征。結(jié)果顯示，結(jié)構(gòu)類似的Ⅰa、Ⅰb以及Ⅱa、Ⅱb表現(xiàn)出對GSTM無差異的解離常數(shù)；二價(jià)的Ⅱa、Ⅱb較單價(jià)的Ⅰa、Ⅰb具有更低的解離常數(shù)。說明將丙烯酮結(jié)構(gòu)取代為丙酮結(jié)構(gòu)之后并不影響化合物與GSTM的親和力，而對稱的二價(jià)結(jié)構(gòu)可以使親和力明顯提高。該方法可不依賴酶底物快速測定化合物對酶的親和力，為潛抑制劑的親和力表征提供方法。

本研究結(jié)果表明，針對GSTM的苯氧乙酸類二價(jià)潛抑制劑可經(jīng)與GSH 生成產(chǎn)物有效提高親和力。然而該類抑制劑是否較依他尼酸類抑制劑具有更低的細(xì)胞毒性還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。