金福榮, 霍喜月, 馮志彪, 萬洋, 姜瞻梅, 富天昕, 劉卜瑋, 田波

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院, 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院, 哈爾濱 150030）

0 引言

甲醛是一種有機(jī)化學(xué)物質(zhì), 有較強(qiáng)的毒性, 在我國有毒化學(xué)品優(yōu)先控制名單中列居第二位, 是潛在的強(qiáng)致突變物之一[1-5], 被世界衛(wèi)生組織確定為Ⅰ類致癌物[6], 過量攝入甲醛會(huì)對人體產(chǎn)生危害。以往我國允許甲醛在食品中應(yīng)用, 如《食品添加劑衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760-2007）[7]中允許甲醛作為食品加工助劑使用。2011年, 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760-2011）[8]將其刪除, 不再允許在食品中使用。

甲醛在食品中應(yīng)用可以起到防腐、增重等作用, 其主要被非法添加于水產(chǎn)品、乳肉及其制品、蔬菜中[9-10]。甲醛加入牛乳中可延長其保質(zhì)期[11], 因此曾有極少數(shù)不法分子將其加入牛乳中來防止牛乳腐敗變質(zhì)。目前對于乳中甲醛的研究主要集中在甲醛的檢測方法上[12-21], 即前處理方法與測定方式, 但是對生乳中甲醛的存在狀態(tài)的研究較少?；诖? 本文采用乙酰丙酮法系統(tǒng)研究了生乳中甲醛的存在狀態(tài)及其影響因素, 對生乳中甲醛的測定有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生乳, 哈爾濱市香坊區(qū)奶戶；甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液, 環(huán)境保護(hù)部標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所；冰乙酸, 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；乙酰丙酮, 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸銨, 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸, 天津永晟精細(xì)化工有限公司；乳糖, 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；干酪素, 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乳清蛋白, 大連美侖生物技術(shù)有限公司。

79-1磁力加熱攪拌器, 江蘇金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠；UV-6100型紫外可見分光光度計(jì)及AL204電子天平, 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；101-OA電熱恒溫干燥箱, 北京東聯(lián)哈爾儀器制造公司；TG16-WS高速臺(tái)式離心機(jī), 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫?cái)嚢杷″? 金壇市城東新瑞儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 游離態(tài)甲醛測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取適量生乳樣放置于超濾離心管中, 4 000 r/min離心30 min, 制得清液1。使用清液1配制甲醛濃度為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/L的甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液。

參照HJ 601-2011[22]配制乙酰丙酮溶液, 取11支具塞比色管, 依次加入2.0 mL上述配制的甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液和2.5 mL乙酰丙酮溶液, 定容至25 mL, 60℃水浴反應(yīng)15 min, 于413 nm下測定吸光度值, 甲醛濃度0 mg/L為空白對照, 測定3組平行值。以甲醛濃度為橫坐標(biāo), 吸光度為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 用于后續(xù)試驗(yàn)計(jì)算游離態(tài)甲醛的含量。

1.2.2 可逆結(jié)合態(tài)甲醛測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照李薇霞的方法[23], 配制濃度為10%的三氯乙酸（TCA）, 取適量生乳樣, 1∶2體積加入TCA, 5 000 r/min離心10 min, 制得清液2。使用清液2配制甲醛濃度為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/L的甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液。取11支具塞比色管, 參照1.2.1的步驟, 以甲醛濃度為橫坐標(biāo), 吸光度為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系曲線, 用于后續(xù)試驗(yàn)計(jì)算可逆結(jié)合態(tài)甲醛的含量。

1.2.3 乳中不同狀態(tài)甲醛含量的測定

以往報(bào)道涉及乳中甲醛的測定, 一般都是研究甲醛的測定方法, 沒有對乳中甲醛的存在狀態(tài)進(jìn)行分析, 一般是只測定游離態(tài)甲醛或測定游離態(tài)甲醛和可逆結(jié)合態(tài)甲醛之和[12-21,24-25]。本試驗(yàn)所用樣品均為乳外加甲醛所制得, 因此乳中總甲醛含量是已知的, 對乳中甲醛超濾離心測得的是其中的游離態(tài)甲醛, 而經(jīng)蛋白沉淀后離心后測得的是游離態(tài)甲醛與可逆結(jié)合態(tài)甲醛的總和。

有研究發(fā)現(xiàn)牛乳中含有極低量的內(nèi)源性甲醛[17]。在本試驗(yàn)所用的乳樣品中使用乙酰丙酮法未檢出甲醛, 故向其添加甲醛制得甲醛陽性乳樣, 該甲醛陽性乳樣的甲醛濃度為10 mg/L。

（1）游離態(tài)甲醛的測定。

取10.0 mL乳樣于超濾離心管中, 4 000 r/min離心30 min。取2.0 mL清液于25 mL具塞比色管中, 加入2.5 mL乙酰丙酮溶液, 定容, 混勻, 60℃水浴反應(yīng)15 min, 于413 nm下測定吸光度值, 根據(jù)1.2.1的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乳中的游離態(tài)甲醛含量。以不含甲醛的乳樣品為空白, 測定3組平行值。

（2）可逆結(jié)合態(tài)甲醛的測定。

取10.0 mL乳樣于離心管中, 加入10%TCA20.0 mL, 5 000 r/min離心10 min。取2.0 mL清液于25 mL具塞比色管中, 加入2.5 mL乙酰丙酮溶液, 定容, 混勻, 60℃水浴反應(yīng)15 min, 于413 nm下測定吸光度值, 根據(jù)1.2.2的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算甲醛含量, 此甲醛含量為可逆結(jié)合態(tài)甲醛和游離態(tài)甲醛含量之和, 可逆結(jié)合態(tài)甲醛含量=計(jì)算值-游離態(tài)甲醛含量。以不含甲醛的乳樣品為空白, 測定3組平行值。

（3）不可逆結(jié)合態(tài)甲醛的測定。

由于不可逆結(jié)合態(tài)甲醛無法測定, 以總甲醛含量減去游離態(tài)甲醛和可逆結(jié)合態(tài)甲醛計(jì)算所得為不可逆結(jié)合態(tài)甲醛的含量。

1.2.4 乳中甲醛存在狀態(tài)的影響因素

（1）溫度對乳中甲醛存在狀態(tài)的影響。

室溫（25℃）、冷藏（4℃）處理：配制甲醛濃度為10 mg/L的乳樣品, 于室溫和冷藏下放置1 h, 按照

1.2.3 方法測定樣品中不同狀態(tài)甲醛的含量。

加熱處理：取甲醛濃度10 mg/L乳樣品, 放置在具塞錐形瓶中, 分別在30、40、50、60、70、80、90、100℃水浴加熱1 h, 冷卻, 按照1.2.3方法分別測定經(jīng)加熱處理的樣品中不同狀態(tài)甲醛的含量。

（2）時(shí)間對乳中甲醛存在狀態(tài)的影響。

配制甲醛濃度為10 mg/L的乳樣品, 分別于室溫和冷藏下放置1、2、4、6、8、12、24 h；另取乳樣, 分別在40、70℃下水浴加熱20、40、60、80、100 min。根 據(jù)1.2.3的方法測定不同條件下、不同處理時(shí)間的乳樣中不同狀態(tài)甲醛的含量。

1.2.5 乳成分與甲醛的結(jié)合

（1）乳糖。

配制乳糖濃度為3%、甲醛濃度為10 mg/L的樣品, 取10.0 mL于室溫下放置1、4、8、12、24、36、48 h, 測定其中游離態(tài)甲醛含量, 計(jì)算結(jié)合態(tài)甲醛含量。

（2）乳蛋白。

配制酪蛋白濃度為2.4%、甲醛濃度為10 mg/L的樣品和乳清蛋白濃度為0.6%、甲醛濃度為10 mg/L的樣品, 分別取10.0 mL于室溫放置1、4、8、12、24、36、48 h, 測定其中游離態(tài)甲醛含量, 計(jì)算結(jié)合態(tài)甲醛含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品至少做3次平行實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用Origin 2021和SPSS Statistics 23.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖, 數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。通過配對T檢驗(yàn)和單因素方差分析比較組間數(shù)據(jù), 圖中不同的字母表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳中甲醛存在狀態(tài)的測定

乳中甲醛的狀態(tài)為游離態(tài)、可逆結(jié)合態(tài)和不可逆結(jié)合態(tài)。對牛乳樣品中的游離態(tài)甲醛通過超濾離心提取, 可逆結(jié)合態(tài)甲醛通過在牛乳樣品中加TCA沉淀蛋白提取, 乙酰丙酮法測定其中甲醛含量, 不可逆結(jié)合態(tài)甲醛的含量無法測定, 通過總甲醛含量減游離態(tài)和可逆結(jié)合態(tài)甲醛含量計(jì)算所得。結(jié)果見表1。

表1 牛乳中不同狀態(tài)甲醛含量

由表1可見, 在測定的乳樣中, 添加甲醛濃度為3.00～10.00 mg/mL。經(jīng)乙酰丙酮法測定其中游離態(tài)甲醛含量約占30%, 可逆結(jié)合態(tài)甲醛約占56.5%, 不可逆結(jié)合態(tài)甲醛約占13.5%, 結(jié)合態(tài)甲醛含量約占70%, 說明乳中甲醛主要以結(jié)合態(tài)形式存在, 這與對其他食品中甲醛的存在方式研究相吻合[26-28]。同時(shí)發(fā)現(xiàn), 游離態(tài)與可逆結(jié)合態(tài)甲醛的總量為87%左右, 不可逆結(jié)合態(tài)無法檢測, 即本法回收率為87%, 而陳靜等人用HPLC法檢測乳甲醛時(shí)發(fā)現(xiàn)甲醛的回收率約為87%[13], 二者結(jié)果一致。

2.2 乳中甲醛存在狀態(tài)的影響因素

2.2.1 溫度對乳中甲醛存在狀態(tài)的影響

分別對牛乳進(jìn)行不同溫度處理, 測定不同態(tài)甲醛含量, 并記錄數(shù)據(jù), 結(jié)果見表2、圖1。

表2 溫度對甲醛狀態(tài)的影響

圖1 不同加熱溫度對甲醛狀態(tài)的影響

由表2可知, 在室溫和冷藏狀態(tài)下, 乳中甲醛存在狀態(tài)無明顯變化（配對T檢驗(yàn)的P＞0.05）, 游離態(tài)甲醛含量穩(wěn)定在30%左右, 可逆結(jié)合態(tài)甲醛約占56%, 結(jié)合態(tài)甲醛含量為70%左右。但將乳樣進(jìn)行水浴加熱時(shí), 乳中甲醛狀態(tài)有明顯變化。如圖1所示, 熱處理會(huì)明顯影響甲醛的存在狀態(tài)（單因素oneway-ANOVA的P＜0.05）。在加熱溫度30～100℃, 隨溫度的升高, 乳中游離態(tài)甲醛含量由31.89%增加至51.57%, 可逆結(jié)合態(tài)甲醛含量由56.62%減少至39.87%；其中在溫度為40℃與70℃時(shí), 游離態(tài)甲醛和可逆結(jié)合態(tài)甲醛的含量變化比較顯著, 在水浴溫度40℃時(shí), 游離態(tài)甲醛檢出量增至37.35%, 可逆結(jié)合態(tài)甲醛含量減至52.06%；在水浴溫度為70℃時(shí), 游離態(tài)甲醛的含量高于可逆結(jié)合態(tài)甲醛達(dá)到48.58%。經(jīng)計(jì)算, 加熱后不可逆態(tài)甲醛占比由13%下降到9%左右。熱處理對甲醛的存在狀態(tài)的影響可能是由于加熱使部分結(jié)合態(tài)甲醛的結(jié)合鍵斷裂或產(chǎn)生新的甲醛所致[24]。若用超濾離心處理乳樣品測定甲醛含量時(shí)需要考慮樣品加熱處理的影響, TCA沉淀乳蛋白測得的是游離態(tài)與可逆結(jié)合態(tài)甲醛含量的總和, 可不考慮樣品的加熱處理, 對檢測結(jié)果的影響不大。

2.2.2 時(shí)間對乳中甲醛存在狀態(tài)的影響

結(jié)合2.2.1的條件設(shè)置, 在不同溫度下放置不同時(shí)間后測定乳樣中的游離態(tài)和可逆結(jié)合態(tài)甲醛含量, 結(jié)果見圖2。

由圖2（a)可知, 在室溫和冷藏條件下, 乳中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)甲醛含量隨時(shí)間延長無明顯變化。在24 h內(nèi)對不同狀態(tài)甲醛含量進(jìn)行檢測, 游離態(tài)甲醛含量為28.80%～31.06%, 可逆結(jié)合態(tài)甲醛含量為56.52%～57.45%, 這說明室溫和冷藏條件下乳中甲醛的存在狀態(tài)比較穩(wěn)定。由圖2（b)可知, 對乳樣進(jìn)行水浴加熱時(shí), 隨著時(shí)間變化乳中甲醛狀態(tài)有明顯變化。在加熱溫度為40℃時(shí), 隨水浴加熱時(shí)間的延長, 游離態(tài)甲醛含量由34.05%增多至40.44%, 可逆結(jié)合態(tài)甲醛含量隨之相應(yīng)減少至51.21%。經(jīng)過100 min的加熱后, 甲醛狀態(tài)仍不穩(wěn)定, 但由于繼續(xù)加熱乳樣會(huì)產(chǎn)生其它顯色反應(yīng), 干擾甲醛的測定, 因此不再進(jìn)行檢測。在溫度為70℃時(shí), 甲醛狀態(tài)隨時(shí)間的變化較40℃更為明顯, 在加熱至80 min后, 乳中甲醛狀態(tài)基本保持不變, 其中游離態(tài)甲醛50.13%, 可逆結(jié)合態(tài)甲醛41.94%, 這可能與乳成分與甲醛的結(jié)合相關(guān)。

圖2 不同時(shí)間對甲醛狀態(tài)的影響

2.3 乳成分與甲醛的結(jié)合

乳糖和蛋白質(zhì)是主要的乳成分, 分別配制與乳中乳糖、酪蛋白、乳清蛋白含量相同的溶液, 加入甲醛, 于室溫下放置1、4、8、12、24、36、48 h后, 乙酰丙酮法測定游離態(tài)甲醛的含量, 計(jì)算結(jié)合態(tài)甲醛含量, 結(jié)果見圖3、圖4。

圖4 乳蛋白與甲醛結(jié)合的程度

牛乳蛋白主要由酪蛋白和乳清蛋白組成, 其中乳清蛋白包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白以及其他幾種微量蛋白。甲醛等醛類物質(zhì)含有羰基極性基團(tuán), 可與氨基、羥基等多數(shù)基團(tuán)進(jìn)行結(jié)合。由圖3、4可見, 與乳糖結(jié)合的甲醛占比4.02%～4.43%, 隨著時(shí)間變化, 甲醛狀態(tài)幾乎不變。這說明在模擬的乳糖-甲醛體系中, 大部分甲醛以游離態(tài)形式存在, 即甲醛和乳糖結(jié)合極少。酪蛋白與甲醛的結(jié)合程度為45.75%～45.96%, 隨著時(shí)間的延長, 結(jié)合狀態(tài)較穩(wěn)定；乳清蛋白與甲醛的結(jié)合程度14.22%～14.63%, 隨著時(shí)間的延長, 結(jié)合狀態(tài)亦沒有明顯變化。乳蛋白富含羥基、氨基等, 暴露在甲醛中會(huì)立即反應(yīng), 形成甲醛-蛋白質(zhì)復(fù)合物, 而熱處理會(huì)破壞甲醛和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合鍵或者產(chǎn)生新的甲醛[29-30]。有研究表明酪蛋白有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性, 一般的熱處理不會(huì)導(dǎo)致其變性。乳清蛋白的熱穩(wěn)定性差, 40℃的熱處理即可使其開始變性[29]。經(jīng)40℃熱處理后乳中游離態(tài)甲醛含量增加, 這可能是由于乳清蛋白在40℃時(shí)開始變性, 甲醛與之結(jié)合的鍵隨之?dāng)嗔? 也可能是由于與甲醛結(jié)合的其他物質(zhì)熱穩(wěn)定性較差, 在此溫度下出現(xiàn)變性[30]。當(dāng)熱處理溫度為70℃時(shí), 游離態(tài)甲醛比例更大, 可能是由于乳清蛋白或其他與甲醛結(jié)合的物質(zhì)變性速度迅速加快, 使得更多可逆結(jié)合態(tài)甲醛轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)。

圖3 乳糖與甲醛結(jié)合的程度

3 結(jié)論

（1）甲醛在乳中有游離態(tài)和結(jié)合態(tài)（包括可逆結(jié)合態(tài)與非可逆結(jié)合態(tài)）兩種存在方式, 游離態(tài)甲醛含量約占30%, 可逆結(jié)合態(tài)甲醛約占56.5%, 不可逆結(jié)合態(tài)甲醛約占13.5%, 結(jié)合態(tài)甲醛含量約占70%, 說明乳中甲醛主要以結(jié)合態(tài)形式存在。

（2）溫度會(huì)影響乳中甲醛的存在狀態(tài), 未經(jīng)任何熱處理或經(jīng)冷藏的牛乳樣品中游離態(tài)甲醛的含量為28.7%～31%, 室溫(25℃)與冷藏條件（4℃）下, 乳中甲醛存在狀態(tài)無明顯變化, 游離態(tài)甲醛含量穩(wěn)定在28.80%～31.06%, 可逆結(jié)合態(tài)甲醛約占56.52%～57.45%；加熱溫度由30℃上升到100℃甲醛的存在狀態(tài)有顯著變化, 使游離態(tài)甲醛從37.35%上升到51.57%, 可逆結(jié)合態(tài)甲醛含量由52.06%降低到39.87%。不同溫度下, 時(shí)間對甲醛存在狀態(tài)影響不一。室溫(25℃)與冷藏條件（4℃）下, 乳中甲醛的存在狀態(tài)比較穩(wěn)定, 反應(yīng)時(shí)間延長也未有明顯變化。在加熱溫度為30～100℃時(shí), 隨加熱時(shí)間的延長, 乳中游離態(tài)甲醛含量由31.89%增加至51.57%, 可逆結(jié)合態(tài)甲醛含量由56.62%減少至39.87%, 其中在加熱溫度為40℃及70℃時(shí), 甲醛狀態(tài)隨時(shí)間的變化尤為顯著。乳成分對甲醛存在狀態(tài)也有影響, 主要是乳蛋白與甲醛結(jié)合, 其中與酪蛋白結(jié)合占45.75%～45.96%, 與乳清蛋白結(jié)合占14.22%～14.63%。