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        耐低pH值納他霉素生產(chǎn)菌株的誘變選育

        2022-09-28 12:55:14王鑫宇許倍銘劉陳夢吳康孫瑞杰賈士儒譚之磊
        食品研究與開發(fā) 2022年18期
        關(guān)鍵詞:耐酸發(fā)酵罐霉素

        王鑫宇,許倍銘,劉陳夢,吳康,孫瑞杰,賈士儒,譚之磊

        (天津科技大學生物工程學院,天津 300457)

        納他霉素是天然多烯大環(huán)內(nèi)脂類抗生素,分子式為C33H47NO13,分子量為665.75[1],含有4個共軛雙鍵的26元內(nèi)酯環(huán),可以與麥角甾醇基團結(jié)合,從而使真菌細胞膜變形[2],進而引起菌內(nèi)維持細胞生長的物質(zhì)滲出,最終致使細胞死亡,但對細菌沒有抑制作用[3]。納他霉素難溶于水和油脂,很難被人體消化吸收,大部分攝入的納他霉素會隨糞便排出,因此具有很高的安全性[4-5]。由于納他霉素具有優(yōu)良的抗菌性能,目前除在焙烤食品、乳酪制品、易發(fā)霉食品等食品行業(yè)上應(yīng)用外[6-7],在醫(yī)藥工業(yè)、飼料工業(yè)等領(lǐng)域也得到了越來越多的重視,臨床上現(xiàn)已用于治療皮膚真菌感染疾病、真菌性眼角膜炎等[8-9]。

        褐黃孢鏈霉菌是主要的納他霉素生產(chǎn)菌之一,褐黃孢鏈霉菌在發(fā)酵前期pH值快速下降,但酸性條件不利于菌體生長和納他霉素生產(chǎn)[10]。因此篩選耐受低pH值的菌株不僅有利于納他霉素生產(chǎn),也有利于在實際生產(chǎn)中減少耗堿量,降低生產(chǎn)過程中粗放操作對發(fā)酵產(chǎn)量造成的影響。Zhang等[11]等以干酪乳桿菌為出發(fā)菌,在pH4.3的酸性條件下適應(yīng)性進化70 d得到的進化株,搖瓶發(fā)酵64 h,生物量較出發(fā)菌提高60%以上。Nyabako等[12]通過常壓室溫等離子體誘變結(jié)合酸適應(yīng)進化,有效提高了嗜酸乳桿菌的耐酸能力。突變株LAartp-ale2在pH3.0和pH2.5的酸性條件下存活率顯著提高。目前影響鏈霉菌耐酸性的相關(guān)報道較少。但在部分革蘭氏陽性菌中已有研究表明[13],胞內(nèi)質(zhì)子(H+)的去除,細胞膜組分改變及胞內(nèi)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)含量等都會影響菌株的耐酸能力,通過將胞內(nèi)H+排出胞外可以維持胞內(nèi)pH值穩(wěn)態(tài),從而保證菌體在酸性環(huán)境中的正常生長,而這一過程需要ATP提供能量。此外ATP通常作為微生物生長和生物合成有用物質(zhì)所必需的能量來源,納他霉素生物合成酶的作用的發(fā)揮需要ATP提供能量[14]。

        本試驗以褐黃孢鏈霉菌S.gilvosporeus TUST01為出發(fā)菌,通過誘變育種結(jié)合合理地篩選方式,獲得耐低pH值突變菌株S.gilvosporeus Y-10,并對其耐酸機制進行研究。以期為降低納他霉素生產(chǎn)成本,研究鏈霉菌耐酸機制提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑

        甲醇(色譜純)、氯仿(分析純):康科德科技有限公司;氫氧化鈉(分析純):博歐特化工貿(mào)易有限公司;葡萄糖(分析純)、磷酸鹽緩沖液(分析純)、ATP檢測試劑盒:北京索萊寶生物科技有限公司。

        1.2 菌株

        納他霉素原始生產(chǎn)菌株Streptomyces gilvosporeus TUST01:天津科技大學生化工程實驗室保存。

        1.3 培養(yǎng)基

        種子培養(yǎng)基:淀粉10 g,葡萄糖10 g,黃豆餅粉10 g,蛋白胨 6 g,玉米漿 6 g,硫酸鎂 1 g,磷酸二氫鉀0.5 g,氯化鈉2 g,碳酸鈣5 g,加水定容至1 L,調(diào)節(jié)pH值為7.0。

        發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖40g,淀粉30g,牛肉膏10g,黃豆餅粉15g,酵母抽提物0.3g,蛋白胨6.3g,MgSO4·7H2O 1.0g,NaCl2g,加水定容至1L,調(diào)節(jié)pH值為4.4和7.4。

        斜面培養(yǎng)基:淀粉10g,葡萄糖10g,黃豆餅粉10g,酵母粉3 g,麥芽粉3 g,硫酸鎂1 g,磷酸氫二鉀0.5 g,氯化鈉2 g,碳酸鈣3 g,瓊脂20 g,加水定容至1 L,調(diào)節(jié)pH值為7.0。

        低pH值固體篩選培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基,pH值調(diào)整為4.0。

        以上培養(yǎng)基均使用121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

        1.4 儀器與設(shè)備

        BASIC紫外分光光度計:德國Eppendorf公司;SBA-400E生物傳感分析儀:山東省科學院生物研究所;BIOTECH-5BG-7000A 5 L發(fā)酵罐:上海保興生物設(shè)備工程有限公司;ARTP-Ⅱ常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng):北京思清源生物科技有限公司;Infinite 200PRO多功能酶標儀:帝肯貿(mào)易有限公司。

        1.5 方法

        1.5.1 菌株活化

        在超凈臺中無菌條件下打開保藏菌種干粉的安瓿管,在其中加入1mL0.9%無菌生理鹽水,使用移液槍吹吸使菌種干粉在生理鹽水中混合均勻。吸取200 μL菌液加入到100 mL種子培養(yǎng)基中,平行3份。將種子培養(yǎng)基在28℃、220 r/min的搖床中培養(yǎng)48 h。

        使用無菌接種環(huán)在菌種的復(fù)蘇種子培養(yǎng)基中挑菌,在固體培養(yǎng)基平板上三區(qū)劃線,平行3份,29℃恒溫培養(yǎng)5 d~7 d直至菌種表面產(chǎn)生孢子。

        1.5.2 常壓室溫等離子體誘變(atmospheric and roomtemperature plasma,ARTP)

        用無菌生理鹽水沖洗S.gilvosporeus TUST01斜面上生長良好的孢子,置于裝有玻璃珠的250 mL三角瓶中,220 r/min振蕩打散30 min后用濾膜過濾,調(diào)整孢子懸浮液濃度約為108CFU/mL。取10 μL孢子懸浮液于無菌金屬載片上,放置于ARTP-Ⅱ常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)處理臺座,在電源功率40 W,照射距離2 mm,氣流量10 L/min條件下對菌懸液進行50 s的誘變處理[15],此時致死率為90%(正突變率最高)[16]。照射后,將金屬載片放入裝有1 mL無菌生理鹽水的離心管中振蕩1 min,再用生理鹽水稀釋后涂布于pH4.0的低pH值篩選平板,29℃培養(yǎng)5 d~10 d至突變株單菌落孢子絲生長良好。

        1.5.3 耐酸菌株篩選

        將pH4.0篩選平板上的突變株接種于24孔深孔板,每孔含3 mL種子培養(yǎng)基,用透氣封板膜密封后28℃,220 r/min于搖床振蕩48 h。之后取培養(yǎng)液以8%接種量接種于同樣的裝有3 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的24孔深孔板中,搖床發(fā)酵96 h后吸取200 μL發(fā)酵液于96孔板中,4 000 r/min離心10 min,之后取40 μL上清液于新的96孔板中,以70%甲醇適當稀釋后置于酶標儀測定OD303值[17],挑選OD303值較高的菌株進行平板驗證,并進行搖瓶復(fù)篩及5 L發(fā)酵罐驗證。

        5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)方法:初始裝液量3 L,121℃高壓蒸汽滅菌20 min,28℃,220 r/min種子培養(yǎng)48 h,種子接種量15%,初始攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min,罐壓0.1 MPa,通氣量1∶1,溫度28℃,關(guān)聯(lián)溶氧與轉(zhuǎn)速以控制溶氧量在30%,流加80%葡萄糖以控制葡萄糖含量為20 g/L。定時取樣測定發(fā)酵液的殘?zhí)荹18]、生物量[19]和納他霉素產(chǎn)量[20]。在此條件下通過控制不同的pH值條件以比較出發(fā)菌與篩選菌株的生長和納他霉素生產(chǎn)情況[21]。

        1.5.4 遺傳穩(wěn)定性

        將復(fù)篩選出的菌株在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)接15代,挑取各代菌株進行搖瓶發(fā)酵試驗,測定其生物量和納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量[22]。

        1.5.5 胞內(nèi)ATP含量測定

        根據(jù)ATP檢測試劑盒說明書的方法測定胞內(nèi)ATP 濃度[23]。

        1.5.6 細胞膜脂肪酸含量測定

        參照Bo等[24]的方法,發(fā)酵液離心棄上清液后,用磷酸鹽緩沖液反復(fù)洗滌菌體細胞兩次,經(jīng)液氮淬滅、提取液提取小分子物質(zhì)、甲基化和硅烷化后,取上清液進行氣相色譜-質(zhì)譜 (gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)檢測。

        氣相色譜條件:HP-5MS色譜柱(60 m×0.25 mm,0.25μm);升溫程序為進樣后70℃保持2min,以5℃/min的速度升溫到290℃,保持3min,再降溫到70℃。運行時間為52 min;載氣為高純氦氣,恒定流速為1 mL/min;接口溫度280℃。

        質(zhì)譜條件:電子轟擊電離;離子源溫度為250℃;離子電流為40 μA;電子轟擊能量為70 eV;掃描質(zhì)量范圍 m/z為 50~800。

        1.6 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

        數(shù)據(jù)分析采用費舍爾最小顯著差異法,P<0.05表示差異顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 突變株的篩選

        2.1.1 初篩

        通過pH4.0篩選平板的篩選獲得了420株突變菌株。按照1.5.3中的24孔深孔板篩選方法,根據(jù)納他霉素產(chǎn)量篩選耐受pH4.4的菌株,耐低pH值菌株納他霉素產(chǎn)量散點圖見圖1。

        圖1 耐低pH值菌株納他霉素產(chǎn)量散點圖Fig.1 Scatter plot of natamycin yield of strains with low pH resistance

        由圖1可知,206株突變株的納他霉素與出發(fā)菌有顯著差異,即與出發(fā)菌納他霉素產(chǎn)量偏差超過±10%,突變率為49.05%。73株突變株較出發(fā)菌納他霉素產(chǎn)量提高,正突變率達17.38%。其中6株突變株納他霉素產(chǎn)量較高,菌株編號為Y-10,Y-226,Y-348,Y-354,Y-390以及Y-420,對6株菌株做進一步平板及搖瓶驗證。

        2.1.2 篩選菌株平板生長驗證

        對篩選菌株進行平板生長驗證,如圖2所示。

        圖2 篩選菌株平板驗證圖Fig.2 Plate verification of screened strains

        由圖2可知,篩選菌株中Y-10生長最為旺盛,此外Y-354,Y-390以及Y-420孢子發(fā)育良好,但菌落覆蓋范圍不完整。而Y-226與Y-348菌株外觀形態(tài)異常,菌絲生長緩慢。其中Y-226只長菌但孢子完全未萌發(fā),而Y-348僅有部分區(qū)域孢子萌發(fā)且發(fā)育較差??梢姾Y選菌株中Y-10耐酸效果最好,結(jié)合其較高的納他霉素產(chǎn)量對Y-10進行進一步平板驗證,觀察其在pH4.4和pH7.4固體平板上不同培養(yǎng)時間的生長情況,結(jié)果見圖3。

        圖3 Y-10與出發(fā)菌TUST01在不同pH值平板上的生長圖Fig.3 Growth of Y-10 and TUST01 at different pH plates

        由圖3可知,出發(fā)菌在pH4.4的低pH值平板上不生長,而Y-10菌株生長旺盛,可見其具有較強的耐酸能力。此外,Y-10較出發(fā)菌在pH7.4的平板上培養(yǎng)前期生長更旺盛,到培養(yǎng)中期兩株鏈霉菌孢子發(fā)育良好,而到后期Y-10菌株孢子變灰而出發(fā)菌孢子偏灰白色。

        2.1.3 搖瓶復(fù)篩

        2.1.3.1 pH4.4搖瓶復(fù)篩

        6株突變株在24孔深孔板低pH值發(fā)酵培養(yǎng)基篩選條件下納他霉素產(chǎn)量較高(圖1),對6株突變株進行pH4.4搖瓶復(fù)篩,結(jié)果見圖4。

        圖4 耐低pH值菌株于pH4.4條件下納他霉素產(chǎn)量和生物量驗證Fig.4 Yield and biomass verification of the strain with low pH resistance at pH4.4 shaking flask

        如圖4a所示,Y-10在pH4.4條件下納他霉素產(chǎn)量最高,于發(fā)酵132 h達最大值4.08 g/L,較出發(fā)菌TUST01提高48.36%。如圖4b所示,Y-10于搖瓶發(fā)酵生物量最大值為20.89 g/L,較出發(fā)菌提高42.11%,與納他霉素產(chǎn)量具有高度一致性。此外Y-226由于在平板上未產(chǎn)孢子,其在pH4.4搖瓶發(fā)酵條件下菌株難以生長,納他霉素產(chǎn)量極低。因此選擇Y-10作為優(yōu)選耐酸菌株進行下一步研究。

        將經(jīng)過ARTP誘變及24孔深孔板初篩得到的在低pH值條件下納他霉素產(chǎn)量較高的Y-10菌株與出發(fā)菌TUST01在pH4.4搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中pH值和殘?zhí)沁M行比較,結(jié)果見圖5。

        圖5 Y-10與出發(fā)菌TUST01于pH4.4條件下?lián)u瓶發(fā)酵參數(shù)比較Fig.5 Comparison of shaking flask fermentation parameters between Y-10 and the original strain at pH4.4

        圖5 a表明兩株菌在低pH值條件下pH值都呈現(xiàn)出先升高后降低再升高的趨勢,可能是由于發(fā)酵初期菌體出于滿足細胞生長的要求,通過自身代謝調(diào)整pH值至近中性(5.63~5.77)。之后菌體生長產(chǎn)酸導(dǎo)致pH值降低,但是降低幅度很小。最后菌體自溶,堿性物質(zhì)流出導(dǎo)致pH值上升。圖5 b顯示出兩株菌的耗糖速度相當。由于Y-10較高的納他霉素產(chǎn)量和生物量,確定Y-10可以耐受低pH值的條件,為了達到后期篩選耐受低pH值菌株以及減少發(fā)酵過程中堿的消耗的目的,還需對Y-10進行pH7.4的正常搖瓶發(fā)酵驗證。

        2.1.3.2 正常條件搖瓶復(fù)篩

        對Y-10于pH7.4搖瓶條件下進行驗證,比較Y-10與出發(fā)菌納他霉素產(chǎn)量、生物量、pH值及殘?zhí)亲兓?,結(jié)果見圖6。

        圖6 Y-10與出發(fā)菌正常搖瓶發(fā)酵參數(shù)驗證Fig.6 Verification of normal shaking flask fermentation parameters between Y-10 and the original strain

        如圖6 a所示,Y-10納他霉素產(chǎn)量于發(fā)酵144 h達最高,為5.30 g/L,較出發(fā)菌株提高14.97%。如圖6 b所示,Y-10發(fā)酵前期生物量增長速度較出發(fā)菌快,生物量于發(fā)酵96 h達最大,為31.85 g/L,較出發(fā)菌株提高11.96%。如圖6 c所示,Y-10前期生物量快速提高,pH值隨之快速降低,于發(fā)酵24 h即降至最低5.26。此外Y-10較出發(fā)菌耗糖速度加快。說明Y-10在正常條件下顯示出了較強的生長活力。

        2.2 5 L發(fā)酵罐驗證

        2.2.1 不控制pH值條件下5 L發(fā)酵罐驗證

        Y-10與出發(fā)菌28℃,220 r/min種子培養(yǎng)48 h后按照1.5.3中的5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)方法,在不控制pH值條件下比較Y-10與出發(fā)菌pH值、生物量和納他霉素產(chǎn)量變化,結(jié)果見圖7。

        圖7 Y-10與出發(fā)菌不控制pH值5 L發(fā)酵罐驗證Fig.7 Verification of 5 L fermenter between Y-10 and the original strain without controlling pH value

        如圖7a所示,Y-10菌株pH值于發(fā)酵60 h自然降低至4.83,而出發(fā)菌于發(fā)酵36 h自然降低至4.64后開始上升,且整個發(fā)酵過程中Y-10整體pH值較出發(fā)菌更高,因此判斷Y-10可有效減少堿的消耗。如圖7b所示,Y-10在pH值自然變化條件下生物量明顯提高,生物量最高達到32.40 g/L,較出發(fā)菌提高56.22%。但圖7c所示納他霉素產(chǎn)量較出發(fā)菌明顯降低,納他霉素最高產(chǎn)量僅為5.58 g/L。Y-10生物量的提高再次證明了其較好的耐酸特性。繼續(xù)對Y-10控制pH6.3進行5 L發(fā)酵罐驗證,觀察其納他霉素產(chǎn)量和生物量等的變化。

        2.2.2 控制pH6.3條件下5 L發(fā)酵罐驗證

        對菌株Y-10與出發(fā)菌在初始pH7.4之后控制pH6.3條件下比較其納他霉素產(chǎn)量與生物量,并計算其耗堿量,結(jié)果見圖8。此外,Y-10在發(fā)酵過程中菌體異常上浮Y-10與出發(fā)菌正常條件下5 L發(fā)酵罐96 h取樣圖見圖9。

        圖8 Y-10與出發(fā)菌正常條件下5 L發(fā)酵罐驗證Fig.8 Verification of 5 L fermenter between Y-10 and the original strain under normal conditions

        圖9 Y-10與出發(fā)菌正常條件下5 L發(fā)酵罐96 h取樣Fig.9 Sample plot of Y-10 and the original strain at 96 h in the 5 L fermenter under normal conditions

        如圖8 a所示Y-10發(fā)酵前期,生物量增長速度較出發(fā)菌更快,且到發(fā)酵后期生物量最大值較出發(fā)菌株提高10.65%。但如圖8 b所示,Y-10納他霉素積累遠低于出發(fā)菌且與不控制pH值的5 L發(fā)酵罐納他霉素產(chǎn)量接近。原因可能是Y-10在發(fā)酵過程中菌體異常上浮(圖9),導(dǎo)致菌體與培養(yǎng)基接觸面積小,不能充分利用碳源和氮源。在發(fā)酵過程中,需要通過流加2 mol/L氫氧化鈉維持pH值為6.3。整個發(fā)酵過程中,Y-10共耗堿290 mL,相較出發(fā)菌少消耗350 mL,說明Y-10可有效減少堿的消耗。

        2.3 突變株Y-10的遺傳穩(wěn)定性分析

        采用斜面?zhèn)鞔椒▽-10菌株進行連續(xù)15代的培養(yǎng),再分別將活化的各代菌株在28℃搖床內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)120 h,測定其納他霉素產(chǎn)量及生物量,結(jié)果見圖10。

        圖10 Y-10遺傳穩(wěn)定性驗證Fig.10 Verification of genetic stability of Y-10

        如圖10所示,Y-10納他霉素產(chǎn)量在正常搖瓶條件下基本穩(wěn)定在5.50 g/L左右(圖10 a),生物量穩(wěn)定在31.00 g/L左右(圖10 b)。說明其生產(chǎn)性能穩(wěn)定。

        2.4 突變株Y-10耐酸機制

        2.4.1 發(fā)酵過程中Y-10和出發(fā)菌胞內(nèi)ATP比較

        胞內(nèi)ATP含量對于耐酸菌株的耐酸性能有重要影響,對Y-10與出發(fā)菌不同發(fā)酵時間的胞內(nèi)ATP含量進行研究,結(jié)果見圖11。

        圖11 Y-10與出發(fā)菌胞內(nèi)ATP含量比較Fig.11 Comparison of intracellular ATPs between Y-10 and the original strain

        如圖11所示,出發(fā)菌在發(fā)酵12 h~36 h,胞內(nèi)ATP含量明顯提高,之后ATP水平趨于恒定。而Y-10在發(fā)酵過程中胞內(nèi)ATP水平不斷提高,且始終高于出發(fā)菌。較高的胞內(nèi)ATP水平可以為胞內(nèi)H+轉(zhuǎn)運提供能量,并維持菌體在酸性環(huán)境下的正常生長。

        2.4.2 菌株Y-10與出發(fā)菌脂肪酸含量比較

        對Y-10與出發(fā)菌飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸相對含量進行研究,結(jié)果見圖12。

        圖12 Y-10和出發(fā)菌不同脂肪酸相對含量Fig.12 Relative content of different fatty acids in Y-10 and the original strain

        圖12結(jié)果表明Y-10飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的相對含量較出發(fā)菌少,且Y-10不飽和脂肪酸比例也比出發(fā)菌更低。Y-10細胞膜脂肪酸較低的不飽和度,影響了細胞膜的流動性,進而影響細胞膜物質(zhì)運輸?shù)墓δ堋<{他霉素作為胞外代謝產(chǎn)物,Y-10納他霉素產(chǎn)量較低可能是受到細胞膜流動性的影響。

        3 結(jié)論

        本試驗通過對納他霉素原始生產(chǎn)菌Streptomyces gilvosporeus TUST01采用ARTP誘變處理,并采用低pH值平板篩選結(jié)合24孔深孔板篩選獲得耐酸菌株Y-10。Y-10在pH4.0平板上生長良好且在不同的搖瓶發(fā)酵條件下,納他霉素產(chǎn)量和生物量都有明顯提高,說明Y-10具有較好的耐酸能力。在不控制pH值和控制pH6.3的正常5 L發(fā)酵罐條件下,Y-10都表現(xiàn)出較高的生物量,但納他霉素產(chǎn)量偏低。較高的生物量同樣證明了Y-10具有較好的耐酸能力。對Y-10的耐酸機制進行研究,通過比較Y-10與出發(fā)菌的胞內(nèi)ATP水平發(fā)現(xiàn),Y-10較出發(fā)菌株有更高的胞內(nèi)ATP水平,保證了其在酸性條件下的正常生長。而通過氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)Y-10細胞膜脂肪酸的不飽和度更低,可能影響了Y-10的納他霉素發(fā)酵生產(chǎn)。本文對耐酸菌株篩選及耐酸機制的部分研究可為進一步優(yōu)化耐酸菌株篩選方法及揭示耐酸機制提供一定的參考。

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