洪飛若 俞雪芬 金慧 陸燁 普睿 錢(qián)清

口腔綜合治療椅水路系統(tǒng)(dental unit waterlines，DUWLs)因治療回吸等原因?qū)е鹿艿纼?nèi)壁細(xì)菌生物膜形成而污染診療用水[1]，使得口腔診療存在院內(nèi)感染的風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。各級(jí)各類(lèi)口腔醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)定期對(duì)診療用水進(jìn)行微生物檢測(cè)，并實(shí)施有效的處理措施[4-6]。我國(guó)對(duì)口腔醫(yī)療機(jī)構(gòu)診療用水的檢測(cè)方法與標(biāo)準(zhǔn)要求均參照生活飲用水[7-8]，其微生物檢測(cè)方法采用的是營(yíng)養(yǎng)瓊脂(nutrient agar，NA)培養(yǎng)基，37 ℃、48 h培養(yǎng)后計(jì)菌落數(shù)，合格標(biāo)準(zhǔn)為≤100(CFU/mL)。而歐美等國(guó)家采用的是R2A(Reasoner's 2 agar)培養(yǎng)基[9]，經(jīng)20～25 ℃培養(yǎng)120～168 h后計(jì)菌落數(shù)，合格標(biāo)準(zhǔn)為≤500 CFU/mL[10]。本研究通過(guò)采用兩種培養(yǎng)基平行培養(yǎng)口腔診療用水水樣的方法，比較分析兩者之間的培養(yǎng)結(jié)果，為口腔診療用水微生物培養(yǎng)探索合適的方法。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與材料

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱)；R2A培養(yǎng)基(北京陸橋)；一次性培養(yǎng)皿、渦旋振蕩儀、生理鹽水、離心管、接種環(huán)、移液器、恒溫培養(yǎng)箱、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS，VITEK?MS, 法國(guó))。

1.2 樣本來(lái)源與采樣方法

選取浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院8 個(gè)科室24 臺(tái)牙椅，采樣時(shí)間段為上午8：30～9：00，采樣點(diǎn)選擇每臺(tái)牙椅的牙科手機(jī)連接管、三用槍和漱口處。放水沖洗管路30 s后各樣本均取10 mL，每個(gè)出水端分別采集3 個(gè)樣本，共采集水樣216 份。同一部位的水樣編寫(xiě)同一個(gè)序號(hào)，隨機(jī)分為3 組，分別送至3 個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行平行培養(yǎng)檢測(cè)。所有水樣采集后立即儲(chǔ)存于4 ℃轉(zhuǎn)運(yùn)箱，4 h內(nèi)完成平板接種。

1.3 菌落培養(yǎng)和計(jì)數(shù)

每份水樣采用傾注法分別于NA和R2A培養(yǎng)基各接種1 mL。NA培養(yǎng)基稀釋一個(gè)梯度接種，37 ℃下培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。因R2A培養(yǎng)基培養(yǎng)菌落數(shù)可能較NA培養(yǎng)基多，為得到可分辨的計(jì)數(shù)結(jié)果，因此分別稀釋1 個(gè)梯度和2 個(gè)梯度接種于R2A培養(yǎng)基，25 ℃下培養(yǎng)120 h。2 種方法均進(jìn)行一份平行接種，并且設(shè)置空白對(duì)照。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)均參照國(guó)家生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[7]，即菌落計(jì)數(shù)≤100 CFU/mL為合格。

1.4 菌種檢測(cè)

隨機(jī)抽取96 份菌落計(jì)數(shù)結(jié)果不合格的培養(yǎng)皿，兩種培養(yǎng)方法各48 份。使用一次性接種環(huán)選取同一培養(yǎng)皿上形態(tài)各異的單個(gè)菌落涂布于質(zhì)譜儀靶板上，每個(gè)細(xì)菌靶點(diǎn)添加1 μL VITKE MS-CHCA基質(zhì)液。待干后采用質(zhì)譜儀對(duì)不同培養(yǎng)基中的菌種進(jìn)行鑒定，質(zhì)控菌株為大腸桿菌(ATCC-8739)。將所測(cè)得樣本細(xì)菌的質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)中所有參考圖譜進(jìn)行比對(duì)得到最終結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)雙盲錄入后應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料采用四分位數(shù)描述，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果差異采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)進(jìn)行分析，不同培養(yǎng)方法檢測(cè)樣本合格數(shù)量和機(jī)會(huì)性致病菌檢出率的比較采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)及Kappa一致性檢驗(yàn)進(jìn)行分析。三處采集點(diǎn)菌落計(jì)數(shù)的差異采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于菌落計(jì)數(shù)呈非正態(tài)分布，因此對(duì)兩組菌落計(jì)數(shù)(CFU/mL)取對(duì)數(shù)，計(jì)算所得Log10(菌落計(jì)數(shù))，采用Bland-Altman圖分析評(píng)價(jià)兩種培養(yǎng)方法的一致性。

2 結(jié) 果

2.1 2 種培養(yǎng)基菌落計(jì)數(shù)結(jié)果分析

本研究采集216 份口腔診療用水樣本，使用NA培養(yǎng)基和R2A培養(yǎng)基，在37 ℃和25 ℃條件下培養(yǎng)48和120 h，共檢測(cè)樣本432 份。培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并計(jì)算同一平行樣本的平均值為最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

由表1可知，同一水樣由R2A培養(yǎng)基檢出的結(jié)果中位數(shù)較NA培養(yǎng)基顯著增加，兩者比值為20.56。Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示兩組結(jié)果的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，分別對(duì)不同部位的菌落計(jì)數(shù)進(jìn)行對(duì)比，均顯示兩種培養(yǎng)方法結(jié)果的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

表1 口腔綜合治療臺(tái)不同部位和不同培養(yǎng)基培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)的對(duì)比

配對(duì)卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示，采用McNemar精確檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩組培養(yǎng)結(jié)果合格率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，Kappa值=0.207，屬于一致性較差(表2)。

表2 兩種培養(yǎng)方法檢出結(jié)果的合格情況

2.2 檢出菌種構(gòu)成比較

NA培養(yǎng)基共檢出6 科、26 株機(jī)會(huì)性致病菌，R2A培養(yǎng)基共檢出5 科、53 株機(jī)會(huì)性致病菌，檢出率分別為47.92%(23/48)和66.67%(32/48)，兩者之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.211)，Kappa值=-0.685，屬于一致性較差，檢出菌株均為革蘭氏陰性菌(表3)。

表3 口腔診療用水檢出菌種構(gòu)成的比較

2.3 Bland-Altman分析進(jìn)行一致性比較

以檢出菌落計(jì)數(shù)對(duì)數(shù)值的均值為橫坐標(biāo)，檢出菌落計(jì)數(shù)對(duì)數(shù)值的差值為縱坐標(biāo)，菌落計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)值差值在坐標(biāo)系中以點(diǎn)的形式表示，做直線Y=D±1.96*SD劃定一致性上限和下限，繪制Bland-Altman分析圖(圖1)。其中藍(lán)色虛線為95%一致性界限，紅色實(shí)線為菌落計(jì)數(shù)對(duì)數(shù)值差值的均數(shù)，黑色實(shí)線為0刻度線。

圖1 Bland-Altman 圖比較不同培養(yǎng)方法的一致性

結(jié)果顯示，2.78%(6/216)的點(diǎn)分布在一致性界限之外，菌落計(jì)數(shù)對(duì)數(shù)值差值的均數(shù)為1.14(轉(zhuǎn)換為菌落計(jì)數(shù)=13.80 CFU/mL)，一致性上限為2.898(790.68 CFU/mL)，下限為-0.617(0.24 CFU/mL)，差值上下限范圍為790.44 CFU/mL，為臨床無(wú)法接受的差值范圍。98.15%(212/216)的點(diǎn)在0刻度線以上，表示98.15%的R2A培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果較NA培養(yǎng)結(jié)果高。綜上所述，兩者一致性較差，不能相互代替使用。

2.4 不同采樣部位菌落計(jì)數(shù)比較

Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)結(jié)果顯示：3 個(gè)部位的水樣通過(guò)NA培養(yǎng)所得的菌落計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=1.829，P=0.401)，但R2A培養(yǎng)所得3 個(gè)部位的水樣菌落計(jì)數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=8.394，P=0.015)。然而，進(jìn)一步兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，僅三用槍出水與漱口水的結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(校正后P=0.026)，手機(jī)連接管出水與三用槍出水的校正后P值為1.000，漱口水與手機(jī)連接管出水校正后的P值為0.052。

3 討 論

口腔綜合治療椅水路系統(tǒng)的微生物污染問(wèn)題已成為口腔醫(yī)護(hù)人員的共識(shí)，未經(jīng)處理的水存在大量的致病菌[11-13]，如嗜肺軍團(tuán)菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、非結(jié)核分枝桿菌等。污染的診療用水通過(guò)牙科手機(jī)、三用槍等形成氣溶膠，將醫(yī)護(hù)人員及患者置于被感染的風(fēng)險(xiǎn)中。有研究者從牙科手術(shù)過(guò)程中產(chǎn)生的水和氣溶膠中檢測(cè)到高水平的細(xì)菌內(nèi)毒素[14]。因此，定期檢測(cè)并有效降低DUWLs中的細(xì)菌水平有重要意義。

細(xì)菌培養(yǎng)是監(jiān)測(cè)醫(yī)療用水水質(zhì)、評(píng)估微生物污染程度的基本方法。目前我國(guó)口腔診療機(jī)構(gòu)基本采用富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)，即營(yíng)養(yǎng)瓊脂37 ℃、48 h培養(yǎng)；而歐美等則采用貧營(yíng)養(yǎng)的R2A培養(yǎng)基20～28 ℃、5～7 d培養(yǎng)[9]。對(duì)于水生細(xì)菌而言，最理想的生長(zhǎng)條件是營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)較貧乏的培養(yǎng)基和與室溫接近的環(huán)境溫度[15]；富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基則會(huì)抑制水體中生長(zhǎng)緩慢或處于受損狀態(tài)的細(xì)菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致菌落計(jì)數(shù)偏低而影響感控管理的決策。除此之外，由于DUWLs多使用含氯消毒劑進(jìn)行定期消毒，而R2A培養(yǎng)基中的丙酮酸鈉成分能將受到含氯消毒劑損傷的存活細(xì)菌復(fù)蘇，并在適宜條件下生長(zhǎng)形成菌落[16]。因此，相較富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，R2A培養(yǎng)基能夠提高水生細(xì)菌檢測(cè)的靈敏度，尤其是經(jīng)含氯消毒液處理后的水體。本研究細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果證實(shí)，同一水樣分別用R2A培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，前者檢出的菌落數(shù)明顯高于后者，且兩者一致性較差。目前國(guó)內(nèi)尚未有相關(guān)規(guī)范要求使用R2A培養(yǎng)基檢測(cè)口腔診療用水，但已有研究證明了R2A培養(yǎng)基對(duì)血液透析用水和制藥用水微生物污染水平檢測(cè)的有效性[17-18]。本研究結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明R2A培養(yǎng)基對(duì)醫(yī)療用水微生物檢測(cè)的必要性。

菌種鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表3)，R2A培養(yǎng)基對(duì)機(jī)會(huì)性致病菌的檢出率高于NA培養(yǎng)基，但兩者間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能原因?yàn)闄z測(cè)樣本的數(shù)量較小，后續(xù)研究可加大樣本量的致病菌檢測(cè)。R2A培養(yǎng)基中檢出率最高的藤澤甲基桿菌在NA培養(yǎng)中未被檢出。甲基桿菌屬適宜在水中生長(zhǎng)，易黏附于管道表面形成生物膜[19]，是引起醫(yī)療機(jī)構(gòu)相關(guān)性感染的條件病原體之一。有報(bào)道稱(chēng)多例骨髓移植術(shù)后患者因使用甲基桿菌屬污染的自來(lái)水漱口導(dǎo)致嗜中性支原體引起的血液感染發(fā)生[20]。貪銅菌和少動(dòng)鞘氨醇單胞菌在R2A培養(yǎng)樣本的檢出率同樣高于NA培養(yǎng)。貪銅菌是一種非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，易引起免疫功能低下的人群感染。國(guó)外曾報(bào)道1 例由少見(jiàn)貪銅菌引起的幼兒肺炎[21]，我國(guó)學(xué)者也曾報(bào)道一例由耐金屬貪銅菌感染引起的嬰兒脾臟多發(fā)膿腫[22]。另外，鞘氨醇單胞菌屬被證明能夠在各種輸水管道(例如DUWLs)內(nèi)壁形成生物膜，而少動(dòng)鞘氨醇單胞菌則被認(rèn)為是該菌屬的主要條件致病菌，能引起液體相關(guān)的感染[23]。Santarelli等[24]曾報(bào)道1 例由少動(dòng)鞘氨醇單胞菌感染導(dǎo)致的口腔潰瘍，進(jìn)而引起發(fā)熱，這提示該細(xì)菌有可能通過(guò)口腔途徑傳播引起全身性感染的風(fēng)險(xiǎn)。雖然本研究未檢測(cè)出非結(jié)核分枝桿菌，但有文獻(xiàn)報(bào)道3 例因感染牙椅水路定植的非結(jié)核分枝桿菌而引起的牙源性面部竇道[25]，同樣說(shuō)明單一的NA培養(yǎng)不能滿(mǎn)足口腔診療用水微生物的檢測(cè)。本研究結(jié)果表明目前我國(guó)口腔診療用水的NA培養(yǎng)方式不利于條件致病菌的檢出，因此，有必要將R2A培養(yǎng)作為口腔診療用水微生物檢測(cè)的常規(guī)培養(yǎng)方式，以期更準(zhǔn)確地評(píng)估口腔診療用水的細(xì)菌污染情況和制定相應(yīng)的干預(yù)措施。另外，R2A培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果明顯高于NA培養(yǎng)基，美國(guó)CDC制定的≤500 CFU/mL的合格標(biāo)準(zhǔn)可能更符合臨床實(shí)際情況，但由于水生細(xì)菌在不同地域分布情況有所不同，因此采用R2A培養(yǎng)基的情況下應(yīng)探討制定更符合臨床實(shí)際的菌落總數(shù)限值。

本研究發(fā)現(xiàn)接受定期消毒措施的DUWLs仍存在一定程度的微生物污染情況(表1)。比較不同部位水樣的菌落計(jì)數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)通過(guò)NA培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與以往報(bào)道結(jié)果相似[26]。但在對(duì)通過(guò)R2A培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落計(jì)數(shù)進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)三個(gè)部位的菌落計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能原因?yàn)镹A培養(yǎng)基培養(yǎng)所得結(jié)果普遍低估水樣中真實(shí)細(xì)菌總數(shù)，各數(shù)值之間的差距不足以造成顯著性差異。通過(guò)事后兩兩比較發(fā)現(xiàn)僅三用槍出水與漱口水之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析認(rèn)為可能與漱口水不存在回吸但存在水生微生物污染有關(guān)。另外，為了減少實(shí)驗(yàn)影響因素，本研究在進(jìn)行兩種培養(yǎng)方法時(shí)統(tǒng)一采取較簡(jiǎn)便的傾注法接種樣本。有研究表明[27]，不同的接種方法、溫度和培養(yǎng)時(shí)間均會(huì)對(duì)水樣中細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。因此，下一步研究可以探討R2A培養(yǎng)條件下，不同接種方式(包括傾注法、涂布法和薄膜過(guò)濾法)，不同溫度(20～28℃)和不同培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)(5～7 d)對(duì)口腔診療用水中細(xì)菌檢出結(jié)果的影響。

綜上所述，DUWLs污染問(wèn)題普遍存在，并且有感染的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)微生物污染的控制重點(diǎn)在于定期的檢測(cè)與有效的消毒，而選擇合適的檢測(cè)方式具有較大的臨床實(shí)踐意義。建議口腔診療機(jī)構(gòu)在定期檢測(cè)診療用水時(shí)應(yīng)常規(guī)采用貧營(yíng)養(yǎng)的R2A培養(yǎng)基，提高水生細(xì)菌的檢出率，且制定限值規(guī)范時(shí)應(yīng)參考不同地域臨床實(shí)際情況。由于本研究用于菌株鑒定的水樣均采集于經(jīng)低濃度含氯消毒液處理后的DUWLs，而甲基桿菌和鞘氨醇單胞菌均為耐氯菌株，其高檢出率也提示消毒DUWLs時(shí)應(yīng)考慮細(xì)菌對(duì)消毒劑的耐受性。