何忻宜，明 葉，譚 浩，趙振興，敬 勁，孟雪歡，李 想，鄭雷蕾 401145 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，口腔疾病與生物學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市高校市級口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

高血糖是許多疾病的危險因素，包括缺血性心血管損傷、腎臟疾病和敗血癥，同時也被視為糖尿病患者骨改建不良的主要危險因素。骨改建過程一般是指在力的作用下發(fā)生的一個成破骨動態(tài)循環(huán)過程，包括了骨吸收和骨形成，而成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在其中發(fā)揮主要調(diào)節(jié)作用。正常情況下，成骨與破骨的動態(tài)平衡是正畸治療中牙齒發(fā)生移位的生理基礎(chǔ)。在高糖環(huán)境下，巨噬細(xì)胞作為先天免疫細(xì)胞，首先被激活并到達(dá)骨改建區(qū)發(fā)揮免疫作用，分泌大量炎癥因子。根據(jù)活化狀態(tài)、細(xì)胞表型及功能差異，巨噬細(xì)胞分為M1和M2型巨噬細(xì)胞，M1型巨噬細(xì)胞在炎癥早期浸潤，其釋放的炎性介質(zhì)或細(xì)胞因子可發(fā)揮破骨細(xì)胞分化的第二信使作用；M2型巨噬細(xì)胞則在減輕炎癥、減弱抗原呈遞、促進(jìn)組織愈合等過程中發(fā)揮重要功能，同時釋放如BMP-2、TGF-β和IGF-1等細(xì)胞因子促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。在骨改建過程中，成骨細(xì)胞功能受到巨噬細(xì)胞的調(diào)控，當(dāng)成骨細(xì)胞發(fā)生功能障礙時，將導(dǎo)致成破骨狀態(tài)失衡，骨改建不良甚至失敗。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是導(dǎo)致成骨細(xì)胞功能障礙的原因。氧化應(yīng)激是指因?yàn)榛钚匝?reactive oxygen species， ROS)和活性氮(reactive nitrogen species， RNS)的產(chǎn)生與清除之間失衡而導(dǎo)致細(xì)胞器、蛋白、脂質(zhì)等受到氧化損傷。ROS是機(jī)體產(chǎn)生的誘導(dǎo)體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激的一組物質(zhì)，主要包括超氧陰離子過氧化氫(HO)和羥自由基(·HO)，在決定細(xì)胞命運(yùn)中發(fā)揮重要作用。目前對高糖環(huán)境下骨改建過程的研究較少，高糖環(huán)境對成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響及巨噬細(xì)胞在其中發(fā)揮的作用仍不清楚。因此，本研究將采用Transwell細(xì)胞間接共培養(yǎng)技術(shù)探究高糖環(huán)境下巨噬細(xì)胞對成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激、自噬及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1和小鼠單核巨噬細(xì)胞系Raw264.7來源于美國ATCC公司；胎牛血清(FBS)購自阿根廷Natcor公司；Transwell細(xì)胞小室購自美國Millipore公司；α-MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；ROS檢測試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；TRIzol Regent購自美國Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒購自美國Promega公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒購自上海雅酶生物科技有限公司；LC3 Rabbit mAb購自美國Cell Signalin Technology公司；SQSTM1/p62 Rabbit mAb購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將前成骨細(xì)胞MC3T3-E1和小鼠單核巨噬細(xì)胞Raw264.7分別置于含有10%胎牛血清和1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)MC3T3-E1增殖到密度為80%左右，用0.25%胰酶消化2 min后終止消化，并吹打、離心后去除上清，用3 mL α完全培養(yǎng)基重懸沉淀并以1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，Raw264.7吹打離心后去除上清，用3 mL α完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并以1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 高糖對Raw264.7細(xì)胞M1表面抗原標(biāo)志CD86表達(dá)的影響 將Raw264.7細(xì)胞分別培養(yǎng)于含葡萄糖濃度為25、30、35 mmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，其中5.5 mmol/L作為陰性對照。24 h后去除培養(yǎng)基并用PBS洗2次，用含3%FBS的PBS吹打并將細(xì)胞收集至15 mL離心管中，150×

g

離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，去除上清并用1 mL含3%FBS的PBS重懸細(xì)胞并計數(shù)，取1×10個細(xì)胞于1.5 mL EP管中，以500×

g

離心5 min，去除上清，每管加入100 μL含3%FBS和1%抗CD86-PE的PBS重懸細(xì)胞，避光，4 ℃搖床孵育30 min，每5 min重懸一次，孵育完成后500×

g

離心5 min去除上清，用含3%FBS的PBS清洗3次后并用篩網(wǎng)將細(xì)胞懸液過濾至流式細(xì)胞管，上機(jī)檢測，結(jié)果用FlowJo.v10軟件進(jìn)行作圖分析。1.2.3 不同葡萄糖濃度對Raw264.7細(xì)胞

TNF

-

α

、

IL

-6、

iNOS

、

NOX

2、

p

47

phox

mRNA表達(dá)的RT-qPCR檢測 將Raw264.7細(xì)胞分別培養(yǎng)于含葡萄糖濃度為25、30、35 mmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。24 h后采用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞的RNA，用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，以

GAPDH

作為內(nèi)參，采用2法分析目的基因表達(dá)水平。相關(guān)基因

TNF

-

α

、

IL

-6、

iNOS

、

NOX

2、

p

47

phox

的上下游引物序列來源于NCBI，引物序列使用生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

基因正義(5'→3')反義(3'→5')IL-6CTTCTTGGGACTGATGCTGGTGACAGGTCTGTTGGGAGTGGTATCCTCTNF-αGCGACGTGGAACTGGCAGAAGGCCACAAGCAGGAATGAGAAGAGGiNOSACTCAGCCAAGCCCTCACCTACTCCAATCTCTGCCTATCCGTCTCGNOX2GAAGACAACTGGACAGGAACCTCACAAATCCCGACTCTGGCATTCACACp47phoxGCGAAGAAGCCTGAGACATACCTGAACTCTTCTCGTAGTCAGCAATGGCGAPDHGGTTGTCTCCTGCGACTTCATGGTCCAGGGTTTCTTACTCC

1.2.4 不同葡萄糖濃度對Raw264.7細(xì)胞iNOS表達(dá)的蛋白檢測 去除培養(yǎng)基，將培養(yǎng)于25、30、35 mmol/L 葡萄糖濃度的Raw264.7細(xì)胞用冰冷的PBS清洗2遍，用含有PMSF的RIPA裂解細(xì)胞，進(jìn)行BCA蛋白定量檢測并按4∶1的比例加入5× Loading Buffer后100 ℃煮沸5 min。加入各組蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4 ℃孵育過夜，TBST清洗3遍后二抗常溫孵育2 h，TBST清洗3遍后采用ECL化學(xué)發(fā)光顯影液進(jìn)行顯影，通過Image J軟件進(jìn)行目的蛋白半定量分析。

1.2.5 細(xì)胞ROS檢測 細(xì)胞ROS含量用DCFH-DA法測定，將DCFH-DA探針加入不含血清的培養(yǎng)基中，達(dá)到終濃度為10 μmol/L，并以換液的方式加入至不同葡萄糖濃度培養(yǎng)的Raw264.7(25、30、35 mmol/L 葡萄糖濃度)或MC3T3-E1(5.5、35 mmol/L 葡萄糖濃度)細(xì)胞中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min后用不含血清的培養(yǎng)基清洗3次，每次5 min。通過熒光顯微鏡記錄熒光圖片。

1.2.6 高糖共培養(yǎng)體系的建立 采用Transwell間接共培養(yǎng)技術(shù)模擬細(xì)胞的旁分泌過程，即將兩種細(xì)胞分別接種于上室和下室，細(xì)胞之間不直接接觸，但仍可通過細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子等物質(zhì)進(jìn)行信息交流。本實(shí)驗(yàn)將Raw264.7細(xì)胞置于6孔板中細(xì)胞上室，MC3T3-E1細(xì)胞置于6孔板中細(xì)胞下室，采用含有35 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行間接共培養(yǎng)(圖1)，共培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為正常糖單獨(dú)培養(yǎng)組(5.5-Mono組)、高糖單獨(dú)培養(yǎng)組(35-Mono組)、高糖共培養(yǎng)組(35-Co組)3組。

圖1 Transwell間接共培養(yǎng)體系示意圖

1.2.7 高糖共培養(yǎng)下MC3T3-E1細(xì)胞透射電鏡檢測 去除Transwell細(xì)胞上室及Raw264.7細(xì)胞，將下室的MC3T3-E1細(xì)胞用PBS清洗后以0.25%的胰酶消化1 min使細(xì)胞形成單個細(xì)胞后用PBS緩沖液以120×

g

離心5 min，離心管底部形成松散團(tuán)塊，保留1.5 mL上清液，吸棄余下上清，重新將團(tuán)塊吹散后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管內(nèi)并以120×

g

離心10 min，EP管底部形成細(xì)胞團(tuán)塊，吸棄上清并沿管壁緩慢加入戊二醛固定液，送電鏡室觀察。

1.2.8 高糖共培養(yǎng)下MC3T3-E1細(xì)胞LC3、SQSTM1/p62的蛋白檢測 去除Transwell細(xì)胞上室及Raw264.7細(xì)胞，將下室的MC3T3-E1細(xì)胞用冰冷的PBS清洗2遍，用含有PMSF的RIPA裂解細(xì)胞，進(jìn)行BCA蛋白定量檢測，并按4∶1的比例加入5×Loading Buffer后100 ℃煮沸5 min。上樣后進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4 ℃孵育過夜，TBST清洗3遍后加二抗常溫孵育2 h，TBST清洗3遍后采用ECL化學(xué)發(fā)光顯影液進(jìn)行顯影，蛋白堆積量為加入自噬抑制劑Bafilomycin A1前后蛋白表達(dá)量的差值。通過Image J軟件進(jìn)行目的蛋白半定量分析。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測高糖共培養(yǎng)下MC3T3-E1細(xì)胞凋亡 去除Transwell細(xì)胞上室，將下室的MC3T3-E1細(xì)胞用PBS清洗后以0.25%的胰酶消化1min使細(xì)胞形成單個細(xì)胞后用PBS緩沖液以150×

g

離心5 min，去除上清，重復(fù)2次后取至少1×10個細(xì)胞并用400 μL PBS重懸，加入熒光探針Annexin V和PI雙重標(biāo)記細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀快速檢測細(xì)胞凋亡水平，結(jié)果用FlowJo.v10軟件進(jìn)行作圖分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計均采用3組樣本取平均值，RT-qPCR數(shù)據(jù)用BioRadCFXmanager記錄，Western blot數(shù)據(jù)用Bio-Rad, cat#12003154記錄，流式數(shù)據(jù)用FlowJo.v10記錄，均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本

t

檢驗(yàn)。

P

<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖促進(jìn)Raw264.7細(xì)胞M1型極化

為探究高糖是否會激活Raw264.7細(xì)胞并導(dǎo)致其M1向極化，對M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志抗原CD86進(jìn)行流式細(xì)胞表面抗原檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于正常糖濃度組，高糖環(huán)境下，CD86陽性的Raw264.7細(xì)胞明顯增加(圖2A)，表明高糖促進(jìn)Raw264.7細(xì)胞M1向極化。為進(jìn)一步明確M1向極化的Raw264.7細(xì)胞在何種高糖濃度下產(chǎn)生最明顯的促炎效應(yīng)，采用RT-qPCR及Western blot技術(shù)檢測促炎因子

IL

-6、

TNF

-

α

、

iNOS

基因及蛋白表達(dá)，RT-qPCR結(jié)果顯示30、35 mmol/L高糖濃度下Raw264.7細(xì)胞促炎因子的mRNA表達(dá)顯著高于25 mmol/L組(

P

<0.05，圖2B)。Western blot結(jié)果顯示35 mmol/L高糖濃度下iNOS蛋白表達(dá)顯著高于25 mmol/L組及30 mmol/L組(

P

<0.05，圖2C、D)。上述研究結(jié)果提示高糖促進(jìn)Raw264.7細(xì)胞M1向極化，且35 mmol/L高糖濃度下Raw264.7產(chǎn)生促炎效應(yīng)最明顯。

a：P<0.05，與25 mmol/L組比較；b：P<0.05，與30 mmol/L組比較A：流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞CD86表達(dá) 5.5 mmol/L作為對照組；B：RT-qPCR檢測M1極化相關(guān)促炎因子基因表達(dá)；C：Western blot檢測iNOS蛋白表達(dá)； D：iNOS蛋白表達(dá)半定量分析圖2 Raw264.7細(xì)胞CD86流式細(xì)胞檢測，IL-6、TNF-α和iNOS的RT-qPCR及iNOS的Western blot檢測

2.2 高糖促進(jìn)Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激

為探究不同葡萄糖濃度對Raw264.7細(xì)胞ROS產(chǎn)生、氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響，采用DCFH-DA探針檢測胞內(nèi)ROS水平，并采用RT-qPCR對相關(guān)基因進(jìn)行檢測。DCFH-DA探針的熒光結(jié)果顯示，高糖環(huán)境促進(jìn)Raw264.7胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，且呈濃度依賴性，在35 mmol/L高糖濃度下ROS產(chǎn)生最多(圖3A)。RT-qPCR結(jié)果顯示，高糖環(huán)境下Raw264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)明顯增加，且在35 mmol/L高糖環(huán)境下增加最明顯 (圖3B)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，表明35 mmol/L高糖環(huán)境顯著促進(jìn)Raw264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激。

A：熒光顯微鏡檢測不同糖濃度下Raw264.7細(xì)胞ROS水平；B：RT-qPCR檢測NOX2、p47phox基因表達(dá)與25 mmol/L組比較圖3 Raw264.7細(xì)胞ROS檢測及NOX2、p47phox的RT-qPCR檢測

2.3 高糖共培養(yǎng)條件下MC3T3-E1胞內(nèi)ROS增加

為探究各組MC3T3-E1細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，采用DCFH-DA探針檢測MC3T3-E1細(xì)胞胞內(nèi)ROS。熒光結(jié)果顯示，與正常糖濃度相比，在35 mmol/L高糖環(huán)境下，MC3T3-E1細(xì)胞產(chǎn)生較多ROS，且與Raw264.7細(xì)胞共培養(yǎng)下MC3T3-E1細(xì)胞產(chǎn)生ROS更多，熒光最強(qiáng)(圖4)，提示高糖共培養(yǎng)刺激MC3T3-E1細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激。

圖4 熒光顯微鏡檢測各組MC3T3-E1細(xì)胞ROS水平

2.4 透射電鏡結(jié)果

為進(jìn)一步探究高糖共培養(yǎng)環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞及細(xì)胞器形態(tài)學(xué)改變，本研究采用透射電鏡觀察高糖單獨(dú)培養(yǎng)或與Raw264.7細(xì)胞高糖間接共培養(yǎng)中MC3T3-E1細(xì)胞及其細(xì)胞器形態(tài)。結(jié)果顯示，35-Mono組的MC3T3-E1胞內(nèi)出現(xiàn)線粒體腫脹，線粒體部分溶解的現(xiàn)象，35-Co組的MC3T3-E1胞內(nèi)線粒體未見明顯腫脹，但可見較多自噬溶酶體形成(圖5)。

黑色箭頭示正常線粒體；綠色箭頭示腫脹線粒體；紅色箭頭示自噬溶酶體圖5 透射電鏡觀察與Raw264.7細(xì)胞高糖共培養(yǎng)下MC3T3-E1細(xì)胞線粒體及自噬溶酶體的形態(tài)

2.5 高糖共培養(yǎng)促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

為探究在高糖環(huán)境下，與Raw264.7細(xì)胞共培養(yǎng)的MC3T3-E1胞內(nèi)自噬流是否有改變，采用自噬抑制劑Bafilomycin A1分別將3組MC3T3-E1細(xì)胞的自噬流阻斷，LC3合成后在羧基末端迅速裂解產(chǎn)生LC3-Ⅰ，在自噬過程中LC3-Ⅰ被脂質(zhì)化為LC3-Ⅱ，從而將LC3與自噬小泡結(jié)合，與SQSTM1/p62一起形成自噬體，而Bafilomycin A1阻斷后自噬體無法與溶酶體融合降解(圖6A)，進(jìn)而LC3-Ⅱ及SQSTM1/p62等自噬相關(guān)蛋白會堆積，根據(jù)阻斷后LC3-Ⅱ及SQSTM1/p62堆積的多少可以判斷自噬流的強(qiáng)弱。根據(jù)Western blot檢測MC3T3-E1細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ及SQSTM1/p62表達(dá)的結(jié)果顯示，在未加入Bafilomycin A1的3組中，35-Co組MC3T3-E1細(xì)胞的LC3-Ⅱ最少，但加入Bafilomycin A1將自噬流阻斷后，可以發(fā)現(xiàn)35-Co組MC3T3-E1細(xì)胞的LC3-Ⅱ堆積最為明顯，即加入自噬抑制劑Bafilomycin A1前后LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量的差值最大，自噬流明顯強(qiáng)于單獨(dú)培養(yǎng)組(圖6B、C)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。

A：自噬過程示意圖；B：Western blot檢測各組相關(guān)蛋白表達(dá)；C：經(jīng)Bafilomycin A1阻斷前后各組LC3-Ⅱ蛋白堆積量差值半定量分析 a：P<0.05，與35-Mono組比較；D：各組SQSTM1/p62蛋白半定量分析；E：各組LC3-Ⅱ蛋白半定量分析 a：P<0.05，與35-Co組比較圖6 與Raw264.7細(xì)胞高糖共培養(yǎng)對MC3T3-E1細(xì)胞LC3-Ⅱ及SQSTM1/p62蛋白表達(dá)的影響

2.6 高糖共培養(yǎng)條件減少M(fèi)C3T3-E1細(xì)胞凋亡

為了探討在高糖環(huán)境下，與Raw264.7細(xì)胞共培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞ROS及自噬的增加是否影響其凋亡，通過流式細(xì)胞儀分析3組MC3T3-E1細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示，在35 mmol/L高糖環(huán)境下，與Raw264.7共培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞(35-Co組)的凋亡率較高糖單獨(dú)培養(yǎng)(35-Mono組)明顯增加(

P

<0.05, 圖7)，表明高糖共培養(yǎng)促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡。

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測MC3T3-E1細(xì)胞凋亡；B：各組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率 a：P<0.05，與5.5-Mono組比較；b：P<0.05，與35-Mono組比較圖7 高糖共培養(yǎng)對MC3T3-E1凋亡的影響

3 討論

3.1 高糖與骨改建

糖尿病是一種代謝紊亂，常伴隨炎癥狀態(tài)的增加。活性氧的產(chǎn)生和晚期糖基化終產(chǎn)物的積累，會增加骨折風(fēng)險，干擾骨改建，損害骨折愈合，但糖尿病骨改建不良的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。巨噬細(xì)胞作為天然免疫細(xì)胞，是最先抵達(dá)并作用于牙移動區(qū)域的細(xì)胞之一。根據(jù)其活化狀態(tài)、細(xì)胞表型及功能差異，巨噬細(xì)胞分為M1和M2型巨噬細(xì)胞。研究表明，M1型巨噬細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，主要供能方式為糖酵解，但糖酵解效率難以滿足炎性反應(yīng)的高ATP需求，細(xì)胞代謝方式由糖酵解轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸姿峄?，M2型巨噬細(xì)胞逐漸代替M1型巨噬細(xì)胞，炎癥將逐步趨于緩和甚至自限。但在高糖環(huán)境下，過量的葡萄糖導(dǎo)致線粒體電子傳遞功能被破壞，巨噬細(xì)胞無法完成從M1到M2型的轉(zhuǎn)換，炎癥失去自限性，促炎因子、趨化因子和受體被大量表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病患者體內(nèi)長期處于高氧化應(yīng)激和炎癥狀態(tài)。有研究表明，高糖還伴隨著巨噬細(xì)胞胞漿NADPH氧化酶(NOX)的異常激活，加劇ROS的產(chǎn)生和線粒體功能障礙。NOX是一種多亞基酶復(fù)合體，是體內(nèi)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵酶，也是巨噬細(xì)胞中ROS的主要來源之一。NOX蛋白存在于胞膜上，本身幾乎沒有催化活性，其需要與多種調(diào)節(jié)亞基(p40phox、p47phox、p66phox等)結(jié)合形成復(fù)合物而發(fā)揮催化作用，在血紅素等輔基的協(xié)助下將電子從基質(zhì)轉(zhuǎn)移至氧分子，形成ROS。本研究證實(shí)高糖促進(jìn)Raw264.7細(xì)胞M1向極化，且隨著培養(yǎng)環(huán)境中葡萄糖的濃度逐漸升高，Raw264.7細(xì)胞的M1型促炎效應(yīng)及氧化應(yīng)激更明顯。

在機(jī)體的骨組織不斷形成或修復(fù)過程中，成骨細(xì)胞分泌骨基質(zhì)，礦化形成新骨，而來自單核造血細(xì)胞的巨噬細(xì)胞則對成骨細(xì)胞的功能起調(diào)控作用，這兩種細(xì)胞類型是骨改建的主要參與者，骨改建也是一個持續(xù)影響我們骨骼健康的過程。成骨細(xì)胞來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在骨重塑中發(fā)揮重要作用，但在高糖環(huán)境下其功能發(fā)生顯著改變。研究表明，高糖會導(dǎo)致MC3T3-E1細(xì)胞ROS產(chǎn)生增加，成骨能力減弱。大量體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明，糖尿病大鼠骨缺損處的骨愈合速度及質(zhì)量均較正常組差。WHO在2006年發(fā)布的糖尿病指南中明確指出，隨機(jī)血糖≥7.0 mmol/L以及餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L可診斷為糖尿病，該指南在一項(xiàng)對38個前瞻性研究進(jìn)行的Meta分析中，證實(shí)未達(dá)到糖尿病標(biāo)準(zhǔn)的高血糖會增加患心血管疾病的風(fēng)險，并提到空腹血糖5.5 mmol/L可能為一個閾值，多項(xiàng)研究也表明空腹血糖>5.5 mmol/L時，心血管疾病發(fā)生風(fēng)險將成倍增加。因此，許多研究都將5.5 mmol/L作為正常血糖濃度，本研究也不例外。本研究通過Transwell間接共培養(yǎng)模型，模擬體內(nèi)環(huán)境中的細(xì)胞旁分泌交流，結(jié)果證實(shí)高糖促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞產(chǎn)生ROS，而Raw264.7細(xì)胞在高糖環(huán)境下持續(xù)的氧化應(yīng)激和炎癥介質(zhì)等的分泌對MC3T3-E1細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。VOLPE等表明，高糖通過直接作用于細(xì)胞表面的Toll樣受體導(dǎo)致成骨細(xì)胞胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加，而ROS可以通過激活細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的PERK通路或破壞自噬與凋亡的平衡而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

3.2 氧化應(yīng)激，自噬與凋亡

ROS的來源分為外源性和內(nèi)源性，外源性來源于輻射、藥物等刺激，而內(nèi)源性來源于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶、NADPH氧化酶體等，在大部分細(xì)胞中，線粒體氧化呼吸鏈中的復(fù)合體I和復(fù)合體III是產(chǎn)生ROS的主要部位。在高糖環(huán)境下，過量的葡萄糖導(dǎo)致大量電子供體進(jìn)入線粒體氧化呼吸鏈，導(dǎo)致電子泄露和大量ROS產(chǎn)生，隨之線粒體電子傳遞功能被破壞。ROS的產(chǎn)生和損傷線粒體表面發(fā)出的“吃我”的信號均會激活細(xì)胞自噬，從而在一定程度上緩解細(xì)胞受到氧化應(yīng)激的壓力，但當(dāng)這個壓力持續(xù)時間過長或超過閾值時，細(xì)胞自噬也無法挽救細(xì)胞死亡的命運(yùn)。由于自噬是一個動態(tài)變化過程，也被稱作自噬流，可以通過檢測自噬關(guān)鍵蛋白LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62來反映自噬的強(qiáng)弱，但單獨(dú)檢測某一時間點(diǎn)的自噬相關(guān)蛋白結(jié)果并不準(zhǔn)確，使用自噬阻斷劑Bafilomycin A1可以在自噬體與溶酶體融合階段進(jìn)行阻斷，從而更準(zhǔn)確的觀察自噬流過程中LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62蛋白的堆積量，反映自噬流的強(qiáng)弱。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)35 mmol/L高糖環(huán)境下，與Raw264.7細(xì)胞共培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞自噬被大量激活。通常在同一細(xì)胞中，自噬先于凋亡發(fā)生，這是因?yàn)閴毫νǔ紫却碳ぷ允煞磻?yīng)，尤其是在壓力水平不致命的情況下。當(dāng)壓力超過臨界持續(xù)時間或強(qiáng)度閾值時，凋亡和非凋亡致死程序被激活。文獻(xiàn)表明，自噬小體的形成，有助于激活caspase-8，從而激活凋亡的caspase級聯(lián)過程，此外自噬也可能通過消耗細(xì)胞死亡途徑的內(nèi)源性抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)，破壞凋亡與凋亡抑制蛋白之間的平衡來刺激細(xì)胞凋亡。我們的結(jié)果表明相比于35-Mono組，35-Co組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率明顯上升，提示我們過強(qiáng)的ROS和自噬導(dǎo)致了細(xì)胞死亡的發(fā)生。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)與Raw264.7細(xì)胞在高糖環(huán)境下共培養(yǎng)會誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，而該凋亡的發(fā)生可能與高糖環(huán)境下Raw264.7細(xì)胞持續(xù)氧化應(yīng)激和促炎因子分泌而導(dǎo)致MC3T3-E1胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS和過度自噬有關(guān)，然而上述結(jié)論仍需通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究有助于詮釋高糖環(huán)境下正畸骨改建失敗的生物學(xué)基礎(chǔ)，高糖環(huán)境對成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激和自噬的影響及巨噬細(xì)胞在其中發(fā)揮的作用，力求探索保護(hù)成骨細(xì)胞正常生理功能的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為臨床制定針對性預(yù)防和治療策略提供新的思路和理論依據(jù)。