張人子，李 晟，王導(dǎo)新 重慶 400010，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是急性肺損傷最嚴(yán)重的階段，其平均病死率為 30%～40%。在ARDS的晚期，持續(xù)性肺泡損傷、修復(fù)、重建和過度的細(xì)胞外基質(zhì)沉積導(dǎo)致肺纖維化。有研究表明肺纖維化的程度與ARDS的預(yù)后和死亡率密切相關(guān)。此外，內(nèi)皮功能障礙導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，EC)損傷和血管生成受損，也被認(rèn)為是 ARDS 發(fā)病機制中的重要致病機制。然而，導(dǎo)致纖維增生性 ARDS 的因素以及這種病理反應(yīng)的潛在機制仍不清楚。內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 ( endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT) 是成纖維細(xì)胞的來源之一。 內(nèi)皮細(xì)胞在此過程中其細(xì)胞骨架開始變化，細(xì)胞間黏附力下降，最終轉(zhuǎn)化為梭型的成纖維細(xì)胞。 抑制EndMT、 恢復(fù)EC功能，可有效緩解ARDS的發(fā)病進程。

隱丹參酮(cryptotanshinone，CTS)是從丹參根中提取的一種脂溶性化合物，不僅具有抗氧化、抗炎癥和抗纖維化等多種藥理活性，還能逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程。EndMT早于EMT發(fā)生，我們推測CTS可以改善ARDS患者的早期肺纖維化。因此，本研究通過氣管滴注脂多糖( lipopolysaccharide，LPS)制作ARDS小鼠模型，以驗證CTS是否可通過EndMT減輕ARDS小鼠的早期肺纖維化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及ARDS模型構(gòu)建

8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～25 g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。將C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機分為①正常組(Control)：腹腔注射等量無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)；②模型組(LPS)：氣管滴注LPS(5 mg/kg)造模，7 d后處死小鼠；③處理組(CTS+LPS)：LPS建模前腹腔注射CTS(60 mg/kg)預(yù)處理3 d，建模完成后連續(xù)予以7 d；④CTS組(CTS)：腹腔注射等量CTS。每天記錄1次每只小鼠的體質(zhì)量及生存情況。末次給藥24 h后處死小鼠，結(jié)束實驗，并收集支氣管肺泡灌洗液 ( bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和肺組織以備后續(xù)實驗使用。

1.2 主要試劑

隱丹參酮購于美國Med Chem Express公司；脂多糖、BCA試劑盒、羥脯氨酸試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、極超敏 ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫(GAPDH)抗體購于南京巴傲得生物科技有限公司；兔抗CD31、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)購于美國Cell Signaling Technology公司；兔抗VE-cadherin購于美國Invitrogen公司。

1.3 肺組織病理學(xué)檢查

末次給藥24 h后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠，充分暴露胸腔，取各組右肺組織，利用4%多聚甲醛固定24 h后包埋在石蠟中，肺組織切片后用HE和Masson染色，顯微鏡下觀察肺組織的病理變化。參照肺損傷評分和肺纖維化評分標(biāo)準(zhǔn)進行評分。

1.4 肺組織濕/干質(zhì)量(wet-to-dry，W/D) 比值

取小鼠右肺稱取濕質(zhì)量，然后將肺組織置于干燥箱中，60 ℃干燥 48 h，稱取干質(zhì)量。根據(jù)前后稱量結(jié)果計算肺組織的W/D。

1.5 BALF中總細(xì)胞和蛋白濃度以及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子檢測

經(jīng)氣管注射1 mL冰磷酸鹽緩沖液(PBS)灌洗左肺，30 s 后緩慢回抽，重復(fù)3次，將收集到的 BALF，在4 ℃下以1 500 r/min離心15 min，留取BALF離心后的沉淀用于總細(xì)胞計數(shù)，上清分別應(yīng)用BCA試劑盒檢測蛋白濃度和ELISA試劑盒測定BALF上清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、TGF-β1 的含量。

1.6 羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量測定

將肺組織稱重并盡量剪碎以便消化。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，讀取各孔560 nm波長處光密度值

D

(560)，并通過公式計算出待測樣品的含量。

1.7 免疫組化(immunocytochemistry，IHC)檢測EndMT表達

取肺組織石蠟切片，脫蠟、水化、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化酶，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育50 min，顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察，用 Image J軟件分析蛋白的相對表達量。

1.8 Western blot檢測EndMT標(biāo)志蛋白表達

稱取適量肺組織制備成組織勻漿，置于冰冷組織裂解液，在4℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液。采用BCA進行蛋白定量，調(diào)整蛋白濃度。配置濃縮膠和分離膠，電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，封閉 1 h。一抗4 ℃孵育過夜，二抗常溫孵育1 h。超敏發(fā)光液顯影曝光，Image J 軟件系統(tǒng)對蛋白條帶灰度值進行分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 9.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以表示，各組間的比較采用單因素方差分析，樣本均數(shù)間的比較采用LSD-

t

檢驗。

P

<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTS對ARDS小鼠生存曲線及體質(zhì)量變化的影響

與正常組比較，模型組小鼠的生存率和體質(zhì)量均在氣管滴注LPS后均明顯下降(

P

<0.05)；與模型組比較，處理組小鼠的生存率和體質(zhì)量均明顯上升(

P

<0.05)。見圖1。

a：P<0.05，與正常組比較；b： P<0.05，與模型組比較A：CTS對ARDS小鼠生存率影響；B：CTS對ARDS小鼠體質(zhì)量影響圖1 小鼠7 d生存率和體質(zhì)量分析

2.2 CTS對ARDS小鼠肺損傷的影響

正常組小鼠肺組織保持正常組織結(jié)構(gòu)，未見明確炎癥細(xì)胞浸潤。與正常組比較，模型組小鼠肺組織大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)廣泛破壞，肺泡毛細(xì)血管充血擴張，小鼠肺損傷評分、肺組織 W/D、BALF中細(xì)胞總數(shù)及蛋白濃度明顯升高(

P

<0.05)；與模型組比較，處理組小鼠的肺組織病變較模型組明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，炎癥細(xì)胞浸潤減少，小鼠肺損傷評分、肺組織 W/D、BALF中細(xì)胞總數(shù)及蛋白濃度明顯下降(

P

<0.05)。見圖2。

a： P<0.05，與正常組比較；b： P<0.05，與模型組比較;1：正常組；2：模型組；3：處理組；4：CTS組A：HE染色觀察肺組織病理學(xué)改變；B：肺損傷評分；C：肺組織W/D比值；D：BALF中蛋白濃度；E：BALF中總細(xì)胞計數(shù)圖2 CTS對ARDS小鼠肺損傷的影響

2.3 CTS對ARDS小鼠BALF中炎性細(xì)胞因子和促纖維化細(xì)胞因子的影響

與正常組比較，模型組小鼠BALF中促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)和促纖維化因子TGF-β1分泌量顯著升高，抗炎因子(IL-10)分泌量顯著減少(

P

<0.05)；與模型組比較，處理組可明顯降低促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)和促纖維化因子(TGF-β1)，增加抗炎因子(IL-10)的分泌量(

P

<0.05)。見圖3。

a： P<0.05，與正常組比較；b： P<0.05，與模型組比較;1：正常組；2：模型組；3：處理組；4：CTS組A：TGF-β1水平；B：TNF-α水平；C：IL-1β水平；D：IL-6水平；E：IL-10水平圖3 CTS對ARDS小鼠BALF中炎癥因子和促纖維化因子的影響

2.4 CTS對ARDS小鼠早期肺纖維化的影響

正常組小鼠肺組織保持正常組織結(jié)構(gòu)，未見纖維組織增生性改變。模型組可見纖維組織增生；處理組小鼠的肺組織未見纖維組織增生。見圖4A。

與正常組比較，模型組小鼠纖維化嚴(yán)重程度評分顯著升高(

P

<0.05)；與模型組比較，處理組纖維化嚴(yán)重程度評分顯著降低(

P

<0.05)。見圖4B。

2.5 CTS對ARDS小鼠肺組織HYP含量的影響

與正常組比較，模型組肺組織HYP 水平均顯著升高(

P

<0.05)；與模型組比較，處理組HYP 水平均明顯下降(

P

<0.05)。見圖4C。

2.6 CTS對ARDS小鼠肺組織中CD31、α-SMA蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠肺組織中CD31陽性表達顯著減弱，α-SMA陽性表達顯著增強(

P

<0.05)；與模型組比較，處理組CD31陽性表達出現(xiàn)上調(diào)，α-SMA陽性表達出現(xiàn)下調(diào)(

P

<0.05)，見圖5。

圖5 IHC觀察CTS對小鼠肺組織CD31和α-SMA表達的影響

2.7 CTS對ARDS小鼠肺組織中VE-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠肺組織中Vimentin、α-SMA蛋白水平均顯著升高，VE-cadherin蛋白水平顯著降低(

P

<0.05)；與模型組比較，處理組均可明顯抑制Vimentin、α-SMA蛋白水平的表達和減緩VE-cadherin蛋白水平的表達(

P

<0.05)，見圖6。

a： P<0.05，與正常組比較；b： P<0.05，與 LPS 模型組比較A：各組小鼠肺組織Western blot檢測結(jié)果；B：VE-cadherin蛋白相對表達量；C：Vimentin蛋白相對表達量；D：α-SMA蛋白相對表達量圖6 隱丹參酮對內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物相關(guān)蛋白的影響

3 討論

2019冠狀病毒疾病(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)在全球范圍內(nèi)相繼爆發(fā)，其感染人數(shù)不斷上升，其中重癥患者最終發(fā)展為ARDS。 盡管許多患者在ARDS的急性病程中幸存下來，但仍有部分患者死于進行性肺纖維化。 此外，ARDS患者早期出現(xiàn)肺纖維增生性改變已成為與患者預(yù)后不良、高死亡率和患者長期生命質(zhì)量相關(guān)的關(guān)鍵因素。然而，目前的研究中仍缺乏特異性治療來減少ARDS肺部炎癥反應(yīng)和降低肺部病理性纖維化。

丹參及其有效成分在治療間質(zhì)性肺病方面已被廣泛研究。例如，丹參酮ⅡA可減少小鼠因脂多糖誘導(dǎo)引起的炎癥反應(yīng)和膠原沉積。除此之外，丹酚酸B可阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖和肌成纖維細(xì)胞分化。但丹參及其有效成分是否在ARDS中發(fā)揮治療作用，尚未見報道。CTS是從丹參根中提取的一種脂溶性化合物，在心血管疾病尤其是動脈粥樣硬化和心臟纖維化中具有廣泛的治療作用。在本研究中，我們成功地在小鼠體內(nèi)構(gòu)建了LPS誘導(dǎo)的ARDS模型，在LPS誘導(dǎo)后，肺組織充滿大量炎癥細(xì)胞，纖維組織增生，W/D重量比、BALF中蛋白質(zhì)濃度和總細(xì)胞計數(shù)以及促炎因子分泌增加，抗炎因子分泌減少。本研究結(jié)果中促纖維化因子的增加和各實驗組羥脯氨酸(HYP)濃度的顯著差異也表明LPS誘導(dǎo)小鼠ARDS后出現(xiàn)早期肺纖維化。我們的研究結(jié)果進一步表明，CTS可以通過調(diào)節(jié)肺損傷、炎癥反應(yīng)、早期肺纖維化、羥脯氨酸(HYP)含量來改善LPS誘導(dǎo)的ARDS。因此，CTS 對ARDS小鼠的炎癥反應(yīng)和早期肺纖維化具有一定的保護性作用。

ARDS的致病特點是內(nèi)皮異常激活和損傷。在ARDS的早期，肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞首先受到影響。ARDS的重要發(fā)病機制是內(nèi)皮受損導(dǎo)致內(nèi)皮修復(fù)和血管生成功能障礙。新近研究認(rèn)為ARDS急性病程中肺內(nèi)皮細(xì)胞的抵抗力低于肺上皮細(xì)胞，并且肺內(nèi)皮細(xì)胞是成纖維細(xì)胞的主要來源之一。因此，我們認(rèn)為在ARDS早期進行修復(fù)肺血管內(nèi)皮功能障礙的治療對患者而言更有價值。本研究結(jié)果表明，經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，小鼠內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物(CD31、VE-cadherin)水平顯著降低，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(Vimentin、α-SMA)水平升高；而CTS的治療有效改善了這一過程，提示CTS可以通過抑制EndMT過程以減輕ARDS后的肺纖維化。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)ARDS小鼠的體質(zhì)量曲線和生存率在CTS治療后有了顯著的上升，其次CTS可以通過抑制EndMT過程減緩肺纖維化的進展，并顯著降低ARDS小鼠早期的死亡率。這些發(fā)現(xiàn)可能為治療 ARDS 和預(yù)防ARDS后早期肺纖維化提供新的治療方法。