王鑫宇，許倍銘，劉陳夢，吳康，孫瑞杰，賈士儒，譚之磊

（天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

納他霉素是天然多烯大環(huán)內脂類抗生素，分子式為C33H47NO13，分子量為665.75[1]，含有4個共軛雙鍵的26元內酯環(huán)，可以與麥角甾醇基團結合，從而使真菌細胞膜變形[2]，進而引起菌內維持細胞生長的物質滲出，最終致使細胞死亡，但對細菌沒有抑制作用[3]。納他霉素難溶于水和油脂，很難被人體消化吸收，大部分攝入的納他霉素會隨糞便排出，因此具有很高的安全性[4-5]。由于納他霉素具有優(yōu)良的抗菌性能，目前除在焙烤食品、乳酪制品、易發(fā)霉食品等食品行業(yè)上應用外[6-7]，在醫(yī)藥工業(yè)、飼料工業(yè)等領域也得到了越來越多的重視，臨床上現(xiàn)已用于治療皮膚真菌感染疾病、真菌性眼角膜炎等[8-9]。

褐黃孢鏈霉菌是主要的納他霉素生產(chǎn)菌之一，褐黃孢鏈霉菌在發(fā)酵前期pH值快速下降，但酸性條件不利于菌體生長和納他霉素生產(chǎn)[10]。因此篩選耐受低pH值的菌株不僅有利于納他霉素生產(chǎn)，也有利于在實際生產(chǎn)中減少耗堿量，降低生產(chǎn)過程中粗放操作對發(fā)酵產(chǎn)量造成的影響。Zhang等[11]等以干酪乳桿菌為出發(fā)菌，在pH4.3的酸性條件下適應性進化70 d得到的進化株，搖瓶發(fā)酵64 h，生物量較出發(fā)菌提高60%以上。Nyabako等[12]通過常壓室溫等離子體誘變結合酸適應進化，有效提高了嗜酸乳桿菌的耐酸能力。突變株LAartp-ale2在pH3.0和pH2.5的酸性條件下存活率顯著提高。目前影響鏈霉菌耐酸性的相關報道較少。但在部分革蘭氏陽性菌中已有研究表明[13]，胞內質子（H+）的去除，細胞膜組分改變及胞內三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量等都會影響菌株的耐酸能力，通過將胞內H+排出胞外可以維持胞內pH值穩(wěn)態(tài)，從而保證菌體在酸性環(huán)境中的正常生長，而這一過程需要ATP提供能量。此外ATP通常作為微生物生長和生物合成有用物質所必需的能量來源，納他霉素生物合成酶的作用的發(fā)揮需要ATP提供能量[14]。

本試驗以褐黃孢鏈霉菌S.gilvosporeus TUST01為出發(fā)菌，通過誘變育種結合合理地篩選方式，獲得耐低pH值突變菌株S.gilvosporeus Y-10，并對其耐酸機制進行研究。以期為降低納他霉素生產(chǎn)成本，研究鏈霉菌耐酸機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

甲醇（色譜純）、氯仿（分析純）：康科德科技有限公司；氫氧化鈉（分析純）：博歐特化工貿易有限公司；葡萄糖（分析純）、磷酸鹽緩沖液（分析純）、ATP檢測試劑盒：北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 菌株

納他霉素原始生產(chǎn)菌株Streptomyces gilvosporeus TUST01：天津科技大學生化工程實驗室保存。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：淀粉10 g，葡萄糖10 g，黃豆餅粉10 g，蛋白胨 6 g，玉米漿 6 g，硫酸鎂 1 g，磷酸二氫鉀0.5 g，氯化鈉2 g，碳酸鈣5 g，加水定容至1 L，調節(jié)pH值為7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40g，淀粉30g，牛肉膏10g，黃豆餅粉15g，酵母抽提物0.3g，蛋白胨6.3g，MgSO4·7H2O 1.0g，NaCl2g，加水定容至1L，調節(jié)pH值為4.4和7.4。

斜面培養(yǎng)基：淀粉10g，葡萄糖10g，黃豆餅粉10g，酵母粉3 g，麥芽粉3 g，硫酸鎂1 g，磷酸氫二鉀0.5 g，氯化鈉2 g，碳酸鈣3 g，瓊脂20 g，加水定容至1 L，調節(jié)pH值為7.0。

低pH值固體篩選培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基，pH值調整為4.0。

以上培養(yǎng)基均使用121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.4 儀器與設備

BASIC紫外分光光度計：德國Eppendorf公司；SBA-400E生物傳感分析儀：山東省科學院生物研究所；BIOTECH-5BG-7000A 5 L發(fā)酵罐：上海保興生物設備工程有限公司；ARTP-Ⅱ常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)：北京思清源生物科技有限公司；Infinite 200PRO多功能酶標儀：帝肯貿易有限公司。

1.5 方法

1.5.1 菌株活化

在超凈臺中無菌條件下打開保藏菌種干粉的安瓿管，在其中加入1mL0.9%無菌生理鹽水，使用移液槍吹吸使菌種干粉在生理鹽水中混合均勻。吸取200 μL菌液加入到100 mL種子培養(yǎng)基中，平行3份。將種子培養(yǎng)基在28℃、220 r/min的搖床中培養(yǎng)48 h。

使用無菌接種環(huán)在菌種的復蘇種子培養(yǎng)基中挑菌，在固體培養(yǎng)基平板上三區(qū)劃線，平行3份，29℃恒溫培養(yǎng)5 d～7 d直至菌種表面產(chǎn)生孢子。

1.5.2 常壓室溫等離子體誘變（atmospheric and roomtemperature plasma，ARTP）

用無菌生理鹽水沖洗S.gilvosporeus TUST01斜面上生長良好的孢子，置于裝有玻璃珠的250 mL三角瓶中，220 r/min振蕩打散30 min后用濾膜過濾，調整孢子懸浮液濃度約為108CFU/mL。取10 μL孢子懸浮液于無菌金屬載片上，放置于ARTP-Ⅱ常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)處理臺座，在電源功率40 W，照射距離2 mm，氣流量10 L/min條件下對菌懸液進行50 s的誘變處理[15]，此時致死率為90%（正突變率最高）[16]。照射后，將金屬載片放入裝有1 mL無菌生理鹽水的離心管中振蕩1 min，再用生理鹽水稀釋后涂布于pH4.0的低pH值篩選平板，29℃培養(yǎng)5 d～10 d至突變株單菌落孢子絲生長良好。

1.5.3 耐酸菌株篩選

將pH4.0篩選平板上的突變株接種于24孔深孔板，每孔含3 mL種子培養(yǎng)基，用透氣封板膜密封后28℃，220 r/min于搖床振蕩48 h。之后取培養(yǎng)液以8%接種量接種于同樣的裝有3 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的24孔深孔板中，搖床發(fā)酵96 h后吸取200 μL發(fā)酵液于96孔板中，4 000 r/min離心10 min，之后取40 μL上清液于新的96孔板中，以70%甲醇適當稀釋后置于酶標儀測定OD303值[17]，挑選OD303值較高的菌株進行平板驗證，并進行搖瓶復篩及5 L發(fā)酵罐驗證。

5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)方法：初始裝液量3 L，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，28℃，220 r/min種子培養(yǎng)48 h，種子接種量15%，初始攪拌轉速200 r/min，罐壓0.1 MPa，通氣量1∶1，溫度28℃，關聯(lián)溶氧與轉速以控制溶氧量在30%，流加80%葡萄糖以控制葡萄糖含量為20 g/L。定時取樣測定發(fā)酵液的殘?zhí)荹18]、生物量[19]和納他霉素產(chǎn)量[20]。在此條件下通過控制不同的pH值條件以比較出發(fā)菌與篩選菌株的生長和納他霉素生產(chǎn)情況[21]。

1.5.4 遺傳穩(wěn)定性

將復篩選出的菌株在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)轉接15代，挑取各代菌株進行搖瓶發(fā)酵試驗，測定其生物量和納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量[22]。

1.5.5 胞內ATP含量測定

根據(jù)ATP檢測試劑盒說明書的方法測定胞內ATP 濃度[23]。

1.5.6 細胞膜脂肪酸含量測定

參照Bo等[24]的方法，發(fā)酵液離心棄上清液后，用磷酸鹽緩沖液反復洗滌菌體細胞兩次，經(jīng)液氮淬滅、提取液提取小分子物質、甲基化和硅烷化后，取上清液進行氣相色譜-質譜 （gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）檢測。

氣相色譜條件：HP-5MS色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25μm）；升溫程序為進樣后70℃保持2min，以5℃/min的速度升溫到290℃，保持3min，再降溫到70℃。運行時間為52 min；載氣為高純氦氣，恒定流速為1 mL/min；接口溫度280℃。

質譜條件：電子轟擊電離；離子源溫度為250℃；離子電流為40 μA；電子轟擊能量為70 eV；掃描質量范圍 m/z為 50～800。

1.6 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

數(shù)據(jù)分析采用費舍爾最小顯著差異法，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 突變株的篩選

2.1.1 初篩

通過pH4.0篩選平板的篩選獲得了420株突變菌株。按照1.5.3中的24孔深孔板篩選方法，根據(jù)納他霉素產(chǎn)量篩選耐受pH4.4的菌株，耐低pH值菌株納他霉素產(chǎn)量散點圖見圖1。

圖1 耐低pH值菌株納他霉素產(chǎn)量散點圖Fig.1 Scatter plot of natamycin yield of strains with low pH resistance

由圖1可知，206株突變株的納他霉素與出發(fā)菌有顯著差異，即與出發(fā)菌納他霉素產(chǎn)量偏差超過±10%，突變率為49.05%。73株突變株較出發(fā)菌納他霉素產(chǎn)量提高，正突變率達17.38%。其中6株突變株納他霉素產(chǎn)量較高，菌株編號為Y-10，Y-226，Y-348，Y-354，Y-390以及Y-420，對6株菌株做進一步平板及搖瓶驗證。

2.1.2 篩選菌株平板生長驗證

對篩選菌株進行平板生長驗證，如圖2所示。

圖2 篩選菌株平板驗證圖Fig.2 Plate verification of screened strains

由圖2可知，篩選菌株中Y-10生長最為旺盛，此外Y-354，Y-390以及Y-420孢子發(fā)育良好，但菌落覆蓋范圍不完整。而Y-226與Y-348菌株外觀形態(tài)異常，菌絲生長緩慢。其中Y-226只長菌但孢子完全未萌發(fā)，而Y-348僅有部分區(qū)域孢子萌發(fā)且發(fā)育較差?？梢姾Y選菌株中Y-10耐酸效果最好，結合其較高的納他霉素產(chǎn)量對Y-10進行進一步平板驗證，觀察其在pH4.4和pH7.4固體平板上不同培養(yǎng)時間的生長情況，結果見圖3。

圖3 Y-10與出發(fā)菌TUST01在不同pH值平板上的生長圖Fig.3 Growth of Y-10 and TUST01 at different pH plates

由圖3可知，出發(fā)菌在pH4.4的低pH值平板上不生長，而Y-10菌株生長旺盛，可見其具有較強的耐酸能力。此外，Y-10較出發(fā)菌在pH7.4的平板上培養(yǎng)前期生長更旺盛，到培養(yǎng)中期兩株鏈霉菌孢子發(fā)育良好，而到后期Y-10菌株孢子變灰而出發(fā)菌孢子偏灰白色。

2.1.3 搖瓶復篩

2.1.3.1 pH4.4搖瓶復篩

6株突變株在24孔深孔板低pH值發(fā)酵培養(yǎng)基篩選條件下納他霉素產(chǎn)量較高（圖1），對6株突變株進行pH4.4搖瓶復篩，結果見圖4。

圖4 耐低pH值菌株于pH4.4條件下納他霉素產(chǎn)量和生物量驗證Fig.4 Yield and biomass verification of the strain with low pH resistance at pH4.4 shaking flask

如圖4a所示，Y-10在pH4.4條件下納他霉素產(chǎn)量最高，于發(fā)酵132 h達最大值4.08 g/L，較出發(fā)菌TUST01提高48.36%。如圖4b所示，Y-10于搖瓶發(fā)酵生物量最大值為20.89 g/L，較出發(fā)菌提高42.11%，與納他霉素產(chǎn)量具有高度一致性。此外Y-226由于在平板上未產(chǎn)孢子，其在pH4.4搖瓶發(fā)酵條件下菌株難以生長，納他霉素產(chǎn)量極低。因此選擇Y-10作為優(yōu)選耐酸菌株進行下一步研究。

將經(jīng)過ARTP誘變及24孔深孔板初篩得到的在低pH值條件下納他霉素產(chǎn)量較高的Y-10菌株與出發(fā)菌TUST01在pH4.4搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中pH值和殘?zhí)沁M行比較，結果見圖5。

圖5 Y-10與出發(fā)菌TUST01于pH4.4條件下?lián)u瓶發(fā)酵參數(shù)比較Fig.5 Comparison of shaking flask fermentation parameters between Y-10 and the original strain at pH4.4

圖5 a表明兩株菌在低pH值條件下pH值都呈現(xiàn)出先升高后降低再升高的趨勢，可能是由于發(fā)酵初期菌體出于滿足細胞生長的要求，通過自身代謝調整pH值至近中性（5.63～5.77）。之后菌體生長產(chǎn)酸導致pH值降低，但是降低幅度很小。最后菌體自溶，堿性物質流出導致pH值上升。圖5 b顯示出兩株菌的耗糖速度相當。由于Y-10較高的納他霉素產(chǎn)量和生物量，確定Y-10可以耐受低pH值的條件，為了達到后期篩選耐受低pH值菌株以及減少發(fā)酵過程中堿的消耗的目的，還需對Y-10進行pH7.4的正常搖瓶發(fā)酵驗證。

2.1.3.2 正常條件搖瓶復篩

對Y-10于pH7.4搖瓶條件下進行驗證，比較Y-10與出發(fā)菌納他霉素產(chǎn)量、生物量、pH值及殘?zhí)亲兓?，結果見圖6。

圖6 Y-10與出發(fā)菌正常搖瓶發(fā)酵參數(shù)驗證Fig.6 Verification of normal shaking flask fermentation parameters between Y-10 and the original strain

如圖6 a所示，Y-10納他霉素產(chǎn)量于發(fā)酵144 h達最高，為5.30 g/L，較出發(fā)菌株提高14.97%。如圖6 b所示，Y-10發(fā)酵前期生物量增長速度較出發(fā)菌快，生物量于發(fā)酵96 h達最大，為31.85 g/L，較出發(fā)菌株提高11.96%。如圖6 c所示，Y-10前期生物量快速提高，pH值隨之快速降低，于發(fā)酵24 h即降至最低5.26。此外Y-10較出發(fā)菌耗糖速度加快。說明Y-10在正常條件下顯示出了較強的生長活力。

2.2 5 L發(fā)酵罐驗證

2.2.1 不控制pH值條件下5 L發(fā)酵罐驗證

Y-10與出發(fā)菌28℃，220 r/min種子培養(yǎng)48 h后按照1.5.3中的5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)方法，在不控制pH值條件下比較Y-10與出發(fā)菌pH值、生物量和納他霉素產(chǎn)量變化，結果見圖7。

圖7 Y-10與出發(fā)菌不控制pH值5 L發(fā)酵罐驗證Fig.7 Verification of 5 L fermenter between Y-10 and the original strain without controlling pH value

如圖7a所示，Y-10菌株pH值于發(fā)酵60 h自然降低至4.83，而出發(fā)菌于發(fā)酵36 h自然降低至4.64后開始上升，且整個發(fā)酵過程中Y-10整體pH值較出發(fā)菌更高，因此判斷Y-10可有效減少堿的消耗。如圖7b所示，Y-10在pH值自然變化條件下生物量明顯提高，生物量最高達到32.40 g/L，較出發(fā)菌提高56.22%。但圖7c所示納他霉素產(chǎn)量較出發(fā)菌明顯降低，納他霉素最高產(chǎn)量僅為5.58 g/L。Y-10生物量的提高再次證明了其較好的耐酸特性。繼續(xù)對Y-10控制pH6.3進行5 L發(fā)酵罐驗證，觀察其納他霉素產(chǎn)量和生物量等的變化。

2.2.2 控制pH6.3條件下5 L發(fā)酵罐驗證

對菌株Y-10與出發(fā)菌在初始pH7.4之后控制pH6.3條件下比較其納他霉素產(chǎn)量與生物量，并計算其耗堿量，結果見圖8。此外，Y-10在發(fā)酵過程中菌體異常上浮Y-10與出發(fā)菌正常條件下5 L發(fā)酵罐96 h取樣圖見圖9。

圖8 Y-10與出發(fā)菌正常條件下5 L發(fā)酵罐驗證Fig.8 Verification of 5 L fermenter between Y-10 and the original strain under normal conditions

圖9 Y-10與出發(fā)菌正常條件下5 L發(fā)酵罐96 h取樣Fig.9 Sample plot of Y-10 and the original strain at 96 h in the 5 L fermenter under normal conditions

如圖8 a所示Y-10發(fā)酵前期，生物量增長速度較出發(fā)菌更快，且到發(fā)酵后期生物量最大值較出發(fā)菌株提高10.65%。但如圖8 b所示，Y-10納他霉素積累遠低于出發(fā)菌且與不控制pH值的5 L發(fā)酵罐納他霉素產(chǎn)量接近。原因可能是Y-10在發(fā)酵過程中菌體異常上?。▓D9），導致菌體與培養(yǎng)基接觸面積小，不能充分利用碳源和氮源。在發(fā)酵過程中，需要通過流加2 mol/L氫氧化鈉維持pH值為6.3。整個發(fā)酵過程中，Y-10共耗堿290 mL，相較出發(fā)菌少消耗350 mL，說明Y-10可有效減少堿的消耗。

2.3 突變株Y-10的遺傳穩(wěn)定性分析

采用斜面?zhèn)鞔椒▽-10菌株進行連續(xù)15代的培養(yǎng)，再分別將活化的各代菌株在28℃搖床內發(fā)酵培養(yǎng)120 h，測定其納他霉素產(chǎn)量及生物量，結果見圖10。

圖10 Y-10遺傳穩(wěn)定性驗證Fig.10 Verification of genetic stability of Y-10

如圖10所示，Y-10納他霉素產(chǎn)量在正常搖瓶條件下基本穩(wěn)定在5.50 g/L左右（圖10 a），生物量穩(wěn)定在31.00 g/L左右（圖10 b）。說明其生產(chǎn)性能穩(wěn)定。

2.4 突變株Y-10耐酸機制

2.4.1 發(fā)酵過程中Y-10和出發(fā)菌胞內ATP比較

胞內ATP含量對于耐酸菌株的耐酸性能有重要影響，對Y-10與出發(fā)菌不同發(fā)酵時間的胞內ATP含量進行研究，結果見圖11。

圖11 Y-10與出發(fā)菌胞內ATP含量比較Fig.11 Comparison of intracellular ATPs between Y-10 and the original strain

如圖11所示，出發(fā)菌在發(fā)酵12 h～36 h，胞內ATP含量明顯提高，之后ATP水平趨于恒定。而Y-10在發(fā)酵過程中胞內ATP水平不斷提高，且始終高于出發(fā)菌。較高的胞內ATP水平可以為胞內H+轉運提供能量，并維持菌體在酸性環(huán)境下的正常生長。

2.4.2 菌株Y-10與出發(fā)菌脂肪酸含量比較

對Y-10與出發(fā)菌飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸相對含量進行研究，結果見圖12。

圖12 Y-10和出發(fā)菌不同脂肪酸相對含量Fig.12 Relative content of different fatty acids in Y-10 and the original strain

圖12結果表明Y-10飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的相對含量較出發(fā)菌少，且Y-10不飽和脂肪酸比例也比出發(fā)菌更低。Y-10細胞膜脂肪酸較低的不飽和度，影響了細胞膜的流動性，進而影響細胞膜物質運輸?shù)墓δ堋＜{他霉素作為胞外代謝產(chǎn)物，Y-10納他霉素產(chǎn)量較低可能是受到細胞膜流動性的影響。

3 結論

本試驗通過對納他霉素原始生產(chǎn)菌Streptomyces gilvosporeus TUST01采用ARTP誘變處理，并采用低pH值平板篩選結合24孔深孔板篩選獲得耐酸菌株Y-10。Y-10在pH4.0平板上生長良好且在不同的搖瓶發(fā)酵條件下，納他霉素產(chǎn)量和生物量都有明顯提高，說明Y-10具有較好的耐酸能力。在不控制pH值和控制pH6.3的正常5 L發(fā)酵罐條件下，Y-10都表現(xiàn)出較高的生物量，但納他霉素產(chǎn)量偏低。較高的生物量同樣證明了Y-10具有較好的耐酸能力。對Y-10的耐酸機制進行研究，通過比較Y-10與出發(fā)菌的胞內ATP水平發(fā)現(xiàn)，Y-10較出發(fā)菌株有更高的胞內ATP水平，保證了其在酸性條件下的正常生長。而通過氣相色譜-質譜技術研究發(fā)現(xiàn)Y-10細胞膜脂肪酸的不飽和度更低，可能影響了Y-10的納他霉素發(fā)酵生產(chǎn)。本文對耐酸菌株篩選及耐酸機制的部分研究可為進一步優(yōu)化耐酸菌株篩選方法及揭示耐酸機制提供一定的參考。