賀 戈，汪國建，趙 娜，龍 爽，王 濤，明 佳 40000重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院乳甲外科；400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系防原醫(yī)學(xué)教研室，全軍復(fù)合傷研究所，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市納米醫(yī)學(xué)工程研究中心

乳腺癌是女性比較常見的惡性腫瘤之一。近年來，其發(fā)病率呈現(xiàn)出較快的上升趨勢，雖有較多的治療選擇，乳腺癌仍有10%～20% 的死亡率，其主要的死亡原因是癌癥的浸潤轉(zhuǎn)移。目前，放射治療是各種惡性腫瘤的基礎(chǔ)治療措施之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，超過50%的癌癥患者在患病期間接受放射治療，其對于提高病患整體存活、改善生活質(zhì)量有重要貢獻(xiàn)。然而，諸多基于體外細(xì)胞和在體動物實(shí)驗(yàn)的研究證據(jù)表明電離輻射(ionizing radiation，IR)可以通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，IR可通過對腫瘤細(xì)胞的直接作用和對腫瘤微環(huán)境的間接影響促進(jìn)腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)、侵襲、遷移、血管新生乃至轉(zhuǎn)移。臨床研究表明，特定腫瘤在放射治療后會產(chǎn)生促轉(zhuǎn)移和促侵襲的信號。因此，開展針對IR促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制與防治藥物研究具有積極的意義。

柳氮磺吡啶(sulfasalazine, SSZ)為磺胺類抗菌藥，臨床上廣泛用于類風(fēng)濕性骨關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸病的治療，其作用機(jī)制包括抑制NF-κB活性發(fā)揮抗炎作用和拮抗胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白體亞基SLC7A11/xCT功能誘導(dǎo)癌細(xì)胞鐵死亡。新近研究表明SSZ通過多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，提示其在腫瘤治療中具有潛在的良好應(yīng)用前景，但關(guān)于SSZ對輻照促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移作用的影響尚不清楚。本研究采用小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1和人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7為研究對象，評價(jià)SSZ對IR誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT、遷移、侵襲等表型的影響；并進(jìn)一步采用4T1細(xì)胞乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型評價(jià)SSZ對IR促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的拮抗，以期為IR促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物防治提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)全軍復(fù)合傷研究所實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 動物 5～7周齡 BALB/c雌鼠共50只，體質(zhì)量16～20 g，在陸軍軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心無菌條件下飼養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Cytiva公司；電泳凝膠試劑盒、電泳液購自上海雅酶生物醫(yī)藥公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Vimentin抗體(AF0318)、Snail抗體(AF8013)、β-Tubulin抗體(AF1216)購自上海碧云天生物技術(shù)公司；E-cadherin抗體(#3195)購自美國CST公司；MMP2抗體(ab86607)、MMP9抗體(ab283575)、xCT抗體(ab175186)、山羊抗小鼠二抗抗體、山羊抗兔二抗抗體購自英國Abcam公司；絲裂霉素購自美國GEN-VIEW公司；SSZ購自美國MCE公司；Transwell實(shí)驗(yàn)試劑盒購自美國CORNING公司；傷口愈合2孔插件購自德國Ibidi公司；結(jié)晶紫染色液購自北京索萊寶科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7培養(yǎng)于90% DMEM高糖培養(yǎng)基+10% 胎牛血清中。小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1培養(yǎng)于90% RPMI 1640培養(yǎng)基+10% 胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 g/mL鏈霉素中。所有細(xì)胞株培養(yǎng)于37 ℃、5% CO的恒溫培養(yǎng)箱中。使用陸軍軍醫(yī)大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室X射線輻照儀RS2000在160 kV、25 mA的條件下，以1.265 Gy/min的劑量率進(jìn)行輻照。通過設(shè)定X射線(筒稱X線)不同照射時間(95、190、285、379、474 s)以達(dá)到不同照射劑量(2、4、6、8、10 Gy)。

實(shí)驗(yàn)分4組：對照組(Con)、SSZ組、IR組和IR+SSZ組；Con組細(xì)胞正常培養(yǎng)，IR組對細(xì)胞進(jìn)行4 Gy的X線照射，SSZ組采用0.5 mmol/L的SSZ處理細(xì)胞，IR+SSZ組在對細(xì)胞進(jìn)行4 Gy的X線照射后，采用0.5 mmol/L的SSZ處理細(xì)胞。

1.2.2 劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 將MCF-7和4T1細(xì)胞稀釋至6×10/mL，以每孔1 mL均勻接種于6孔板中(傷口愈合2孔插件內(nèi)接種密度稍大于插件外)。待傷口愈合2孔插件內(nèi)細(xì)胞長至90% 融合后，進(jìn)行4 Gy的X線照射。照射后立即加入細(xì)胞增殖抑制劑絲裂霉素(10 μg/mL)以及SSZ(0.5 mmol/L)孵育2 h。取下傷口愈合2孔插件，形成劃痕，并拍照記錄劃痕線與插件交匯線兩側(cè)劃痕的寬度(記為0 h數(shù)值)。將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后再次原位測量劃痕寬度并拍照記錄，與0 h數(shù)值做比較。使用TScratch軟件分析測量劃痕面積，24 h劃痕面積與0 h劃痕面積比值代表劃痕愈合面積百分比。

1.2.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將Transwell小室置于6孔板中，消化MCF-7或4T1細(xì)胞至細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，用無血清DMEM/ RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×10/mL，轉(zhuǎn)至Transwell小室，每個小室加入200 μL細(xì)胞懸液，在小室下層加入含10%胎牛血清的DMEM/RPMI 1640培養(yǎng)基作為趨化劑。6孔板于培養(yǎng)箱中過夜后進(jìn)行輻照，輻照后SSZ組于小室內(nèi)加入0.5 mmol/L的SSZ，孵育48 h，用棉簽拭去非侵襲性細(xì)胞，采用甲紫(結(jié)晶紫)固定并染色，在100倍顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.2.4 Western blot檢測 輻照后48 h取材，于細(xì)胞孔板中加入300 μL細(xì)胞裂解液，隨后收集裂解液于EP管中，將EP管在4 ℃、14 000 r/min的條件下離心10 min后提取上清液，按照BCA法檢測定量蛋白后加入蛋白上樣緩沖液制備樣品。蛋白樣品在SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行電泳分離，隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用5% 脫脂奶粉于37 ℃搖床封閉1 h，加入配置好的一抗于4 ℃搖床孵育過夜，使用PBS在搖床上洗膜后，加入配置好的二抗于37 ℃搖床孵育1 h，再次使用PBS在搖床上洗膜，使用奧德賽顯色儀顯色成像并測量灰度值。

1.2.5 動物模型實(shí)驗(yàn) 選用5～7周齡BALB/c雌鼠進(jìn)行小鼠乳腺癌4T1荷瘤實(shí)驗(yàn)，小鼠按照體質(zhì)量順序編號后隨機(jī)分為4組：Con組、SSZ組、IR組和IR+SSZ組(每組納入10～13只小鼠)。小鼠按50 μL/20 g腹腔注射2%戊巴比妥進(jìn)行麻醉，隨后于背部皮下接種4T1細(xì)胞(1×10/只)，24 h后，SSZ組及IR+SSZ組小鼠于腹腔注射8 mg/只的SSZ(SSZ在每次注射前新鮮配制)，其余兩組于腹腔注射等體積生理鹽水，2次/d，直至處死小鼠。10 d后，用鉛板擋住IR組和IR+SSZ組小鼠除腫瘤外的其他身體部位，然后用4 Gy的X線照射腫瘤部位。Con組和SSZ組不做照射處理。

小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)：注射4T1細(xì)胞后第30天使用脊椎脫臼法處死小鼠，隨后從小鼠氣管注射Bouin’s固定液至肺部完全充起，取下肺組織，于PBS液中簡單漂洗后置于Bouin’s固定液中固定，24 h后觀察小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)(肺組織表面的白色凸起點(diǎn)狀物即為肺轉(zhuǎn)移灶)并計(jì)數(shù)。

肺組織按常規(guī)方法制備蠟塊后切片，經(jīng)脫蠟、復(fù)水后進(jìn)行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肺轉(zhuǎn)移灶的病理學(xué)改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，同一分子在不同輻照劑量下的表達(dá)量比較采用

t

檢驗(yàn)，各組間分子表達(dá)量的比較、劃痕實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果及小鼠原位瘤體積和肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量的比較采用單因素方差分析。

P

<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IR誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7、4T1發(fā)生EMT形態(tài)變化以及相關(guān)蛋白標(biāo)志物的表達(dá)

兩種乳腺癌細(xì)胞(MCF-7、4T1)在未照射時，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞間連接緊密，呈“鋪路石樣”(圖1A)。采用2、4、6、8、10 Gy的X線照射后，隨著照射劑量的增加，逐漸失去原有的立方形態(tài)，出現(xiàn)不同程度的EMT形態(tài)學(xué)變化；MCF-7細(xì)胞變?yōu)椤皵傠u蛋樣”形態(tài)，細(xì)胞間間隙增大；4T1細(xì)胞失去細(xì)胞間的緊密接觸，細(xì)胞向“紡錘樣”或多角樣演化，形成偽足。Western blot檢測EMT相關(guān)分子的表達(dá)，結(jié)果顯示，兩種乳腺癌細(xì)胞均出現(xiàn)間充質(zhì)蛋白Snail和Vimentin的表達(dá)增高，且在4 Gy的照射劑量下較為明顯(圖1B、C)。

a：P<0.05，與0 Gy組比較A：X線照射后48 h乳腺癌細(xì)胞MCF-7、4T1形態(tài)變化；B：Western blot檢測不同劑量的X線照射后MCF-7細(xì)胞EMT相關(guān)分子Vimentin和Snail的表達(dá)及半定量分析；C：Western blot檢測不同劑量的X線照射后4T1細(xì)胞EMT相關(guān)分子Vimentin和Snail的表達(dá)及半定量分析圖1 IR對乳腺癌細(xì)胞形態(tài)的影響及EMT相關(guān)分子的Western blot檢測結(jié)果

2.2 SSZ抑制IR誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞EMT表型

4 Gy的X線分別照射乳腺癌細(xì)胞MCF-7和4T1，然后采用SSZ(0.5 mmol/L)處理乳腺癌細(xì)胞2 h，觀察照射后48 h的形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果顯示，單純使用SSZ對細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響不明顯，而IR促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞EMT變化的趨勢能夠被SSZ顯著抑制(圖2A)。Western blot檢測乳腺癌細(xì)胞EMT相關(guān)分子表達(dá)的結(jié)果顯示，與Con組比較，IR組的細(xì)胞上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)降低(

P

<0.05)，間充質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin和Snail表達(dá)升高(

P

<0.05)；與IR組比較，IR+SSZ組細(xì)胞上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)升高(

P

<0.05)，而間充質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin和Snail表達(dá)降低(

P

<0.05)。與細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的結(jié)果一致，表明SSZ可以抑制IR誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞EMT(圖2B、C)。

a：P<0.05，與Con組比較；b：P<0.05，與IR組比較A：4 Gy的X線照射后各組MCF-7、4T1細(xì)胞形態(tài)變化；B：Western blot檢測各組MCF-7細(xì)胞 EMT相關(guān)分子的表達(dá)及半定量分析；C：Western blot檢測各組4T1細(xì)胞EMT相關(guān)分子的表達(dá)及半定量分析圖2 IR及SSZ對乳腺癌細(xì)胞形態(tài)的影響及EMT相關(guān)分子的Western blot檢測結(jié)果

2.3 SSZ抑制IR對乳腺癌細(xì)胞促遷移和促侵襲的作用

采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測IR后乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化及SSZ對其的影響。MCF-7細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3A、B)，與Con組比較，IR組細(xì)胞的劃痕愈合速度增快(

P

<0.05)；與IR組比較，IR+SSZ組細(xì)胞的劃痕愈合速度減慢(

P

<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果與劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致(圖4A、B)，與Con組比較，SSZ組的細(xì)胞侵襲能力降低(

P

<0.05)，IR組的細(xì)胞侵襲能力明顯增加(

P

<0.05)；與IR組比較，IR+SSZ組的細(xì)胞侵襲能力顯著降低(

P

<0.05)。4T1細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)(圖3C)和Transwell實(shí)驗(yàn)(圖4A、C)得到類似的結(jié)果，IR促進(jìn)4T1細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力，而SSZ抑制IR的促遷移、侵襲作用。

a：P<0.05，與Con組比較；b：P<0.05，與IR組比較A：劃痕愈合實(shí)驗(yàn)觀察各組MCF-7細(xì)胞劃痕愈合情況；B：各組MCF-7細(xì)胞劃痕愈合面積；C：各組4T1細(xì)胞劃痕愈合面積圖3 IR及SSZ對乳腺癌細(xì)胞劃痕愈合速度的影響

2.4 SSZ抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)MMP2/9、xCT等分子的蛋白表達(dá)

采用Western blot檢測各組細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的表達(dá)，結(jié)果顯示，4 Gy的X線照射明顯促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞MMP2/9和xCT的表達(dá)，無論是單純使用SSZ或是IR后使用SSZ，MMP2/9和xCT的表達(dá)都被抑制(圖5)。

a：P<0.05，與Con組比較；b: P<0.05，與IR組比較A：MCF-7細(xì)胞MMP2/9和xCT的表達(dá)及半定量分析；B: 4T1細(xì)胞MMP2/9和xCT的表達(dá)及半定量分析圖5 Western blot檢測各組乳腺癌細(xì)胞MMP2/9和xCT的表達(dá)

2.5 IR促進(jìn)小鼠4T1乳腺癌肺轉(zhuǎn)移，SSZ有效抑制IR的促肺轉(zhuǎn)移效應(yīng)

構(gòu)建4T1小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的模型以判斷IR和SSZ對體內(nèi)腫瘤模型的影響，如圖6A、B所示，Con組、SSZ組、IR組、IR+SSZ組小鼠原位瘤體積分別為(1.70±0.54)、(1.37±0.55)、(1.24±0.32)、(0.83±0.54)cm。與Con組比較，IR組和IR+SSZ組的小鼠原位瘤體積顯著降低(

P

<0.05)，與IR組比較，IR+SSZ組原位瘤體積降低更顯著(

P

<0.05)，而SSZ組原位瘤體積與Con組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明IR對原位瘤的生長有明顯抑制作用，且SSZ與IR存在協(xié)同作用。計(jì)數(shù)各組小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，如圖6C、D所示，Con組、SSZ組、IR組、IR+SSZ組小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)分別為(8.67±7.88)、(4.30±5.39)、(19.00±8.31)、(6.10±7.78)個。與Con組比較，SSZ組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而IR組小鼠的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)顯著增多(

P

<0.05)，與IR組比較，IR+SSZ組的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)顯著降低(

P

<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：①4 Gy的X線照射對小鼠原位瘤生長的抑制作用顯著，且IR協(xié)同SSZ進(jìn)一步抑制了原位瘤的生長，但4 Gy的X線照射同時促進(jìn)了小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移；②SSZ對小鼠乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移無明顯抑制作用，但可以顯著拮抗IR誘導(dǎo)的促轉(zhuǎn)移效應(yīng)。

a：P<0.05，與Con組比較；b：P<0.05，與IR組比較A：各組小鼠原位瘤大體觀；B：各組小鼠的原位瘤體積；C：各組小鼠肺轉(zhuǎn)移灶大體觀；D：各組小鼠肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)圖6 IR以及SSZ對小鼠原位瘤以及乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的影響

小鼠肺組織各組轉(zhuǎn)移灶的HE染色結(jié)果顯示，與Con組比較，SSZ組無明顯差異，而IR組的腫瘤肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量增多，面積增加，邊界欠清，有明顯彌散的趨勢。與IR組比較，IR+SSZ組的肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量減少，面積減小，邊界清晰(圖7)。

圖7 HE染色觀察各組小鼠肺轉(zhuǎn)移灶形態(tài)

3 討論

放射治療是包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的基礎(chǔ)治療措施之一，雖然尚缺乏放射治療是否能促進(jìn)特定病患腫瘤早期復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的臨床試驗(yàn)證據(jù)，但基于在體動物的研究表明IR能夠通過多種途徑促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。本研究采用乳腺癌細(xì)胞的離體細(xì)胞模型和在體肺轉(zhuǎn)移模型，評價(jià)SSZ對IR誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移的拮抗作用。結(jié)果顯示，SSZ能有效抑制IR誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT、遷移、侵襲等轉(zhuǎn)移相關(guān)表型，下調(diào)MMP2/9、xCT等蛋白表達(dá)水平，其作為治療措施對在體局部照射促進(jìn)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的作用顯示顯著拮抗效果。

EMT是指具有極性的上皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有活動能力的間質(zhì)樣細(xì)胞過程，被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)中早期關(guān)鍵事件，在腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲中發(fā)揮重要作用。腫瘤細(xì)胞通過EMT丟失上皮細(xì)胞樣表征-極性和細(xì)胞間接觸等，從而獲得遷移能力以侵襲正常的組織和器官，形成癌癥的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)導(dǎo)致病情惡化。

既往研究報(bào)道IR能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)EMT表型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之一致，不同劑量的X線照射可誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1出現(xiàn)EMT表型。兩種乳腺癌細(xì)胞4 Gy單次照射即可出現(xiàn)典型EMT表型，因此選取這一劑量開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。與照射引起EMT表型相對應(yīng)，本研究發(fā)現(xiàn)離體細(xì)胞4 Gy的X線照射能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移與侵襲，而在體實(shí)驗(yàn)顯示荷瘤局部4 Gy的X線照射能顯著促進(jìn)4T1細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移，表明IR能夠促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。但需要指出的是：IR促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移與放射治療促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移是兩個概念。臨床上放療的處方劑量雖然單次不大，但連續(xù)照射的累積劑量很高，其作用的目的是在盡量減少對正常組織器官損害前提下以IR殺死腫瘤細(xì)胞。在放射治療的作用模式下腫瘤細(xì)胞可能出現(xiàn)脫落播散，但這些以EMT或循環(huán)腫瘤細(xì)胞形式的播散難以產(chǎn)生轉(zhuǎn)移灶。譬如最近有研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者在放療后不同階段均存在患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞的顯著增多，這些細(xì)胞是具有EMT表型、DNA損傷等特征的活細(xì)胞，但在體外培養(yǎng)體系增殖能力有限。而本研究顯示，4T1乳腺癌荷瘤局部的4 Gy單次照射即可顯著使得瘤體積縮小，殺死較多腫瘤細(xì)胞，但可促進(jìn)腫瘤的肺轉(zhuǎn)移。這一結(jié)果是單次IR作用的結(jié)果，如果以放射治療的方案將可能在肺部轉(zhuǎn)移之前即將原位瘤全部殺死。

最近研究報(bào)道IR可以誘導(dǎo)xCT的表達(dá)上調(diào)，通過拮抗鐵死亡促進(jìn)細(xì)胞存活。先前有報(bào)道認(rèn)為xCT在乳腺癌細(xì)胞株的表達(dá)水平與EMT密切相關(guān)，而SSZ能通過抑制xCT逆轉(zhuǎn)EMT表型。由此，我們推測IR誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)表型可能與xCT相關(guān)，故而嘗試以SSZ為防治藥物評價(jià)其對IR促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移表型的影響。本研究結(jié)果表明，SSZ對乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和4T1的本身形態(tài)及EMT相關(guān)分子表達(dá)的影響均有限，但能夠顯著降低IR誘導(dǎo)的Snail、Vimentin等間質(zhì)蛋白表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin等上皮來源蛋白表達(dá)，同時可以從形態(tài)上部分逆轉(zhuǎn)EMT表型。與之類似，遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，SSZ對非照射細(xì)胞的作用有限，但能顯著抑制IR誘導(dǎo)的促轉(zhuǎn)移相關(guān)表型。新近研究報(bào)道，SSZ在具有典型間質(zhì)特征的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231能夠抑制其EMT表型，與本研究僅在照射細(xì)胞起作用的結(jié)果不盡相同，可能與本研究采用的細(xì)胞具有典型上皮特征有關(guān)。

本研究初步探討SSZ抑制電離輻射誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞EMT、遷移、侵襲等轉(zhuǎn)移相關(guān)表型增強(qiáng)的可能機(jī)制。發(fā)現(xiàn)IR能促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2/9、xCT等蛋白水平的表達(dá)，而SSZ能抑制上述蛋白的基礎(chǔ)水平和輻射誘導(dǎo)后的表達(dá)。研究表明IR誘導(dǎo)表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶對于IR促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)揮了重要作用，而SSZ可以通過抑制NF-κB活性下調(diào)其表達(dá)，在本實(shí)驗(yàn)體系可能存在類似的機(jī)制。xCT的水平與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，作為xCT抑制劑的SSZ發(fā)揮拮抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用或與此有關(guān)。然而，到底何種因素在SSZ抑制IR誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增強(qiáng)的轉(zhuǎn)移相關(guān)表型中發(fā)揮核心關(guān)鍵作用，尚待更加深入系統(tǒng)的研究。需要指出的是，雖然SSZ能夠抑制上述分子在乳腺癌細(xì)胞的基礎(chǔ)表達(dá)水平，但對未照射細(xì)胞的遷移、侵襲表型影響有限，提示其發(fā)揮作用或有其他機(jī)制存在。

與離體細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，SSZ治療在動物實(shí)驗(yàn)中也顯示較好效果。將4T1乳腺癌細(xì)胞在背部皮下進(jìn)行接種荷瘤會出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移，而4 Gy單次荷瘤局部照射后能夠顯著促進(jìn)肺部轉(zhuǎn)移。SSZ能夠顯著抑制IR導(dǎo)致的肺部轉(zhuǎn)移促進(jìn)作用。照射的兩組小鼠原位瘤大小均顯著降低，但SSZ組比單純照射的IR組瘤體積降低更顯著，提示二者在殺傷腫瘤細(xì)胞方面存在協(xié)同作用。SSZ能夠顯著降低原位瘤局部照射導(dǎo)致的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目，但其與未照射小鼠在肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鑒于本實(shí)驗(yàn)僅采用1個給藥劑量，而SSZ本身具有較寬泛的安全劑量，后續(xù)的量效關(guān)系值得進(jìn)一步摸索。需要指出的是，雖然SSZ治療對未照射腫瘤顯示出減少原位瘤體積和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目的趨勢，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，本研究表明SSZ顯示出較好的抑制IR誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞株EMT、遷移、侵襲等轉(zhuǎn)移相關(guān)表型的作用，其作為治療措施對在體局部照射乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移促進(jìn)作用具有顯著拮抗效果，提示其或可作為腫瘤放射治療時聯(lián)合用藥以降低潛在的腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。

作者貢獻(xiàn)聲明：

賀戈參與設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)驗(yàn)操作，采集、清理以及分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；汪國建參與實(shí)驗(yàn)，采集、清理以及分析數(shù)據(jù)；趙娜和龍爽參與實(shí)驗(yàn)；王濤提出研究思路，設(shè)計(jì)研究方案，采集、清理以及分析數(shù)據(jù)，論文修改；明佳提出研究思路，設(shè)計(jì)研究方案，論文修改。