王爽 邱林 劉涵 孫曉倩 代曉華 張軍 劉浩

口腔癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤，其中口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)占比90%以上[1-2]，5 年生存率約50%左右，與其侵襲性強(qiáng)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高相關(guān)[3]。由于目前仍缺乏減少OSCC轉(zhuǎn)移的有效方法，故探究其相關(guān)轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要臨床意義。

據(jù)報(bào)道，慢性炎癥與OSCC發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)[4]，而NF-κB通路作為炎癥相關(guān)癌癥調(diào)控中的經(jīng)典通路，在包括OSCC在內(nèi)的多數(shù)癌癥中被異常激活[5]。該通路通過調(diào)控下游細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)來促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)，隨之產(chǎn)生許多促炎因子，因此建立一個(gè)調(diào)節(jié)環(huán)，有利于維持EMT表型[5]。盡管NF-κB通路已經(jīng)發(fā)現(xiàn)數(shù)十年，但在OSCC中的作用尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)使用人舌鱗癌細(xì)胞系SCC-15(天津市口腔功能重建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室存儲(chǔ))，用含10%胎牛血清(Gibco，美國)和1%雙抗溶液(北京Solarbio)的高糖DMEM，在37 ℃和5%CO2濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

預(yù)冷無血清DMEM按1∶3稀釋Matrigel，取100 μL Matrigel膠均勻鋪在Transwell小室內(nèi)，37 ℃孵育4 h至凝結(jié)成膠凍狀；設(shè)置20 μmol/L BAY11-7082預(yù)處理細(xì)胞1 h組、不預(yù)處理細(xì)胞組及PBS對(duì)照組，前兩組皆用1 μg/mL LPS刺激饑餓12 h以上的細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞。用無血清DMEM將收集的細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105/mL，上室加200 μL細(xì)胞懸液，下室加600 μL含20%血清的DMEM，培養(yǎng)24 h；棄小室中培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗2 次，DAPI室溫避光染色5 min，倒置熒光顯微鏡下觀察，每個(gè)小室隨機(jī)拍攝5 個(gè)視野并計(jì)數(shù)。

1.3 裂痕愈合實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞分組及處理同上，收集細(xì)胞后按7×104個(gè)細(xì)胞/孔接種到傷口愈合檢測(cè)皿(ibidi, 德國)中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后拔掉皿中自帶插件形成細(xì)胞鋪展面裂痕，換成無血清培養(yǎng)基，初始傷口寬度為500 μm(0 h)，細(xì)胞培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，PBS漂洗后用倒置熒光顯微鏡采集裂痕寬度圖像，Image J軟件測(cè)量傷口閉合面積。

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)

饑餓細(xì)胞12 h以上，用不同濃度的LPS處理細(xì)胞指定時(shí)間后收集細(xì)胞樣品，等體積PBS作為對(duì)照。在4 ℃下提取細(xì)胞蛋白，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。用SDS-PAGE預(yù)制膠分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶室溫封閉1 h；用IκBα、p65、p-p65、ZEB2(1∶500,Santa Cruz，California,USA)、Tubulin、E-cadherin、Vimentin(1∶1 000，上海，Beyotime)4 ℃搖床孵育過夜；1×TBS漂10 min共3 次，HRP標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠IgG室溫?fù)u床(1∶1 000,Beyotime)孵育1 h，1×TBS漂10min共3次?；瘜W(xué)發(fā)光試劑顯色后用Image Lab自動(dòng)凝膠分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)

饑餓細(xì)胞12 h以上，用1 μg/mL LPS處理不同時(shí)間段(0、0.5、1、2、3、4、5、6、8、16、24 h)后收集細(xì)胞，等體積PBS作為對(duì)照。提取細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄后經(jīng)Light Cycler/Light Cycler 480系統(tǒng)(羅氏，瑞士)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA表達(dá)相對(duì)倍數(shù)變化。引物(中國生工生物技術(shù))見表1。

表1 引物序列

1.6 免疫熒光染色

饑餓細(xì)胞12 h以上，用1 μg/mL LPS刺激8 h后收集細(xì)胞，等體積PBS作為對(duì)照。按8×104個(gè)細(xì)胞/孔接種到共聚焦小皿中過夜后4%多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗5 min共3 次；室溫封閉15 min；4 ℃中與p65抗體孵育過夜后PBS漂洗15 min，室溫下Cy3(紅色)偶聯(lián)熒光二抗(1∶200，Beyotime)避光染色1 h，PBS漂洗；DAPI避光染色5 min，PBS去浮色，倒置熒光顯微鏡對(duì)染色結(jié)果成像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 LPS激活SCC-15細(xì)胞NF-κB通路

SCC-15細(xì)胞經(jīng)1 μg/mL LPS處理0、0.5、1、2、4、8、16和24 h后，IκBα 蛋白表達(dá)量在4 h到8 h顯著降低(圖1A)；mRNA表達(dá)量在4～8 h顯著升高(P<0.05)，5 h時(shí)達(dá)到峰值，之后逐漸下降(圖1B)。結(jié)果提示，IκBα作為NF-κB通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，在LPS刺激SCC-15細(xì)胞4 h后蛋白表達(dá)水平降低，從而激活NF-κB通路；免疫熒光結(jié)果顯示，對(duì)照組中p65核中染色弱(紅色熒光)，而處理組p65核中染色強(qiáng)(圖1C)，LPS誘導(dǎo) p65從細(xì)胞質(zhì)向核轉(zhuǎn)運(yùn)。上述結(jié)果表明LPS成功誘導(dǎo)NF-κB通路活化。

圖1 LPS激活SCC-15細(xì)胞的NF-κB通路

2.2 NF-κB通路調(diào)控SCC-15細(xì)胞遷移和侵襲

傷口愈合實(shí)驗(yàn)顯示，相比對(duì)照組，SCC-15細(xì)胞遷移能力提高了1.785 倍(P<0.05,圖2A)；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，相比對(duì)照組，SCC-15細(xì)胞侵襲能力提高56.4%±7.2%(P<0.05,圖2B)。但NF-κB通路抑制劑BAY11-7082處理細(xì)胞后，相比LPS處理組，BAY11-7082組顯著降低SCC-15細(xì)胞的相對(duì)遷移面積(P<0.05,圖2C)以及穿膜細(xì)胞數(shù)量，平均每個(gè)視野中穿膜細(xì)胞數(shù)不足LPS組的1/4(P<0.05,圖2D)。結(jié)果表明，NF-κB通路活化促進(jìn)SCC-15細(xì)胞遷移和侵襲。

圖2 NF-κB通路調(diào)控SCC-15細(xì)胞遷移和侵襲

2.3 LPS上調(diào)SCC-15細(xì)胞中p65磷酸化蛋白及促炎因子

p65 mRNA表達(dá)水平在經(jīng)LPS刺激0、0.5、1、2、3、4、5、6、8、16和24 h后均無明顯變化(P>0.05, 圖3A)；而p65磷酸化蛋白表達(dá)水平分別呈LPS刺激時(shí)間和濃度依賴性，24 h達(dá)峰值，較對(duì)照組上調(diào)3.39 倍，0.1 μg/mL LPS 處理下即可顯著上調(diào)其磷酸化蛋白，1 μg/mL和10 μg/mL LPS處理時(shí)上調(diào)更為顯著(圖3B～3C)。這表明，NF-κB通路活性可能與SCC-15細(xì)胞中p65磷酸化蛋白水平相關(guān)。

通過RT-PCR檢測(cè)相同刺激條件下IL-6和COX-2 mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)相比對(duì)照組，處理組顯著性上調(diào)IL-6和COX-2 mRNA表達(dá)水平(P<0.05)。其中，IL-6在LPS處理0.5 h后達(dá)到峰值(3.71 倍)，隨后上調(diào)量逐漸減少，5 h后恢復(fù)至對(duì)照組水平(圖3D)；COX-2在LPS處理0.5 h后顯著上調(diào)，至5 h達(dá)到峰值(10.2 倍)，之后緩慢降低，24 h時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平(圖3E)。上述結(jié)果提示LPS促進(jìn)SCC-15細(xì)胞中促炎因子表達(dá)。

圖3 LPS上調(diào)SCC-15細(xì)胞中p65磷酸化蛋白及促炎因子

2.4 LPS促進(jìn)SCC-15細(xì)胞EMT

濃度為1 μg/mL以上的LPS處理SCC-15細(xì)胞24 h后，相比對(duì)照組，處理組上皮標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)顯著降低，而間充質(zhì)標(biāo)記物Vimentin和ZEB2表達(dá)水平顯著升高(P<0.05，圖4)，表明LPS促進(jìn)SCC-15細(xì)胞發(fā)生EMT。

圖4 LPS促進(jìn)SCC-15細(xì)胞EMT

3 討 論

目前已知NF-κB家族由5 個(gè)成員組成：RELA(p65)、RELB、c-REL、p50/p105(NF-κB1)和p52/p100(NF-κB2)，它們可以形成二聚物復(fù)合物。這些復(fù)合物被其抑制蛋白(IκBs)限制在胞質(zhì)中，可被各種刺激(如細(xì)胞因子、細(xì)菌感染等)激活易位至胞核，進(jìn)而激活下游促炎因子(如IL-6和COX-2等)[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，p65在胞核中明顯表達(dá)，且SCC-15細(xì)胞中IκBα mRNA在4～6 h再合成，蛋白在4～8 h顯著降解，這表明IκBα mRNA可翻譯成活性的IκBα蛋白，蛋白降解和再合成的量相當(dāng)，而在8 h后IκBα蛋白維持在對(duì)照組水平；同時(shí)p65(Ser311)磷酸化蛋白水平呈持續(xù)性上調(diào)，這說明NF-κB通路持續(xù)響應(yīng)LPS刺激而處于轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài)。

NF-κB是參與炎癥相關(guān)癌癥調(diào)節(jié)的中心信號(hào)通路，該通路的異?；罨軌蚣铀侔┌Y發(fā)展[7]。IL-6具有腫瘤生長(zhǎng)促進(jìn)作用，在OSCC中有明顯的高表達(dá)且與p65的表達(dá)呈正相關(guān)[8]。相比于正?？谇火つぃ琌SCC中COX-2高表達(dá)并與腫瘤局部復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；同時(shí)COX-2可上調(diào)細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGFC)，進(jìn)而促進(jìn)OSCC轉(zhuǎn)移[9-10]。在本研究中，LPS激活組中SCC-15細(xì)胞遷移和侵襲性較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，而用BAY11-7082抑制NF-κB通路后，細(xì)胞遷移和侵襲性明顯減弱，這表明NF-κB通路可能調(diào)節(jié)OSCC細(xì)胞遷移和侵襲。

惡性腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟過程[11]，其中通過EMT過程能使細(xì)胞間粘附喪失，同時(shí)能促進(jìn)遷移和侵襲所需的形態(tài)和行為轉(zhuǎn)化[12]。炎癥中的可溶性因子可以促進(jìn)癌細(xì)胞獲得EMT相關(guān)的運(yùn)動(dòng)性、侵襲性和降解細(xì)胞外基質(zhì)等特征[13]。在本研究中，經(jīng)LPS刺激，發(fā)現(xiàn)維持正常上皮細(xì)胞間粘附的E-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)，同時(shí)Vimentin和ZEB2表達(dá)顯著上調(diào)，由于Vimentin的高表達(dá)與OSCC轉(zhuǎn)移潛力增加相關(guān)[14]，且NF-κB可通過刺激轉(zhuǎn)錄因子ZEB2轉(zhuǎn)錄來抑制E-cadherin表達(dá)[15]，因此使得SCC-15細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移、侵襲潛能，表明激活的NF-κB通路可能通過調(diào)節(jié)EMT過程促進(jìn)OSCC遷移和侵襲。

總之，本文通過體外研究初步證實(shí)炎癥通路NF-κB可以調(diào)節(jié)EMT過程且促進(jìn)OSCC遷移和侵襲，為闡述NF-κB通路在OSCC中的作用提供部分實(shí)驗(yàn)證據(jù)。